PLoS ONE: En Genome Wide RNAi Screen Identificerer FOXO4 som Metastase-Suppressor gennem modvirkning PI3K /AKT Signal Pathway i prostata Cancer

Abstrakt

Aktivering af PI3K /AKT-signal vej er en kendt drivkraft for progression til kastration-tilbagevendende prostatacancer (CR-CaP), som udgør den største dødelige fænotype af CaP. Her identificerer vi anvendelse af en genomisk skærm shRNA PI3K /AKT-inaktiverende nedstrømsmål, FOXO4, som en potentiel CaP metastase lyddæmper. FOXO4 protein niveauer omvendt forhold med det invasive potentiale af et panel af humane CaP-cellelinjer, med nedsat mRNA-niveauer korrelerer med øget forekomst af klinisk metastase. Knockdown (KD) af FOXO4 i humane LNCaP celler medfører øget invasion

in vitro

og lymfeknude (LN) metastaser

in vivo

uden at påvirke indekser for proliferation eller apoptose. Øget Matrigel invasionsevne blev fundet af KD for FOXO1 men ikke FOXO3. Sammenligning af differentielt udtrykte gener, der berøres af FOXO4-KD i LNCaP celler i kultur, i primære tumorer og i LN metastaser identificeret et panel af opreguleret gener, herunder PIP, CAMK2N1, PLA2G16 og PGC, som, hvis slået ned af siRNA, kunne mindske øget invasionsevne forbundet med FOXO4 mangel. Selv om kun nogle af disse gener koder FOXO promotoren bindingssteder, de er alle RUNX2-inducerbar, og RUNX2 binding til PIP-promotoren er forøget i FOXO4-KD-celler. Faktisk tvungen udtryk for FOXO4 vendt øget invasionsevne af LNCaP /shFOXO4 celler; tvungen ekspression af FOXO4 ændrede ikke RUNX2 proteinniveauer, men det faldt RUNX2 binding til PIP-promotoren, resulterer i PIP nedregulering. Endelig var der en sammenhæng mellem FOXO4, men ikke FOXO1 eller FOXO3, nedregulering og nedsat metastase overlevelse i humane CaP patienter. Vores data tyder på, at øget Pl3K /AKT-medieret metastatisk invasiv i CaP er forbundet med FOXO4 tab, og at mekanismer til at fremkalde FOXO4 re-udtryk kan undertrykke CaP metastatisk aggressivitet

Henvisning:. Su B, Gao L, Baranowski C, Gillard B, Wang J, Ransom R, et al. (2014) En genom-Wide RNAi Screen Identificerer FOXO4 som Metastase-Suppressor gennem modvirkning PI3K /AKT Signal Pathway i prostatakræft. PLoS ONE 9 (7): e101411. doi: 10,1371 /journal.pone.0101411

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: 14. april, 2014 Accepteret: 5 juni 2014; Udgivet: Juli 1, 2014

Copyright: © 2014 Su et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Microarray data er blevet deponeret på Gene Expression Omnibus under tiltrædelsen nummer GSE58403

Finansiering:. IHG blev støttet af Department of Defense, (www.army.mil) giver PC040256 og PC061246, National Cancer Institute (www.cancer .gov) giver CA94108 (IHG), og National Cancer center Support Grant 2P30 CA016056. BS blev støttet af National Natural Science Foundation of China No. 81272380. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Prostatakræft (CaP) er fortsat den mest diagnosticeret non-kutant kræft og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald i amerikanske mænd [1]. De indledende faser af CaP er reguleret af androgen, hvilket har androgen afsavn terapi været grundpillen i behandling for progressiv prostatakræft. De fleste patienter uundgåeligt mislykkes denne behandling, udvikler sig til kastration-tilbagevendende prostatacancer (CR-CaP) typisk viser sig som knogle eller lymfeknudemetastaser, hvis vækst er afhængig af vedvarende androgen receptor (AR) signalering [2]. Faktisk har målretningen af ​​CR-CaP med mere specifikke anti-androgener eller AR antagonister tilbydes betydningsfulde, men forbigående, klinisk effekt, og modstanden stadig involverer AR afhængighed, omend der involverer AR mutanter eller overekspression [3] – [5].

