PLoS ONE: neuregulin Fremmer Ufuldstændig Autophagy af prostata kræftceller, der er uafhængig af mTOR Pathway Inhibition

Abstrakt

Baggrund

Vækstfaktorer Aktivering af ErbB receptorer er blevet beskrevet i prostata tumorer. Den androgenafhængig prostatacancer-cellelinie, LNCaP, udtrykker de ErbB-1, ErbB-2 og ErbB-3 receptortyrosinkinaser. Tidligere blev det påvist, at NRG aktiverer ErbB-2 /erbB-3-heterodimerer til at inducere LNCaP celledød, hvorimod EGF aktiverer ErbB-1 /ErbB-1 eller ErbB-1 /ErbB-2-dimerer til at inducere cellevækst og overlevelse. Det blev også vist, at PI3K inhibitorer undertrykte denne celledød tyder på, at i androgen berøvet LNCaP celler, NRG aktiverer en PI3K-afhængige vej er forbundet med celledød.

Metode /vigtigste resultater

I den nuværende undersøgelse viser vi, at NRG inducerer autofagi i LNCaP celler, ved hjælp LC3 som en markør. det autophagy fremkaldt af NRG, kan imidlertid være ufuldstændig, da P62 niveauer ophøje. Vi viste også, at NRG- induceret autofagi er uafhængig af pattedyr mål for rapamycin (mTOR) hæmning siden NRG inducerer Akt og S6K aktivering. Interessant, hæmning af reaktive ilt arter (ROS) af

N

-acetylcysteine ​​(NAC), hæmmede NRG-induceret autophagy og celledød. Vores undersøgelse identificerede også JNK og Beclin 1 som vigtige komponenter i NRG-induceret autophagy og celledød. NRG induceret forøgelse i JNK-phosphorylering, der blev inhiberet af NAC. Desuden hæmmer af JNK inhiberede NRG-induceret autofagi og celledød. Også i celler, der overudtrykker Bcl-2 eller celler, der udtrykker sh-RNA mod Beclin 1, virkningerne af NRG, nemlig induktion af autofagi og celledød, blev inhiberet.

Konklusioner /Signifikans

Således , i LNCaP-celler, NRG-inducerer ufuldstændig autofagi og celledød, der er afhængige af ROS-niveauer. Disse virkninger af NRG er medieret af signalvejen, der aktiverer JNK og Beclin 1, men er uafhængig af mTOR hæmning

Henvisning:. Schmukler E, Shai B, Ehrlich M, Pinkas-Kramarski R (2012) neuregulin Fremmer Ufuldstændig autophagy af prostata kræftceller, der er uafhængig af mTOR Pathway Inhibition. PLoS ONE 7 (5): e36828. doi: 10,1371 /journal.pone.0036828

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: Januar 5, 2012; Accepteret: April 6, 2012; Udgivet: May 14, 2012 |

Copyright: © 2012 Schmukler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Israel Science Foundation (tilskud nr 732/08), som Israel Sundhedsministeriet (tilskud nr 3942), af Israel Cancer Association (tilskud nr 4.914.422) og af Kauffman Prostata Cancer Research Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en af ​​de mest almindelige mandlige kræftformer. Prostatavækst celler er reguleret af hormoner, vækstfaktorer og deres respektive receptorer. Blandt de hyppigste gruppe af receptorer impliceret i humane cancere er ErbB underfamilien af ​​receptortyrosinkinaser [1], [2], [3]. Denne familie omfatter fire receptorer ErbB-1-ErbB-4. Henviser ErbB-1-receptor (kendt som epidermal vækstfaktorreceptor, EGFR), der aktiveres af EGF og EGF-lignende ligander, ErbB-3 og erbB-4-receptorer aktiveres af NRG /neuregulin isoformer og ErbB-2-receptor har ingen kendt ligand [4]. Disse receptorer er udtrykt i prostata epitel, mens ErbB-1-ligander er udtrykt i stroma og NRGs er udtrykt i stroma og i den basale og sekretoriske epitel [5].

