PLoS ONE: Nye KRAS genmutationer i sporadisk kolorektal Cancer

Abstrakt

Introduktion

I denne artikel rapporterer vi 7 nye KRAS genmutationer opdaget, mens efterfølgende studerede forekomsten og mønster af KRAS-mutationer i kræft væv opnået fra 56 Saudi sporadiske kolorektal kræftpatienter fra den østlige provins.

Metoder

Genomisk DNA blev ekstraheret fra formalinfikserede, paraffinindlejrede kræft og noncancerous kolorektale væv. Succesfulde og specifikke PCR-produkter blev dernæst to retninger sekventeret til påvisning exon 4 mutationer mens Mutector II Detection Kits blev anvendt til identifikation af mutationer i kodonerne 12, 13 og 61. Den funktionelle virkning af de hidtil ukendte mutationer blev vurderet ved anvendelse af bioinformatik værktøjer og molekylær modellering.

Resultater

KRAS genmutationer blev påvist i kræftvæv af 24 tilfælde (42,85%). Af disse 11 havde exon 4 mutationer (19.64%). De nærede 8 forskellige mutationer, som alle undtagen to ændrede KRAS-proteinet aminosyresekvensen og alle undtagen én var roman som afsløret ved COSMIC database. De detekterede hidtil ukendte mutationer viste sig at være somatisk. Én mutation forudsiges at være godartede. De resterende mutationer forventes at forårsage betydelige ændringer i proteinstrukturen. Af disse er Q150X nonsense mutation er den anden beskærer mutation, der skal rapporteres i kolorektal cancer i litteraturen.

Konklusioner

Vores opdagelse af nye exon 4 KRAS-mutationer, der er, indtil videre, enestående til Saudi kolorektal kræftpatienter kan tilskrives miljøfaktorer og /eller racemæssige /etniske variationer grundet genetiske forskelle. Alternativt kan det være relateret til mangel på kliniske undersøgelser af andre end de i kodoner 12, 13, 61 og 146. Yderligere KRAS test på et stort antal patienter med forskellige etniske grupper, især ud over de mest almindelige hotspot alleler i exon 2 og mutationer 3 er nødvendig for at vurdere forekomsten og udforske den nøjagtige prognostisk og prædiktiv betydning af de fundne nye mutationer samt deres mulige rolle i kolorektal carcinogenese

Henvisning:. Naser WM, Shawarby MA, Al-Tamimi DM, Seth A, al-Quorain A, Nemer AMA, et al. (2014) Nye KRAS genmutationer i sporadisk kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (11): e113350. doi: 10,1371 /journal.pone.0113350

Redaktør: Klaus Brusgaard, Odense Universitetshospital, Danmark |

Modtaget: Juni 12, 2014, Accepteret: 22 oktober 2014; Udgivet: 20. november 2014

Copyright: © 2014 Naser et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af en bevilling på forskning i “K-ras, p53, EGFR og HER2-afvigelser i kolorektal cancer” fra Dekanat af videnskabelig forskning, University of Dammam, Saudi-Arabien (tilskud # 2.011.003). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udviklingen af ​​cancer (carcinogenese) er en flertrinsproces, der menes at skyldes akkumulering af genetiske ændringer i en enkelt celle i et individs liv. Antallet af gener fundet at være forbundet med forskellige kræftformer vokser hurtigt. De hyppigst aktiverede gener er medlemmer af RAS-genfamilien, hvoraf to (Harvey- H) og (Kirsten-K) først blev identificeret som værende homologe med virale transformerende gener, mens den tredje (NTM) blev identificeret i en human neuroblastom . RAS-genproduktet er en monomer membran-lokaliserede G-protein af 21 kD, der fungerer som en molekylær omskifter forbinder receptor og non-receptor-tyrosinkinase aktivering til downstream cytoplasmatiske eller nukleare hændelser. Hver pattedyrcelle indeholder mindst tre forskellige RAS proto-onkogener koder for nært beslægtede, men særskilte proteiner. RAS-gener kan aktiveres af forskellige punktmutationer herunder også ændring kodoner 12, 13, 61 eller 113-117. Signaltransduktion af ras-proteiner involverer hydrolyse af GTP, og aktiverende mutationer inhiberer denne proces, låse proteinet i “on” signalering konformation [1]. Aktiverende mutationer i disse ras-proteiner resulterer i konstitutiv signalering, hvilket stimulerer celleproliferation, og inhibering af apoptose.