Aktivering af phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /AKT-vejen er en stor bidragyder til Cap progression [6], [7] i, at 42% af de primære CaP læsioner og 100% af metastatiske tumorer udviser forandringer (mutationer /sletninger, kopi nummer variationer, differential genekspression) i en eller flere komponenter [8]. Dette har ført til en række kliniske undersøgelser rettet mod P 3K, AKT eller TORC1 i kombination med standard kemoterapi (taxaner, Platins) eller antagonister af androgen akse eller AR [6]. Faktisk prostata-specifikke tab af PI3K /AKT antagonist, PTEN, i mus transgene modeller er tilstrækkelig til at inducere intraepitelialneoplasi [9], [10].

FOXO familiemedlemmer, FOXO1, FOXO3a og FOXO4 er ubikvitært udtrykt transkriptionsfaktorer, der fungerer som tumorsuppressor proteiner via deres evne til at repressere ekspressionen af ​​gener, der koder proliferativ, overlevelse eller anti-differentieringsfaktorer funktioner [11], [12]. Roller for FOXO medlemmer undertrykke prostatacancer progression er blevet beskrevet. For eksempel er FOXO1 deletion i 13q14 forbundet med androgen- og AR-uafhængige proliferation [13]. AKT, hvis aktivitet stiger i CaP progression [7], phosphorylerer direkte FOXO familiemedlemmer, derved at modvirke deres funktion ved at fremme samarbejde med 14-3-3 proteiner og forhindre deres nukleare translokation [14], hvilket fører til deres ubiquitylering-medieret proteasom nedbrydning [ ,,,0],15]. Tabet af FOXO3a fremmer kræft dannelse i TRAMP prostatakræft musemodel [16], mens opregulering eller aktivering af FOXO proteiner fører til vækst og apoptose [17] – [19]. En undersøgelse af Zhang et al. [20] viser, at FOXO1 hæmmer CaP celle motilitet og invasionsevne ved at forhindre RUNX2 at binde sig til og transskriptionelt aktivere progression gener såsom

OP, IL8, VEGF

og

MMP13

. Selv om nogle overflødige roller for FOXO proteiner underforstået ved konstateringen af, at spontane thymiske lymfomer og systemiske hemangiomas induceres kun efter den kombinerede sletning af FOXO1, FOXO3 og FOXO4 [21], er der tegn fra kromatin immunofældning-sekventering (chip-seq) undersøgelser på FOXO1 og FOXO3a af både fælles og ikke-overlappende gen mål [22], [23]. For prostatakræft progression, de fælles eller adskilte roller for FOXO proteiner forbliver uklart.

For at identificere gener, der modvirker CaP metastase, humane LNCaP celler, som udviser svag invasiv, blev inficeret med en lentivirus-kodet genomisk shRNA bibliotek og derefter udvalgt til stærkt invasive celler i en Matrigel-coated Boyden kammer assay. Vores data tyder på, at FOXO4 undertrykker metastatisk invasiv ved at forhindre RUNX2 i at aktivere en gruppe pro-metastatiske gener, herunder

PIP, PGC, CAMK2N1

og

PLA2G16

. Konstateringen af, at FOXO4 nedregulering korrelerer med tidligere debut metastatisk sygdom i Cap patienter antyder stærkt, at CaP metastase kan modvirkes ved at genaktivere FOXO4 udtryk eller ved at hæmme RUNX2 funktion.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser Salg

følgende primære antistoffer (Ab) blev anvendt: kanin polyklonale specifikke for FOXO1, FOXO3, FOXO4, kløvet caspase-3, GFP (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); mus monoklonale antistoffer (Mab) omfatter HA, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Myc (Applied Biological Materials, Richmond, BC, Canada), og Ki67 (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL).

Cellekultur

LNCaP (ATCC CRL-1740) og CWR22Rv1 (ATCC CRL 2505) -celler blev dyrket i RPMI1640 medium suppleret med 10% FBS og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2. DU145 (ATCC HTB-81) og HEK293T (ATCC CRL-3216) celler blev dyrket i DMEM-medium suppleret med 10% FBS. LNCaP blev inficeret med portioner af DECODE (OpenBiosystems) samlede pGIPZ lentivirus bibliotek koder humant genomisk shRNAs (13.650 gener målrettet i 7 puljer af 9.750 shRNA kloner /pool) på en mangfoldighed-of-infektion af en (RPCI shRNA Core, Irwin Gelman, direktør), og derefter udvalgt til puromycin (2: g /ml) resistens. Puromycin-resistente celler inficeret med tomme pGIPZ alene tjente som en negativ kontrol.

siRNA transfektion

Syntetisk ON-TARGETplus SMARTpool siRNA specifik for FOXO4, FOXO1 og FOXO3, siCONTROL nonsilence siRNA (NS-siRNA ), og DHarmaFECT-1 transfektionsreagens blev indkøbt fra Dharmacon (Lafayette, CO). LNCaP-celler blev udpladet ved lige densiteter i 6-brønds plader (5 × 10

4 per brønd) natten over. Celler blev transficeret med 50 nM NS-siRNA eller FOXO-specifikke siRNA i 24 timer ved hjælp DharmaFECT1 efter producentens protokol.