Aktivering af ErbB-1 signalering af EGF og EGF-lignende vækstfaktorer spiller en vigtig rolle i prostatacancer celleproliferation og tilsætning af EGF til kulturer af prostatacancerceller stimulerer deres vækst [6]. Desuden ErbB-2-overekspression er en almindelig hændelse, der synes at give en selektiv fordel til flere typer af carcinomer, herunder prostatacancer [3], [7]. Normalt er ErbB-2 udtrykkes i prostata epitelceller [7], [8]. Højere niveauer af ErbB-2 i forhold til normale væv blev observeret i prostatatumorer [9], [10]. Desuden har overekspression af ErbB-2 og ErbB-3 blevet impliceret i den neoplastiske transformation af prostatacancer [11]. Selv er stadig uklart, hvilken rolle disse onkogener og vækstfaktorer i prostatacarcinom har overekspression af ErbB-1 og ErbB-2 været relateret til dårlig prognose og fjernt metastase [12].

Autophagy, en proces med reguleret omsætning af cellulære bestanddele, er vigtig for normal kontrol vækst, men kan være defekt i sygdomme [13], [14]. Under begrænsede næringsstoffer eller vækstfaktorer betingelser, denne proces er vigtigt at opretholde energiproduktion for celle overlevelse [15]. Autophagy kan også tjene som en mekanisme, hvormed celler befri sig fra defekte organeller og genbruge proteiner [16]. På den anden side kan autofagi føre til ikke-apoptotisk type celledød (type II celledød) spiller en rolle i udviklingsmæssig celledød og død fra giftige stimuli [17].

Dannelsen af ​​autophagosomes styres af flere ATG proteiner. Atg8 protein (den humane homolog er MAP-LC3) er forbundet med autophagosomal membranen og fungerer som en markør for autophagosome formation [18]. Dannelse af autophagosome kræver også klasse III phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) [19]. Autophagy medieret af PI3K afhænger interaktion af sidstnævnte med atg6 protein, hvoraf Beclin 1 er den humane homolog [20]. Beclin 1 blev vist at virke som et tumorsuppressorgen ved at styre processen med autophagy [21]. Dens interaktion med anti-apoptotiske protein Bcl-2 [22] hæmmer autofagi [23]. Nedregulering af Bcl-2 kan tilsyneladende fremme autofagi [24], hvilket antyder, at Beclin 1-medieret autophagy kan hæmmes via dens interaktion med Bcl-2. For nylig, flere undersøgelser identificeret Bcl-2 interagerende domæne Beclin en (en BH3 domæne) [25], [26], [27].

Tidligere undersøgelser viste, at NRG (ErbB3 og ErbB4 ligand) hæmmer vækst af androgenafhængige LNCaP-prostatacancerceller når dyrket i komplet medium [28], mens i fravær af androgen, NRG induceret død LNCaP-celler [29]. Interessant PI3K-inhibitor (3-methyladenin), som også hæmmer autophagy, inhiberede NRG-induceret celledød, hvilket antyder, at NRG kan inducere autophagic celledød i disse celler [29]. I den foreliggende undersøgelse, vi rettet den hypotese, at NRG medierer autofagi i LNCaP celler og studerede de signalveje, der medierer NRG induceret autophagy og celledød. Ved at bruge LC3 som en markør, vi vise, at NRG øger LC3-II niveauer. Imidlertid er niveauet af p62 /SQSTM1 protein, som binder LC3 og nedbrydes af autophagy [30], blev ikke reduceret med NRG behandling, hvilket indikerer, at autophagy induceret af NRG er ufuldstændig.

Vi viser også, at hæmning af reaktive ilt arter (ROS) ved

N

-acetylcysteine ​​(NAC) hæmmer NRG-medieret autophagy og celledød. Vores resultater viser, at NRG aktiverer klasse I PI3K, Akt, mTOR og pS6K pathway, en kendt autophagy inhiberende pathway, som ikke inhiberes af NAC. Derudover viser vi, at NRG inducerer JNK-aktivering, som hæmmes af NAC. Desuden JNK-inhibitor, Beclin 1 inaktivering og Bcl-2 overekspression, inhiberede NRG-induceret autofagi og celledød. Således foreslår vi en model, som NRG-induceret autophagy og celledød af LNCaP celler involverer Beclin 1 og JNK signalveje og er uafhængig af PI3K /Akt /mTOR signalvejen hæmning.