oncogen KRAS-mutationer er fremherskende i stort set alle typer cancer, hvilket gør KRAS en af ​​de hyppigst muterede gener i humane cancere [ ,,,0],2]. RAS-onkogener, sammen med p53 tumor-suppressor-gen, er generne mest konsekvent findes at være muteret i colorektal cancer [3] – [4], hvori epitelceller i fremskridt colorectum fra små adenom gennem store adenom, og endelig bliver adenocarcinom [3].

Talrige undersøgelser har rapporteret frekvensen af ​​KRAS genmutationer i kolorektal cancer. Den største serie var “RASCAL” studie af 2721 kolorektal kræfttilfælde rapportere en forekomst på 37,7% [5]. Sammenlignelige frekvenser blev rapporteret efterfølgende [6] – [8]

Formålet med denne artikel er at rapportere syv nye KRAS-mutationer og åbne døren for yderligere KRAS afprøvning på et stort antal patienter for at vurdere den. prævalens og udforske den nøjagtige prognostisk og prædiktiv betydning af de fundne mutationer samt deres mulige rolle i kolorektal carcinogenese. De nye mutationer blev opdaget, mens efterfølgende studerede forekomsten og mønster af KRAS-mutationer i kræft væv opnået fra 56 Saudi sporadiske kolorektal kræftpatienter fra Eastern Province, og korrelere disse med kliniske funktioner, og p53, EGFR (epidermal vækstfaktor) og HER2 ( human epidermal vækstfaktor receptor2) proteinekspression, og EGFR-genet mutationsstatus. Det var ikke vores hensigt at udforske alle mulige KRAS-mutationer, der kan findes i kolorektal cancer, så vi netop målrettet mutationerne, der almindeligvis er involveret i denne sygdom. Opdagelsen af ​​nye mutationer kom bare tilfældigt, mens de udfører undersøgelsen. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse af mønster af KRAS genmutationer i Saudi patienter med tarmkræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af den Stående Komité for Forskning Etik på Living Creatures (SCRELC), som er IRB i vores institution (autorisationsnummer: IRB-2014-01-324). Det var ikke muligt at opnå skriftligt informeret samtykke fra deltagerne som de fleste af patienterne blev tabt til at følge op. Dette spørgsmål blev drøftet med det udvalg, der enige om, at i overensstemmelse med “Retningslinjer for etisk forskning Practice” [9], samtykke er ikke påkrævet på en retrospektiv undersøgelse, da oplysningerne anvendes af forfatterne var allerede tilgængelig for offentligheden og gjorde ikke afsløre patientens identitet. Desuden undersøgelse nogen risiko for deltagerne.

Fifty-seks sporadiske kolorektale karcinom tilfælde af Saudi patienter blev hentet fra arkiverne i Patologi Institut for Kong Fahd Hospital for universitetet. Sagerne blev udvalgt tilfældigt baseret på tilgængeligheden af ​​kliniske data og repræsentative paraffin væv blokke tilstrækkelige til at udføre de nødvendige procedurer, samt negativ familiehistorie for kolorektal cancer. Tidsrammen dækket var 11 år (1998-2008).

Klinisk og patologisk data

Klinisk og patologisk data, herunder histologiske type, kvalitet og fase af kræft blev indsamlet fra patienternes journaler . Kliniske og patologiske data blev klassificeret ved hjælp af WHO kriterier [10].

immunhistokemisk farvning

immunhistokemisk farvning blev udført for EGFR, HER2 og p53 på 4 um tykke paraffinsnit skåret fra blokke af kolorektal carcinomatøs væv. Farvningen blev udført i en Ventana Benchmark automatiseret immunostainer ifølge producentens instruktioner (Ventana Medical Systems Inc., Strasbourg). Kilder og fortyndinger af de primære antistoffer anvendt i undersøgelsen er vist i tabel S1. De immunofarvede snit blev undersøgt under et lysmikroskop og evalueret manuelt af to patologer. Konkret membran og /eller cytoplasmatisk farvning var nødvendigt at overveje en sag som EGFR eller HER2 /neu positiv, mens nuklear farvning af mindst 10% af de kræftceller var nødvendigt for p53 positivitet (figur S1).