MTS cellevækst assay

Udbredelsen af ​​LNCaP celler, der stabilt inficeret med pGIPZ -FOXO4 shRNA eller pGIPZ-NS-shRNA eller forbigående transficeret med FOXO4- eller NS-siRNA blev vurderet ved anvendelse MTS assay (Promega, Madison, WI) ved at følge fabrikantens protokol. MTS assay måler genoprettelse af 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) til formazan ved metabolisk aktive celler.

Immunoblot (IB) analyse

Celler blev lyseret i RIPA-buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 8% glycerol, 1% Triton X-100, 0,1 % SDS, 0,5% natriumdeoxycholat, 10 mM Na

3VO4, 1 mM NaF, Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland)). 40 ug totalt protein /prøve blev separeret ved SDS-PAGE, blottet på polyvinylidenfluorid membraner, som blev blokeret i 30 min med 5% bovint serumalbumin (Sigma) i 1 × TBS /T (0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvand ) og derefter probet som angivet. Digital billedbehandling og signal kvantificering blev udført på en Chemi-Genius

2 Bio-Imager (Syngene, Frederick, MD) ved hjælp GeneTools software.

Transient transfektion

pFOXO4-GFP eller pFOXO4- TM-GFP, med Ala substitutioner i alle tre AKT phosphoryleringssteder (venligt leveret af Stefanie Dimmeler, University Frankfurt am Main, Tyskland) blev kortvarigt transficeret ind CWR22Rv1. Myc-wtFOXO4 plasmid (venligst tilvejebragt af Zhiping Liu, UT Southwestern Medical Center) blev cotransficeret transient med pEGFP DNA (Clontech /Takara, Mountainview, CA) ind CWR22Rv1 celler under anvendelse af Lipofectamine reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens anbefalinger, og derefter inkuberet i 40 timer. GFP-positive celler blev scoret for invasion og

in situ

zymografi. For CHIP-qPCR analysen blev HEK293T celler kortvarigt transficeret med HA-RUNX2 (venligst stillet til rådighed af Jianmin Zhang, Roswell Park Cancer Institute), HA-RUNX2 plus Myc-FOXO4 eller tom vektor.

Invasion assay og udvælgelse af invasive kloner

Modified Boyden kammer assays blev udført som tidligere beskrevet [24] startende med 5 × 10

4 celler /5-brønds format. Værdier for migration blev opnået ved at tælle mindst 10 celler i 6 felter pr membran (x20 objektiv) og gennemsnittet for tre uafhængige forsøg. Celler med forøget Matrigel invasionsevne blev isoleret efter fire runder af successive invasion assays. Specifikt blev invaderende celler (klæbet til bunden af ​​transwell membraner) fjernet ved trypsinisering, samlet baseret på shRNA moduler, udpladet i 6-brønds skåle, og efter udvidelse, re-underkastet invasion assays. Efter tre runder blev celler udpladet tyndt i 10 cm skåle, og efter proliferation og koloni isolation, stregkoder var Sanger sekventeret (RPCI Genomics delte ressource Core, Irwin Gelman-direktør) fra isolerede DNA under anvendelse flankerende PCR primerpar, F: 5 ‘ – ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3 ‘og R: 5′-AAGCAGCGTATCCACATAGCGT-3′ eller ved hjælp af direkte sekventering primer, 5’-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 ‘. LNCaP [vektor] eller LNCaP [shFOXO4] celler forbigående transficeret med 1: g hver af pGIPZ lentivirus shRNA kloner (GFP-udtrykkende) specifikke for PIP (tiltrædelse # NM_002652.2, kloner V2LHS170040 og V2LHS170041), CAMK2N1 (tiltrædelse # NM_018584.5 , kloner V2HS176164, V2HS176163, V2HS176165), PLA2G16 (tiltrædelse # NM_007069.3, clonesV2LHS_253144, V2HS199589), PGC (tiltrædelse # NM_002630.3, klon V2LHS169912) eller RUNX2 (tiltrædelse # NM_004348, kloner V2LHS3151, V2LHS15062, V2LHS15065, V2LHS15066, V2LHS223856 , V2LHS 224.628), eller tomme pGIPZ vektor kontrol (OpenBiosystems) blev vurderet for invasive potentiale.