Resultater

NRG inducerer Autophagy, som inhiberes af 3-methyladenin (3-MA) ​​i LNCaP-celler

LNCaP er en androgen-responsive prostata carcinom-cellelinje, der udtrykker ErbB-receptorerne [29]. Vi har tidligere påvist, at NRG inducerer celledød, der blev inhiberet af 3-MA, en PI3K-inhibitor [29], og er caspase uafhængig (Ikke vist og [29]). Det blev også påvist, at NRG inducerer morfologiske ændringer i LNCaP-celler, som blev inhiberet af 3-MA (Video S1 og [29]). I den foreliggende undersøgelse har vi analyseret effekten af ​​NRG på autofagi og celledød af LNCaP-celler dyrket uden androgen mimetisk. For at bestemme autophagy induktion, brugte vi LC3 protein som markør. Som vist i figur 1A, udviste LNCaP-celler behandlet med NRG i 14 timer og 24 timer, forbedret omdannelse af LC3-I til LC3-II, der blev inhiberet af 3-MA, hvilket indikerer, at faktisk NRG inducerer autofagi i LNCaP-celler. For yderligere at demonstrere autophagy induktion, vi anvendte LNCaP-celler, der stabilt udtrykker GFP-LC3 ekspressionsvektor. Som vist i figur 1B, NRG inducerede forbedret autophagosome dannelse som afspejlet ved forøget afbrudte farvning af GFP-LC3. Som en positiv kontrol blev celler behandlet med rapamycin, som også inducerede autofagi i LNCaP-celler (figur 1b). Således LNCaP-celler reagerer på NRG ved øget autofagi induktion. For yderligere at studere autofagi induceret af NRG, vi undersøgte ekspressionsniveauet af P62 /SQSTM1. Den P62 /SQSTM1 protein binder LC3-II og nedbrydes af autophagy [30]. Overraskende, har NRG behandling ikke øge P62 nedbrydning indikerer, at autofagi fremkaldt af NRG kan være ufuldstændige. Som kontrol blev celler behandlet med Earles balancerede saltopløsning (EBSS), og niveauerne af LC3-II og p62 blev bestemt ved immunoblot (figur S1). Som vist EBSS induceret LC3-II elevation og p62 nedbrydning som forventet. Notatet 3-MA behandling reducerede LC3-II niveauer i NRG behandlede celler samt P62 niveauer i fravær af NRG. Forklaringen på disse resultater er endnu ukendt.

(A) LNCaP-celler blev behandlet med 100 ng /ml neuregulin (NRG) i nærvær eller i fravær af 10 mM 3-methyladenin (3-MA) ​​for den angivne periode. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-LC3 og anti-P62-antistoffer.

Overpanel,

repræsentative resultater.

Underpanel,

densitometrisk analyse præsenteres som gange induktion i forhold til kontrollen ubehandlede celler (n = 3; middelværdier ± standardafvigelse; * p 0,05). (B) LNCaP-celler, der stabilt udtrykker LC3-GFP blev behandlet med 50 nM rapamycin til anfordring eller med 100 ng /ml NRG i 5 timer. Cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd og kerner blev farvet med bisdenzimide (Hoecsht 33258). Efter fiksering og farvning blev cellerne fotograferet under anvendelse Nikon optisk fluorescensmikroskop Model TE-2000S (60 ganges forstørrelse).

Overpanel

, repræsentative billeder.

Underpanel

, autofagi blev kvantificeret ved at tælle antallet LC3 dots per celle ved hjælp af ImageJ software. Den viste resultat repræsenterer to uafhængige forsøg. 70-80 celler blev analyseret pr behandling; data præsenteret som gennemsnit ± SD (*

s

0,05)

NRG-induceret Autophagy er ufuldstændig

NRG behandling inducerer autophagy men også fører til en. stigning i P62 niveauer, hvilket indikerer, at autofagi induceret af NRG er ufuldstændig (figur 1). For yderligere at bekræfte disse resultater blev LNCaP-celler, der stabilt udtrykker LC3-GFP-fusionsproteinet enten behandlet med NRG i 24 timer eller inkuberet med EBSS medium i flere timer. Cellelysater blev immunoblottet med anti-GFP-antistof til påvisning af niveauerne af GFP-mærkede LC3-I og LC3-II. Som vist i figur 2A, både EBSS og NRG inducerer autophagy, som bedømt ved forøgelsen af ​​LC3-II-GFP-niveauer sammenlignet med de ubehandlede celler. Men i celler inkuberet med EBSS, LC3-II-GFP-niveauer falder, over tid, mens niveauerne af LC3-II-GFP i celler behandlet med NRG er relativt høj, selv efter 24 timers inkubation. Endvidere i nærvær af bafilomycin-A

1 (inhibitor af autophagosome-lysosom-fusion) akkumuleringen af ​​LC3-II-GFP er signifikant højere i EBSS behandlede celler sammenlignet med NRG-behandlede celler (figur 2B). Samlet set viser disse fund indikerer, at NRG-induceret autofagi er ufuldstændig.