Genomisk DNA-ekstraktion

Fem til otte 10 um tykt formalin-fikseret, paraffinindlejrede cancerøse vævssnit anvendes til at ekstrahere genomisk DNA. Snit blev deparaffineret to gange i 5 minutter i xylen, sekventielt rehydreret i 100, 96 og 70% ethanol i 30 sekunder hver, farvet med hæmatoxylin i 30 sekunder, skyllet med vand og inkuberet natten over i 1 M NaSCN ved 37 ° C til fjernelse tværs links. Objektglas blev skyllet to gange i 10 minutter i 1 × PBS ved stuetemperatur, og fuldstændig lufttørret. Som angivet af en erfaren patolog, blev cancervævet skrabet fra glasset glideflade med en skalpel for at opnå mindst 70% tumorceller og derefter overført til 2,0 ml mikrocentrifugerør. Genomisk DNA blev derefter ekstraheret ved hjælp af WaxFree DNA Kit (TrimGen, Maryland) om gennemførelse af standard protokollen beskrevet af producenten med inkubation natten over i trin 14 af protokollen. Ekstraheret genomisk DNA blev kvantificeret med Epok spektrofotometer og analyseret ved 0,8% agarosegelelektroforese for at visualisere DNA størrelsesfordeling.

I de patienter, der udviste hidtil ukendt KRAS exon 4 mutationer, vi også ekstraheret genomisk DNA fra noncancerous kolorektal væv som beskrevet over. Den noncancerous væv blev opnået fra en tumor fri resektion margin fra kolektomi eksemplar af den samme patient.

PCR-amplifikation af KRAS exon 4

Sekventering blev anvendt til at detektere KRAS exon 4 mutationer som kits til påvisning af A146T – som er den exon 4 mutation rapporteret til at blive almindeligt involveret i colorektal cancer [11] – [12] – var ikke kommercielt tilgængelige. En nested PCR tilgang svarende til den, der er vedtaget af Fadhil, et al [13] blev gennemført for at forstærke og udfører smeltende analyse for exon 4 af KRAS-genet for at kontrollere for vellykkede PCR reaktioner og specificitet. Den første PCR-runde blev gennemført i et slutvolumen på 25 pi. Hver reaktion indeholdt 1 × QIAGEN Multiplex PCR Master Mix, 0,5 × Q-opløsning, 2 primerpar (tabel 1), der dækker hotspots i KRAS exon 4 med 0,3 uM slutkoncentration for hver primer og 10 ng template-DNA. PCR blev udført under anvendelse af ABI s Veriti Thermal Cycler (Life Technologies) i 15 minutter ved 95 ° C, 40 cykler på hver 30 sekunder ved 94 ° C, 90 sekunder ved 55 ° C og 90 sekunder ved 72 ° C, efterfulgt af 10 minutter ved 72 ° C. Efter tilsætning af 2 pi (5 x) loading dye, 10 pi af hver amplificeret prøve blev elektroforesebehandlet på en 2% TBE agarose ethidiumbromid-farvet gel og visiualized med GelDoc system fra Biorad.

Høj opløsning smeltekurveanalyse (HRM) blev udført under anvendelse nested PCR reaktion i et endeligt volumen på 15 pi, der indeholdt 1 × HRM Master Mix (Qiagen) og 1 primerpar specifikt for exon 4 (tabel 1) med hver primer ved 0,7 uM slutkoncentration . Skabelonen bestod af 1,5 pi af en 1:100 fortynding af produktet fra den første runde PCR-reaktion. Nested PCR-reaktion blev udført som beskrevet i brugsanvisningen for HRM Type-det Kit (Qiagen).

HRM bruges til at vurdere dissociation (smeltning) kendetegn for dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Basepar sammensætning og GC-indhold indflydelse smelteadfærd forskellige dsDNA fragmenter. Under HRM, er dsDNA udsættes for gradvist stigende temperatur i nærvær af et fluorescerende farvestof (fx EvaGreen). Det fluorescerende farvestof fluorescerer kun når de er bundet til dsDNA. Fluorescens overvåges under overgang dsDNA til enkeltstrenget DNA (ssDNA), der falder som dsDNA smelter. Viser ændringerne i fluorescens efter generering af specifikke DNA-fragmenter under PCR giver anledning til enkelte toppe svarende til specifikke amplikoner [14].