In situ

zymografi

glas dækglas blev belagt med 0,2 mg /ml Oregon grøn 488-konjugeret gelatine, tværbundet i 0,5% glutaraldehyd i 15 minutter ved 4 ° C, og inkuberet med 5 mg /ml NaBH

4 i 3 min. Dækglassene blev derpå desinficeret med 70% EtOH i 15 minutter og vasket i serumfrit medie i 1 time ved 37 ° C. Cellerne blev udpladet på overtrukne dækglas og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer, fikseret i 10 minutter med iskold 60% acetone /3,7% paraformaldehyd i PBS, blokeret med 3% fedtfri tørmælk i PBS i 30 min ved stuetemperatur. Myc-FOXO4 blev farvet med muse-anti-myc (1:500), og kerner blev farvet med DAPI (Invitrogen, 1:500) efterfulgt af FITC-konjugeret ged anti-mus IgG (1:500; Chemicon, Temecula, CA ). Fluorescerende billeder blev taget med et Nikon TE2000-E omvendt mikroskop udstyret med Roper CoolSnap HQ CCD-kamera. Invasionsevne blev kvantificeret ved at måle det gennemsnitlige tab af FITC-gelatine område i tredobbelte dias

ortotopisk metastase model

ortotopisk prostata injektioner i dorsale kamre af 10

6 celler i 50:. L PBS i mandlige nøgne mus indbygget i deres flanker med testosteron-pellets blev udført som tidligere beskrevet [25]. Efter 10 uger blev musene aflivet og undersøgt for GFP-fluorescens (Lightools Research, Encinitas, CA) i primære tumorer og i perifere organer. Alle eksperimenter dyr blev udført under tilsyn af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Roswell Park Cancer Institute under godkendte protokol 1177M. Anæstesi blev inhaleret halothan til virkning. Eutanasi blev udført ved CO2-kvælning efterfulgt af cervikal dislokation.

Immunhistokemi (IHC)

Væv blev fikseret i 10% pufret formalin i 24 timer inden behandling. Fikserede væv blev indlejret i paraffin og snittet ved 5: m. Objektglas blev de-parafinized i xylener og derefter rehydreret i graduerede alkoholer efterfulgt af Hedeselskabet

2O. Slides blev inkuberet i 1 x pH 6 citratbuffer (Invitrogen Cat # 00-5000) i 20 minutter og derefter i 3% H

2O

2 i 15 min. Objektglas blev blokeret med 10% normalt gedeserum i 30 minutter, efterfulgt af avidin /biotin-blok (Vector Labs Cat # SP-2001). Primære Abs til Ki67 (1:500), GFP (1:50) eller caspase 3 (1:200) blev fortyndet i 1% BSA-opløsning og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur (RT), efterfulgt af inkubation med biotinyleret gede anti -rabbit sekundær Ab (Cell Signaling Cat # 9661) i 15 min. For signal ekstraudstyr, blev ABC-reagens (Vector Labs Cat #PK 6100) anvendt i 30 min, efterfulgt af inkubation med DAB substrat (Dako Cat # K3467) i 5 minutter og modfarvning med modificeret Harris Hematoxylin (Richard-Allan Scientific Cat # 72.704) i 20 sekunder. Objektglas blev vasket grundigt i PBS, forseglet med dækglas og scannet i en Aperio ScanScope CS, hjælp ImageScope software (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).