(A) LNCaP-celler, der stabilt udtrykker LC3-GFP blev behandlet med 100 ng /ml NRG i 24 timer eller inkuberet med EBSS medium for den angivne tid perioder. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-GFP-antistof. (B) LNCaP-celler, der stabilt udtrykker LC3-GFP blev behandlet med 100 ng /ml NRG i 24 timer eller inkuberet med EBSS medium i 2 og 4 timer. Behandlinger blev udført i nærvær eller fravær af 10 nM bafilomycin-A1 (Bafilo-A1). Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-GFP-antistof.

Overpanel

, repræsentativ blot.

Underpanel

, er densitometrisk analyse præsenteres som gange induktion i forhold til kontrollen ubehandlede celler (venstre graf *, p 0,05 og **, p 0,02 sammenlignet med kontrollen) eller som forskellen mellem de målte værdier med eller uden 10 nM Bafilo-A1 i hver gruppe (højre graf *, p 0,05 og **, p 0,02 sammenlignet med NRG tretment) (n = 3 betyder ± SD)

. NRG-induceret autophagy og celledød af LNCaP celler hæmmes af Reduktion af Reactive oxygen Species (ROS) Niveauer

det er tidligere påvist, at autophagy induktion afhænger af dannelse og ophobning af ROS [23], [31] , [32], [33]. Derfor, for at karakterisere virkningen af ​​ROS på NRG-medieret autofagi og celledød, blev LNCaP-celler stimuleret med NRG i nærvær eller i fravær af den generelle antioxidant

N

-acetylcysteine ​​(NAC) [34 ], og LC3 og P62 blev bestemt ved immunoblot (fig. 3A). Præ-inkubering med NAC fuldstændig hæmmet NRG-induceret LC3-II elevation, hvilket indikerer, at NRG-induceret autofagi er ROS-afhængig. Dernæst undersøgte vi, om NAC kan beskytte mod NRG-induceret celledød. LNCaP-celler blev forbehandlet med NAC med og uden NRG behandling, og cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af methylenblåt-farvning-assay. Som vist i figur 3B, tilstedeværelsen af ​​NAC forhindrede formindskelsen i cellelevedygtigheden induceret af NRG. To yderligere metoder til påvisning af celledød (Hoecsht udelukkelse farvestof-assay og flowcytometri) understøttes yderligere disse resultater. NRG induceret forbedret celledød, som tydeligt af stigningen i sub-G1 befolkning (figur 3C) eller af den høje procentdel af Hoecsht-positive celler (figur 3D). Denne celledød blev markant hæmmet af NAC. Endvidere NAC behandling inhiberede NRG-induceret morfologisk ændring (S5). Derfor vores resultater viser tydeligt, at NAC inhiberer LC3-II akkumulering, celledød og morfologiske ændringer induceret af NRG i LNCaP-celler.

(A) LNCaP-celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG med eller uden 10 mM

N

-acetylcysteine ​​(NAC) i 24 timer. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-LC3 og anti-P62-antistoffer.

Venstre panel,

repræsentative resultater.

Højre panel,

densitometrisk analyse præsenteres som gange induktion i forhold til kontrollen ubehandlede celler (n = 6; middelværdier ± standardafvigelse; * p 0,05). (B) LNCaP-celler blev testet for cellelevedygtighed under anvendelse af methylenblåt-farvning-assay. Celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG i nærvær eller i fravær af 10 mM NAC. Methylenblåt blev udført 60 timer senere. Resultaterne præsenteres som% af kontrol, og er middelværdier ± standardafvigelse på 4-6 bestemmelser (** p 0,0001). Dette forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater. (C) LNCaP-celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG med eller uden 10 mM NAC. Celler blev høstet 60 timer senere og analyseret for deres DNA-indhold ved flowcytometri. Procentdelen af ​​celler ved forskellige cellecyklus faser er angivet. (D) LNCaP-celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG i nærvær eller i fravær af 10 mM NAC i 60 timer. Cellerne blev farvet med fluorescerende DNA farvestof bisbenzimid (Hoecsht 33258, 1 pg /ml) for at vurdere antallet af døende celler. Efter farvning blev cellerne fotograferet ved hjælp af Olympus optisk omvendt fase-kontrast mikroskop Model IX70 (20 × forstørrelse, skala barer, 50 mikrometer).