DNA sekventering

Efter HRM, succesfulde og specifikke PCR-produkter viser en smeltetop var kolonne oprenset ved anvendelse af QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. PCR-produkterne blev elueret med 30 pi elueringspuffer og fortyndes 1:10 med vand. Fortyndede PCR-produkter blev derefter anvendt som template til cyklus-sekventering via Big Dye Terminator v1.1 kit (Applied Biosystems). Tovejs sekventering (dvs. fremad og tilbage) blev udført under anvendelse cyklus sekventering reaktion (10 pi slutvolumen) bestående af 1 × terminator forblanding, 1 × sekventering puffer, 0,4 uM af enten M13-F eller M13-R-primere (tabel 1) og 4 pi fortyndet template. Reaktionerne blev kørt på Veriti (Life Technologies) ifølge den følgende protokol: En cyklus på 95 ° C i 15 minutter; 30 cykler ved 95 ° C i 10 sekunder, 55 ° C i 5 sekunder, 72 ° C i 4 minutter. Sekventeringsreaktioner blev renset med ABI s BigDye XTerminator Purification Kit (Life Technologies) og lastet på en 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies). Sekventering blev analyseret ved hjælp Sequencing Analysis V5.4 og SeqScape v2.7 software (Life Technologies).

flyttet opsigelse analyser (STA)

STA er baseret på primer-forlængelse metoder, hvor 3 oligonucleotider (2 til amplifikation og 1 for mutationsdetektering) anvendes til at påvise en specifik mutation. Men STA udnytter inkorporering af flere mærkede nukleotider til påvisning primer som sammenlignet med inkorporering af et enkelt mærket nukleotid i andre primer-forlængelse-baserede metoder. Påvisning primer annealer én base før målområdet og derefter kun forlænges, når målområdet er muteret. Udvidelse af afsløring primer med flere mærkede nukleotider intensiverer signal og øger PCR-fragment længde tillader mutation diskrimination fra vildtype via peak farve og fragment størrelse efter kapillarelektroforese [15].

Vi brugte Mutector II Mutation Detection Kits (TrimGen, Maryland) at identificere mutationer i codon 12, 13 og 61 i KRAS-genet, som er de KRAS-mutationer indberettet som oftest er involveret i kolorektal cancer [11] – [12], samt specifikke mutationer af EGFR-genet i karakteristiske steder i exonerne 18-21, herunder visse punktmutationer, deletioner og insertioner, som identificerer patienter, der er mest tilbøjelige til at reagere på målrettet lungekræft behandling, herunder tyrosinkinaseinhibitorer erlotinib og gefitinib. De Mutector II Mutation Detection Kits gennemføre STA teknologi til samtidig påvisning og differentiering af mutationer forekommer på samme målsted. Mutector II Mutation Detection Kit GP05-CM finder og adskiller alle 12 mutationer, der forekommer i codon 12 og 13, mens Mutector II Mutation Detection Kit GP06 er designet til 5 mutationer forekommer i codon 61. Mutector II Mutation Detection Kit GP07-02 registrerer mutationer i karakteristiske steder i exon 18-21 af EGFR-genet. STA teknologi forbedrer følsomheden betydeligt. Den detekterer så lav som 1% somatiske mutationer sammenlignet med 15-20% via Sanger-sekventering [15]. Kort fortalt, 50 ng gDNA blev PCR-amplificeret ved anvendelse af reagenser tilvejebragt via PCR betingelserne beskrevet af fabrikanten. PCR-produkter blev renset og mutationer i kodonerne 12, 13, og 61 blev beriget separat ved mutation specifik primerforlængelsesreaktion. Prøver indeholdende berigede mutationer blev renset fra overskydende fluorescerende farvestoffer, fortyndet 5-10 gange med vand. Tre mikroliter af de fortyndede primerforlængelsesprodukter blev blandet med lastning buffer leveres i kit og fragmentet størrelse via kapillær elektroforese på ABI s 3500 Genetic Analyzer (Life Technologies). Kapillærelektroforese kører betingelser og instrument setup for dataindsamling er forklaret i detaljer i Mutector II Mutation Kit brugsanvisning.