Gen-ekspression vifte

Total RNA blev fremstillet under anvendelse af Trizol (Invitrogen) ved at følge producentens instruktioner fra seks prøver: LNCaP [shFOXO4] cellelinie, LNCaP [pGIPZ kontrol] cellelinie, LNCaP [shFOXO4] primær tumor, LNCaP [pGIPZ kontrol] primær tumor, LNCaP [shFOXO4] lymfeknude metastase og LNCaP [pGIPZ kontrol] lymfeknudemetastase. RNA-prøver blev kvantificeret ved anvendelse af et ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific /NanoDrop) og vurderet for nedbrydning ved anvendelse af en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Prøver med RNA Integrity Value (RIN) 7 blev forarbejdet til genekspression array analyse anvendelse af den humane HT-12 hel-genom-genekspression beadchip array (v4) (Illumina, San Diego, CA). 500 ng totalt RNA blev omdannet til cDNA efterfulgt af

in vitro

transkription til at generere biotinmærkede cRNA ved anvendelse af Ambion Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion /Life Technologies, Grand Island, NY) i henhold til producentens anvisninger. 750 ng af de mærkede prober blev derefter blandet med hybridiseringsbetingelser reagenser og hybridiseret natten over ved 58 ° C til HT-12v4 BeadChips. Efter vask og farvning med Cy3-streptavidin konjugat blev BeadChips filmede med en Illumina iScan Reader for at måle fluorescensintensiteten ved hver probe. Intensiteten af ​​signalet svarer til den mængde af det respektive mRNA i den oprindelige prøve. BeadChip datafiler blev analyseret med GenomeStudio (v2011.1, Illumina) genekspression modul (v1.9.0) at rapportere både un-normaliserede og fraktil normaliserede, baggrund-korrigeret genekspression signal niveauer. Genekspression signalniveauer blev derefter analyseret under anvendelse af BioConductor pakker Lumi og Limma programmer (https://www.bioconductor.org). Gener med . Blev identificeret to-fold udtryk ændringer

Kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA (1 pg /reaktion) isoleret ved hjælp Trizol Reagens blev udsat for revers transkription reaktioner med tilfældige hexamerprimere ved hjælp af High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies /Applied Biosystems). QRT-PCR blev udført på en 7900HT Sequence Detection systemet (Life Technologies /Applied Biosystems) under anvendelse FastStart Universal SYBR Green Master kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ifølge producentens instruktioner. De primer sekvenser (tabel S2) blev designet ved hjælp Primer -BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). GAPDH blev anvendt som en husholdning gen for QRT-PCR-reaktioner. Hver test blev udført i tredobbelt replikation og 2

-ΔΔCt metode [26] blev anvendt til at beregne ekspression af gener.

Co-immunopræcipitation (Co-IP) i FOXO4 og RUNX2

HEK293T celler blev co-transficeret med Myc-FOXO4 plus HA-RUNX2, HA-RUNX2 alene eller tom vektor alene. Efter 48 timer blev celler lyseret i RIPA-buffer og IP blev udført under anvendelse HA Ab, efterfulgt af IB med den angivne Ab, eller IP blev udført under anvendelse Myc Ab, efterfulgt af IB

chromatin immunoprecipitation (chip). – qPCR

chip assays blev udført som tidligere beskrevet (9) med mindre modifikationer. Kort fortalt, LNCaP og HEK93T celler dyrket i 10 cm skåle (80-90% konfluens) blev tværbundet ved tilsætning af 10% formaldehyd til dyrkningsmedier til 6-7 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af tilsætning af glycin til 125 mM. Kromatin blev sonikeret for at give 100-300 bp fragmenter i SDS-lysepuffer (0,1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 2% NP-40, 0,5% deoxycholat, pH 8,1) indeholdende 1 mM phenylmethansulfonyl fluorid og proteaseinhibitor-blanding. (Roche Applied Science) Efter præ-clearing med protein A /G magnetiske perler (Millipore), chromatin blev inkuberet natten over ved 4 ° C med 5 ug af følgende Ab som angivet: HA, RUNX2, eller normalt muse-IgG. Immunkomplekser blev trukket ned med protein A /G magnetiske perler. Tværbindinger for både chip og indført DNA blev vendt ved 65 ° C i 5 timer og proteiner blev fordøjet med proteinase K, og DNA’et blev indvundet ved phenol /chloroformekstraktion og ethanolpræcipitation med 20 ug glycogen som bærer som beskrevet [27]. Udfældede fragmenter blev kvantificeret ved qPCR, og procentdelen input værdier blev korrigeret for negative kontrol regioner, hvor der er angivet. Primere til PCR-amplifikation af PIP som tidligere beskrevet [28].

statistiske analyser

Statistiske betydninger mellem grupper blev bestemt ved to-tailed t-test, med fejlsøjler der betyder S.E.M. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