Venstre panel

, repræsentative billeder.

Right panel

, procentdelen af ​​døende celler blev estimeret ved at tælle antallet af Hoecsht-positive celler i forhold til de numeriske totale celler i hvert felt (10-15 felter for hver behandling, 100-200 celler pr felt). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD (** p 0,0001)

NRG-induceret LC3-II Elevation og celledød i LNCaP-celler er uafhængig af Akt /mTOR-signalvejen

for at bestemme signalvej, der fører til NRG-induceret autophagy og celledød, vi først undersøgte Akt /mTOR-signalvejen. LNCaP-celler udtrykker PTEN mutation, der fører til Akt aktivering [35], [36]. Akt aktiverer mTOR, som er et kendt negativ regulator af autofagi [37], [38]. Således var det rimeligt at undersøge phosphorylering og aktivering af disse proteiner. LNCaP-celler blev behandlet med NRG i 24 timer og aktiveringen af ​​Akt og mTOR blev undersøgt under anvendelse af anti-phospho-Akt og anti-phospho S6K antistoffer. Som vist i figur 4A, basalt phosphoryleret Akt og S6K blev observeret i kontrolgrupperne ubehandlede celler imidlertid NRG behandling øget niveau af phosphoryleret Akt og S6K. NAC, som hæmmer NRG-induceret autophagy, havde ingen effekt på phosphoryleringsniveauerne for hverken Akt eller S6K. Disse resultater kan tyde på, at NRG-induceret autofagi er uafhængig af mTOR inhibering. For yderligere at undersøge signalvej involveret i NRG-induceret autofagi i LNCaP-celler, vi undersøgte dernæst aktiveringen af ​​Erk og JNK, to kendte mitogenaktiveret proteinkinaser (MAPK’er), som er nedstrøms signalering komponenter af ErbB-receptorer [39]. Specifikke anti phospho-protein-antistoffer mod Erk1 /2 og JNK blev anvendt. Som vist i figur 4, NRG inducerede en stigning i phosphorylering af ERK1 /2-og JNK. NAC, der inhiberer NRG-induceret autophagy, havde ingen virkning på ERK1 /2-phosphorylering, hvilket viser, at Erk-aktivering ikke er involveret i NRG-induceret autofagi eller at NAC virker nedstrøms til Erk-aktivering. På den anden side blev JNK phosphorylering stærkt reduceret i nærvær af NAC, hvilket indikerer, at JNK kan være en potentiel mediator af NRG-induceret autophagy.

(A) LNCaP-celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG med eller uden 10 mM NAC i 24 timer. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med de angivne antistoffer. (B) Densitometrisk analyse af flere gentagelser præsenteres som gange induktion af kontrol ubehandlede celler. Midlerne til bands intensitet blev standardiseret i forhold til de samlede ikke-phosphorylerede protein signaler (data er gennemsnit fold induktion ± SD; * p 0,05).

Siden NRG induceret S6K phosphorylering men inducerede også autofagi, vi næste sammenlignet autophagy induceret af mTOR inhibering til autofagi induceret af NRG. MTOR inhibitor, rapamycin, er tidligere blevet vist at inducere autofagi ved nedregulering mTOR aktivitet [37], [40]. Vi fandt, at rapamycin behandling samt NRG behandling induceret autophagy, som bedømt ved den øgede LC3-II /LC3-I-forholdet (figur 5A og B) og ved forøget LC3 puncta dannelse (figur 1B). Men som forventet, blev S6K fosforylering øget efter NRG behandling, men reduceret efter rapamycin behandling. Derudover NAC behandling inhiberede autofagi induceret af rapamycin og NRG, men det havde ingen effekt på NRG-induceret S6K phosphorylering. Interessant rapamycin behandling selvom inhiberede cellevækst [29], havde ingen virkning på celler morfologi, mens NRG forårsagede en dramatisk morfologisk ændring som tidligere beskrevet [28], [29] og som vist i figur 5C og fig S1 (runde og løsnede celler ). Disse resultater viser, at NRG-induceret autofagi afviger fra autofagi udløst af rapamycin. Dernæst undersøgte vi effekten af ​​NRG og rapamycin co-behandling på autofagi-inducion i LNCaP celler (Figur 5D). Som vist kombineret behandling inducerede højere niveauer af LC3II sammenlignet med hver behandling alene, hvilket antyder, at rapamycin og NRG kan virke gennem forskellige signalveje at inducere autofagi.

(A) LNCaP-celler blev behandlet med enten 100 ng /ml NRG eller 50 nM rapamycin (Rapa) i 24 timer, i nærvær eller i fravær af 10 mM NAC. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-LC3, anti-phospho-S6K og anti-S6K antistoffer. (B) Densitometrisk analyse af resultaterne beskrevet i A er repræsenteret som gange induktion af kontrol ubehandlede celler (n = 3, betyder ± standardafvigelse). (C) Repræsentative billeder af cellemorfologi efter behandlinger med NRG og rapamycin er vist (Olympus, 20 × forstørrelse). (D) LNCaP-celler blev behandlet med enten 100 ng /ml NRG, 50 nM rapamycin eller begge i 24 timer. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-LC3 antistoffer. Dette eksperiment blev gentaget tre gange med lignende resultater.

NRG-induceret Autophagic celledød i LNCaP celler afhænger af JNK Aktivering

Da mTOR pathway ikke er involveret i NRG-induceret autofagi og celledød, søgte vi efter andre mulige mediatorer. Vi valgte at undersøge inddragelsen af ​​JNK, eftersom NRG induceret JNK-phosphorylering, der blev inhiberet af NAC. Derfor vi først undersøgt effekten af ​​JNK inhibitor SP600125 på NRG-induceret autophagy (figur 6A). Som vist i nærvær af SP600125, NRG-induceret autophagy inhiberet, som bedømt ved den formindskede LC3-II /LC3-I-forholdet. Alligevel SP600125 behandling havde ingen effekt på P62 niveauer. Dernæst undersøgte vi effekten af ​​JNK-inhibitor på cellelevedygtighed under anvendelse Hoecsht farveeksklusion og methylen blåfarvning assays (fig. 6B og C). Som vist i nærvær af JNK-inhibitor, blev NRG-induceret celledød inhiberes; hvilket indikerer, at JNK-aktivering med NRG kan være vigtig for induktion af autofagi og celledød af LNCaP-celler.

(A) LNCaP-celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG i 24 timer med eller uden 20 pM SP600125. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-LC3, anti-P62, anti-p-JNK og anti-JNK antistoffer.

Venstre panel,

repræsentative resultater.

Højre panel,

densitometrisk analyse præsenteres som gange induktion i forhold til kontrollen ubehandlede celler (n = 5; middelværdier ± standardafvigelse; * p 0,05). (B) LNCaP-celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG i nærvær eller i fravær af 20 uM SP600125 i 60 timer. Cellerne blev farvet med fluorescerende DNA farvestof bisbenzimid (Hoecsht 33258, 1 pg /ml) for at vurdere antallet af døende celler. Efter farvning blev cellerne fotograferet ved hjælp af Olympus optisk omvendt fase-kontrast mikroskop Model IX70 (20 × forstørrelse, skala bar, 50 mikrometer).

Venstre panel

, vises repræsentative billeder.

Right panel

, procentdelen af ​​døende celler blev estimeret ved at tælle antallet af Hoecsht-positive celler i forhold til de numeriske totale celler i hvert felt (10-15 felter for hver behandling, 100-200 celler pr felt). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (** p 0,0001). (C) LNCaP-celler blev testet for cellelevedygtighed under anvendelse af methylenblåt-farvning-assay. Celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG i nærvær eller i fravær af 20 uM SP600125. Methylenblåt blev udført 60 timer senere. Resultaterne præsenteres som% af kontrol, og er middelværdier ± standardafvigelse på 4-6 bestemmelser (** p 0,0001). Dette eksperiment blev gentaget tre gange med lignende resultater.