En genom-wide screen shRNA at identificere kandidat metastase suppressor gener

For at forstå de genetiske komponenter. nødvendige for metastase, anvendte vi en høj produktion shRNA screening tilgang til at identificere gener, der kan undertrykke Matrigel invasivitet, en parameter for den metastatiske kaskade [29]. LNCaP-celler, som udviser lav invasiv potentiale [30], blev inficeret med moduler af pGIPZ (GFP-udtrykkende) lentivira kodende moduler af humane genomiske shRNAs ved en MOI = 0,7 (for at minimere celler transduceret med flere shRNAs), og efter selektion for puromycin modstand, blev celler udsat til tredobbelte Matrigel Boyden kammer invasion assays. Invaderende celler (der klæber til bunden af ​​transbrøndene membraner) blev fjernet ved trypsinisering, samlet mellem triplo, ekspanderes i kultur og derefter underkastet to yderligere runder af lignende invasion assays. LNCaP inficeret med tomme pGIPZ (LNCaP [vektor] celler) blev kørt parallelt at vurdere enhver udvalg af spontan stigning i invasiv (fig. 1A). Vi antog, at celler med stigende invasionsevne følge af et tab af en suppressorfunktion ville blive beriget med successive assay runder. Efter tre cyklusser af selektion blev kolonier isoleret fra moduler 2, 3, 6 og 7, som viste stigende invasionsevne forhold til Runde 3 niveau af LNCaP [Vector] kontroller (fig. 1B). Sekvensanalyse (stregkode og shRNA sekvens) og BLAST databank søgning (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) identificerede flere kloner af forkhead box O4 (

FOXO4

), kinesin familiemedlem 3B (

KIF3B

), signaltransducerende adapter molekyle (SH3 domæne og ITAM motiv) 1 (

STAM

), og Homo sapiens solut luftfartsselskab familie 17 (

SLC17A4

) (tabel S1), der tilsammen tegner 94% af alle de kloner sekventeret. I betragtning af den voksende forstå for roller for FOXO proteiner som negative regulatorer af kræft progression [31], [32], og en nylig undersøgelse, der viser, at opregulering af ANXA8 ved FOXO4 hæmmer cellens vandrende og metastatiske karakteristika cholangiocarcinoma celler [33], vi fokuseret på mulige rolle FOXO4 som en potentiel metastaser lyddæmper.

a. Skematisk oversigt over skærmen. En høj-throughput screening shRNA fremgangsmåde blev anvendt til at identificere gener, hvis knockdown induceret tumor invasion, en fremgangsmåde afgørende for metastase. Stærkt invasive varianter af LNCaP blev udvalgt under anvendelse Matrigelcoatede Boyden kammer invasion assays. B. Øget invasionsevne fremkaldt af puljer af shRNA kloner over 3 runder af selektion.

Overpanel

: repræsentative billeder af invasive GFP-udtrykkende celler fra kontrol (pGIPZ vektor) eller shRNA (portion # 2) efter tre udvælgelsesrunder.

Underpanel

:. Invasive potentiale af samlede celler i hver af 7 infektion moduler over tre udvælgelsesrunder, sammenlignet med LNCaP [vektor] celler

Nedregulering af FOXO4 i humant metastatisk CaP cellelinjer og metastatiske væv

for at teste, om FOXO4 genekspression korrelerer med CaP celle invasiv, vi først sammenlignet FOXO4 proteinekspression i et panel Cap cellelinjer med forskellige invasive og metastatiske potentialer. Der var en omvendt korrelation mellem Matrigel invasiv og FOXO4 protein niveauer (fig. 2A), især når man sammenligner LNCaP til to metastatiske varianter, LN3 og c4-2. En søgning af Oncomine database (https://www.oncomine.org) viste, at FOXO4 var signifikant nedreguleret i metastatisk CaP forhold til primær-site cancer og /eller normale prøver fra to individuelle undersøgelser (figur 2B). Endvidere analyse af metastatiske CaP-tilfælde fra studiet af Taylor et al. [8] i

cbio

hjemmeside (https://www.cbioportal.org/public-portal/) viste, at dem med FOXO4 nedregulering korreleret med en hurtigere udseende af metastaser sammenlignet med dem uden ændrede FOXO4 ekspression (fig. 2C). Der var ingen tegn korrelerer FOXO4 nedregulering i brystkræft metastase selv om der var en lille nedregulering i colon cancermetastase (fig. S1), hvilket antyder, at enhver formodet metastase suppressor funktion ved FOXO4 ville være vævstype-specifik. FOXO1 niveauer blev også nedreguleret i CaP metastaser (fig. S2A), men vi kunne ikke afgøre, om FOXO1 tab korreleret med øget metastaser i Cap-patienter (fig. S2B) på grund af underpowering grundet lavt antal patient. I modsætning hertil viste FOXO3 ekspressionsniveauerne ingen sammenhæng med CaP metastaser (fig S2C . D).