Beclin 1 er nødvendigt for og Bcl-2 giver resistens over NRG-induceret Autophagy og celledød

Beclin en, en komponent af klassen-III PI3K-kompleks, er en vigtig kendt regulator af autofagi [41], [42]. For at bestemme involveringen af ​​denne vej i NRG-induceret autophagy blev LNCaP-celler transficeret med sh-Beclin 1 eller kontrol krypteret sh-RNA-ekspressionsvektorer. Som vist i figur 7A, NRG behandling forstærket autofagi i kontrolcellerne. Men i sh-Beclin 1 transficerede celler, blev NRG-medieret autofagi reduceret sammenlignet med kontrolceller. Disse resultater indikerer, at Beclin 1-protein er involveret i NRG medieret autofagi i LNCaP-celler.

(A) LNCaP-celler blev transficeret med Beclin 1 sh-RNA (3 ug) eller kontrol krypteret sh-RNA (3 ug) og inkuberet i normalt medium i 72 timer. Cellerne blev derefter behandlet med 100 ng /ml NRG for yderligere 24 timer. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-LC3 og anti-Beclin 1-antistoffer.

Venstre panel

, repræsentativt forsøg er vist.

Right panel

, kvantificering af resultaterne er vist. Resultaterne er præsenteret som gange induktion sammenlignet med kontrol ubehandlede celler (n = 3; middelværdier ± standardafvigelse; * p 0,05). (B) Naive eller Bcl-2-GFP stabilt udtrykker LNCaP-celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG for de angivne tidsperioder. Helcellelysater blev fremstillet og underkastet en immunoblotanalyse med anti-LC3 og anti-Bcl-2-antistoffer.

Venstre panel

, repræsentativ blot vises.

Højre panel

, kvantificering af resultaterne præsenteres som gange induktion sammenlignet med kontrol ubehandlede celler (n = 3; middelværdier ± standardafvigelse; * p 0,05). (C) naive og Bcl-2-GFP stabilt udtrykker LNCaP-celler blev testet for cellelevedygtighed under anvendelse af methylenblåt-farvning-assay. Celler blev behandlet med 100 ng /ml NRG og methylenblåt blev udført 60 timer senere. Resultaterne præsenteres som% af kontrol, og er middelværdier ± standardafvigelse på 4-6 bestemmelser (** p 0,0001). Dette forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater.

Medlemmer af Bcl-2 anti-apoptotisk familie blev tidligere vist at inhibere autofagi-fremmende aktivitet af Beclin 1 [23]. Det blev også påvist, at interaktionen mellem Bcl-2 anti-apoptotiske proteiner og Beclin 1 under autofagi inhiberes. Antages det, at Beclin 1 er involveret i NRG-induceret autofagi og celledød, vi den hypotese, at overekspression af Bcl-2 ville beskytte LNCaP-celler fra NRG-induceret autofagi og celledød. Således har vi næste undersøgt virkningen af ​​Bcl-2-GFP-overekspression på NRG-medieret autofagi af LNCaP-celler (figur 7B). Som vist blev autofagi i naive LNCaP-celler forøget efter 16 timer og 24 timer af NRG behandling, mens der i LNCaP-celler, der stabilt overudtrykker Bcl-2-GFP, NRG behandling havde ingen virkning på niveauerne af autophagy induktion. Endvidere Bcl-2-GFP overudtrykker LNCaP-celler var resistente over for NRG-induceret celledød sammenlignet med naive LNCaP-celler (fig. 7C). Tilsammen vores resultater tyder på, at der ud over JNK aktivering, Beclin 1 er også afgørende for den autophagic proces fremmes af NRG.

Diskussion

Prostata kræft starter typisk som androgen følsomme læsioner, men ofte udvikle sig til androgen-ufølsomme læsioner med progression til fremskredne stadier. LNCaP androgen-afhængige cellelinie udtrykker høje niveauer af ErbB-2 og ErbB-3 sammenlignet med andre humane prostatacancerceller [28]. Hertil kommer, at disse celler ikke udtrykke NRG men de udtrykker TGF-α og EGF, der kan fungere som autokrine aktivatorer af EGFR [28]. Tidligere blev det påvist, at i LNCaP celler dyrket uden androgen mimetisk, NRG, men ikke EGF inducerer celledød. Denne virkning af NRG på celledød medieres af ErbB-2 /erbB-3 heterodimerer [29]. Det blev også påvist, at celledøden induceret af NRG inhiberes af PI3K-inhibitorer, hvilket indikerer, at NRG kan inducere autophagic celledød [29]. I den foreliggende undersøgelse viser vi, for første gang, at NRG faktisk inducerer autofagi i LNCaP-celler, ved anvendelse af to assays: immunoblotanalyse med anti-LC3 antistoffer og mikroskopisk analyse af LC3-GFP-farvning i LNCaP-celler. Denne virkning af NRG blev også inhiberet af 3-MA. Men autofagi induceret af NRG er ufuldstændig, da blev opdaget nogen nedbrydning af p62 protein efter NRG behandling. Således NRG aktivering ErbB2 /ErbB3 heterodimerer inducerer ufuldstændig autofagi og celledød i LNCaP celler.

Reaktive ilt arter (ROS) var impliceret i de signalveje igangsat af receptor tyrosinkinaser, herunder ErbB receptorer [43], [ ,,,0],44]. Adskillige linje af beviser viser, at reaktive ilt arter (ROS) spiller en rolle i autofagi. Først ROS kræves for sult-induceret autophagy, tilsyneladende på grund af regulering af Atg4 aktivitet [32]. For det andet kan ROS selv fremkalde autofagi i visse cellelinjer [31], [45]. Vores resultater viser, at NRG-induceret autofagi er følsom over for ROS-niveauer, da i nærværelse af den generelle antioxidant NAC, NRG-induceret autofagi og celledød blev inhiberet.

Det er tidligere vist, at mTOR tjener som en negativ regulator af autophagy ved at undertrykke aktiviteten af ​​Atg13 /Atg1 kompleks [46]. Således vækstfaktorer og visse hormoner udøver deres anti-autophagic virkning ved at aktivere klasse-I PI3K /Akt /mTOR pathway [47]. På den anden side, pro-autophagic stimuli, såsom næringsstoffer sult og rapamycin behandling, føre til mTOR inaktivering efterfulgt af autophagy induktion. Faktisk inhibering af mTOR ved rapamycin induceret autofagi i LNCaP-celler. På de samme celler, vore resultater viser, at NRG inducerer mTOR aktivering som tydeligt ved phosphoryleringen af ​​S6K, og dets opstrøms regulator Akt. Desuden blev det tidligere påvist at NRG inducerer ErbB2 /ErbB3 heterodimerdannelse og klasse-I PI3K-aktivering i LNCaP-celler [28]. Samlet set fremgår det, at NRG aktiverer en anti-autophagic signalvej, nemlig ErbB /klasse-I PI3K /Akt /mTOR pathway og alligevel fremmer autofagi induktion i LNCaP-celler. NAC, der fuldstændig blokerer NRG-induceret autophagy, påvirkede ikke phosphorylering af hverken Akt eller S6K. Derfor foreslår vi, at NRG-induceret autofagi er uafhængig af mTOR hæmning.

NRG inducerer aktivering af forskellige signalveje. Det blev tidligere vist, at i LNCaP-celler, NRG aktiverer blandt andet signalveje også MAP-kinaser: Erk, p38, JNK og PI3K signalveje [28]. Vi har forsøgt at følge signalvejen fører til NRG induceret autophagy og celledød. Vores resultater viser, at JNK er involveret i NRG-induceret autofagi og celledød. Faktisk stigende mængde beviser eksisterer med hensyn rolle JNK som en mediator af autophagy induktion efter forskellige stimuli [48], [49], [50]. Efter aftale med disse resultater, viste vi, at JNK phosphoryleringsbegivenheder stiger efter NRG behandling LNCaP celler. Vi fandt også, at NAC, en inhibitor af NRG-induceret autofagi og celledød, blokke JNK phosphorylering. Tilsammen foreslår vi, at JNK medierer pro-autophagic effekt af NRG. Faktisk, i tilstedeværelse af JNK inhibitor SP600125, NRG-induceret celledød og autofagi blev hæmmet.

kernedannelse og samling af autophagosome kræver aktivering af klasse III PI3K kompleks, som er sammensat af PI3K (vps34 ), vps15, atg14 og atg6 (Beclin 1 i pattedyrceller) [19], [20]. Beclin 1-medieret autofagi er negativt reguleret af dets samspil med bcl-2-anti apoptotiske proteiner.