A. IB-analyse af FOXO4 udtryk i humane CaP cellelinjer (

øverste panel

), kvantificeres og sammenlignes med relativ Matrigel invasiv i

nederste panel

. Fejl barer, SE for tre uafhængige IB analyser kvantificeret ved densitometri (for FOXO4 niveauer) eller Matrigel invasion assays. Den relative FOXO4 niveau i DU145 blev fastsat til en værdi = 1 (stiplet linje). B. Oncomine studerer FOXO4 RNA ekspressionsniveauerne i BPH, primær-site (1 °) hætte eller metastaser (Mets) fra LaTulippe et al. [45] og Yu et al. [46]. C. Kaplan-Meier plot analyse (https://www.cbioportal.org/public-portal/) af metastaser forekomst vs. tid-til-debut i 37 CaP metastase sager fra Taylor et al. [8], hvor 12 sager (32%) viste FOXO4 nedregulering og korreleret med en hurtigere udseende af metastaser i forhold til de 25 sager, der viste ingen ændringer i FOXO4 ekspressionsniveauerne.

FOXO4 tab i LNCaP CaP-celler bidrager til højt metastatisk potentiale

for at bestemme om nedregulering af FOXO4 bidraget til den forøgede invasive kapacitet LNCaP-celler, blev LNCaP-celler, der stabilt transduceret med lentivirus FOXO4 shRNA kloner, forskellig fra den ene identificeret i den oprindelige skærm, eller transficeret med siFOXO4, og disse celler, vs. vektor eller krypteret (scr) siRNA kontroller blev testet for invasivitet. Knockdown af FOXO4 ved SH- eller siFOXO4 resulterede i 2,5- til 4-fold stigninger i LNCaP invasionsevne (fig. 3A). Omvendt CWR22Rv1 celler forbigående cotransficeret med pEGFP plus enten wt-FOXO4 eller et konstitutivt aktiv FOXO4 mutant (TM, for “tredobbelt mutant”, i.e.- tab af alle tre AKT phosphoryleringssteder) resulterede i nedsat invasiv (fig. 3B). Tab af FOXO4 fra shRNA eller siRNA havde ingen virkning på LNCaP spredning satser i 2D kulturer (fig. S3a) tyder på, at øget invasion niveauer efter FOXO4 ikke var på grund af ændringer i spredning satser. Derudover har vi analyseret, hvordan FOXO4 styrer invasiv Cap celler seedede på Oregon Green 488-mærkede gelatineovertrukne dækglas. FOXO4 knockdown i LNCaP resulterede i øget lokaliseret fordøjelse af Oregon Green 488-mærket gelatine ekstracellulær matrix sammenlignet med celler, der udtrykker ikke-specifik shRNA (fig. 3C), hvorimod overekspressionen af ​​Myc-FOXO4 i CWR22Rv1 celler faldt lokaliseret fordøjelse (fig. 3D).

A. LNCaP-celler stabilt transduceret med shRNA eller forbigående transficerede med siRNA mod FOXO4 (vs. scrambled kontrol) blev testet for invasivitet. FOXO4 knockdown blev vurderet ved IB (

øverste panel

) og dens virkning på Matrigel invasiv blev kvantificeret (

nederste panel

). Fejlsøjler, S.E. for tredobbelte eksperimenter. *, P 0,01. B. Ektopisk udtryk for WT eller konstitutivt aktiv (TM) FOXO4 falder CWR22Rv1 invasiv. Ektopisk FOXO4 blev vurderet ved IB (

øverste panel

) og dens virkning på Matrigel invasiv blev kvantificeret (

nederste panel

). Fejlsøjler, S.E. for tredobbelte eksperimenter. *, P 0,01. C. Den lokale invasiv af LNCaP [vektor] (

øverste række

) vs. LNCaP [shFOXO4] (

nederste række

) blev vurderet for celler podet på Oregon Green 488-mærket gelatine, med celler mærket med DAPI. D. Den samme analyse som i C, bortset fra at sammenligne CWR22Rv1 stabilt udtrykke vektor eller Myc-FOXO4. E. Lunge, lever, nyre og LN fra individ mus tumorangrebne med LNCaP [vektor] (kontrol) eller LNCaP [shFOXO4] blev filmede med synligt lys (

øverste panel

) eller fluorescerende lys (

nederste panel

). Arrows, LN og nyre metastaser. F. Metastatisk LN læsioner fra et LNCaP [shFOXO4] tumorangrebne mus farvet for H E eller GFP (ved IHC). Trekanter, eksempler på GFP-positive metastatiske celler.

Da de FOXO familiemedlemmer deler nogle overflødige funktioner [31], vi analyserede FOXO1 og FOXO3 niveauer i Cap celler og testet deres evne til at kontrollere invasiv. I modsætning til FOXO4, FOXO1 og FOXO3 niveauer syntes at stige i de mere invasive varianter af LNCaP- og PC-3-celler (fig S4A . B). Interessant nok knockdown af FOXO1, men ikke FOXO3, i LNCaP-celler inducerede højere invasivitet (fig. S4C), men den tvungne ekspression af enten FOXO1 eller FOXO3 undladt at formindske invasivitet af CWR22Rv1 celler (Fig. S4D). Således mens FOXO1 kan være involveret med LNCaP invasiv, FOXO4 er både involveret med og tilstrækkelig til kontrol af invasiv.

Vi testede derefter, om FOXO4 knockdown kunne fremme spontan metastase

in vivo

. Mandlige nøgne mus indlejret med tidsstyret frigivelse testosteron pellets blev injiceret i deres dorsale lapper med LNCaP [vektor] eller LNCaP [shFOXO4] -celler, og efter ti uger blev musene aflivet og analyseret for GFP-fluorescens som markør for pGIPZ. Selvom LNCaP [shFOXO4] primær-site tumorer var lidt mindre end dem induceret af LNCaP [Vector] -celler, var denne forskel ikke statistisk signifikant (fig. S3B). Vigtigere er det, var der ingen forskel i deres relative GFP udtryk (Fig S3C.), Eller deres spredning eller apoptose satser

in vivo

baseret på Ki67 eller kløvet caspase-3 IHC-farvning (fig S3D . E, henholdsvis) . FOXO4 knockdown resulterede i øget forekomst af GFP-udtrykkende macrometastases til lokale drænende lymfeknuder (LN), nyre (fig. S3E) og lunge sammenlignet med kontrolceller (tabel 1). Specifikt 82% (9/11) af shFOXO4 gruppe havde LN metastaser, sammenlignet med 31% (5/16) for kontrolgruppen; 27% (3/11) og 9,1% (1/11) i shFOXO4 gruppe havde nyre- og lungemetastaser henholdsvis hvorimod metastaser blev fundet i ingen (0/16) hos kontrolgruppen. Desuden har vi bekræftet, at LN læsioner udtrykte GFP protein ved hjælp GFP-specifik IHC (fig. 3F).

Analyse af FOXO4-regulerede pro-metastase gener

Da FOXO proteiner fungerer som transkriptionelle repressorer, vi undersøgt, om den øgede invasionsevne efter FOXO4 tab kan skyldes stigningen i pro-metastase-genekspression. Således blev genom-dækkende genekspression analyse udført på LNCaP [vektor] vs. LNCaP [shFOXO4] dyrkede celler, primær-site tumorer og LN metastaser. Knockdown af FOXO4 i hvert af disse prøvesæt blev bekræftet af IB (fig. S5A). Denne analyse identificerede 535 gener, hvis ekspression ændres ≥1.5-fold (Fig. S5B). Af disse 54 ændringer var fælles for alle tre prøver sæt (fig. 4A, fig. S5C), og af disse blev 19 gener (15 opreguleres, 4 nedreguleret) er forbundet med FOXO4 knockdown (Fig. 4B). For at fokusere vores analyse, vi analyseret af Ingenuity IPA-software, som af den 19-genet signatur var involveret i metastase-associerede processer såsom celle motilitet, invasiv, kemotaksi eller celle overlevelse. Otte gener opreguleret i shFOXO4-associerede LN metastaser (

PIP, CAMK2N1, PLA2G16, ALDH1L1, VCX, VCX3A, APP

, og

PGC

) blev identificeret som potentielt involveret i metastase (Fig . 4C,

top

).