Funktionel forudsigelse og molekylær modellering af nye KRAS mutationer

Den funktionelle betydning af den ikke -synonymous (proteinstruktur ændre) exon 4 mutationer blev vurderet ved hjælp POLYPHEN-2 (polymorfi fænotypebestemmelse v2) [16] og SIFT (sortering intolerante fra tolerante værktøjer) [17]. Vi bruges også mutationen bedømmer [18] til at forudsige den funktionelle virkning af mutationer baseret på evolutionære konservering af den påvirkede aminosyre i proteinhomologer. Desuden blev molekylær modellering anvendt til at forudsige den funktionelle betydning af de nye mutationer detekteret. K-ras-protein struktur anvendes til modellering blev opnået fra Protein Data Bank (PDB ID: 3gft). Modellering af mutationer blev udført og visualiseret ved hjælp PyMOL [19] – [20]. PyMOL viser oplysninger om alle sterisk interferens mellem den muterede aminosyre og andre aminosyresidekæder og konfigurationen med den mindste steriske interferens vælges manuelt. De mutante sidekæder blev modelleret i positioner af proteinet under anvendelse af rotamerer med laveste modstridende Van der Waals radier og konfigurationen med den mindste steriske interferens med andre aminosyresidekæder. Den vilde type og mutant proteinstruktur blev overlejret at fremhæve de forudsagte konformationelle ændringer forårsaget af hver mutation.

blev udført Statistisk analyse

Dataanalyse hjælp SPSS for Windows-version 17,0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Resultaterne var cross-tabuleret at undersøge forholdet mellem variablerne. Statistisk analyse for kategoriske variabler blev udført ved hjælp af χ-square til test af foreningen og Fishers eksakte test efter behov. Hvor to kontinuerte uafhængige variabler blev undersøgt, blev t-test og variansanalyse anvendes. En p-værdi på mindre end 0,05 anses signifikant i alle statistiske analyser.

Resultater

Novel KRAS-mutationer

KRAS genmutationer blev påvist i kræftvæv på 24 ud af 56 undersøgte tilfælde (42,85%). Af disse 11 (19.64%) havde exon 4 mutationer lokaliseret mellem kodoner 134 og 150, mens 13 (23,21%) havde mutationer i exon 2, der påvirker kodoner 12 og 13. Mutationer blev ikke påvist i codon 61 i exon 3. Fordelingen af mutationer i vores kohorte er vist i tabel S2.

De 11 tilfælde med exon 4 aberrationer husede 8 forskellige mutationer (tabel 2), hvoraf en tidligere var rapporteret (p.Ala146Thr, en missense mutation) og 7 var roman som afsløret af COSMIC database tilgås på 19/09/2014. Vi bekræftede alle hidtil ukendte sekvensvariationer detekteret i vores kohorte ved sekventering af modsatte streng. Alle prøver viste en identisk sekvens variation i den modsatte streng. Den svagt signal i prøven 33 (figur 1) kunne tilskrives lavere tumorvæv indhold; den anden (forreste) streng viste også et svagt signal af sekvensen variation (c.404G A) samt. Men sekventering af noncancerous patientens væv viste ingen overhovedet for variation c.404G A indikerer, at signalet i prøven er over detektionsgrænsen af ​​sekventering protokol. En af de hidtil ukendte mutationer (G138G) blev påvist hos tre patienter, og en anden (Q150X), detekteres i to andre patienter. Fire af de syv mutationer var missense mutationer ændrer aminosyresekvensen af ​​proteinet (A134V, R135K, E143K og R149G), mens to mutation var synonyme (G138G og K147K) og én, en nonsense beskærer mutation (Q150X). De missense og vrøvl exon 4 mutationer blev observeret i syv patienter (12,5% af det samlede beløb). Figur 1 er et elektroferogram for KRAS exon 4 nonsense og missense mutationer, trunkerede eller ændrede KRAS-proteinet aminosyresekvensen hhv. Prøverne 32 og 45 indeholdt også en anden mutation (p.Gly12Asp) i codon 12 exon 2 som afsløret ved STA analyse, der ofte blev fundet i patienter med tyktarmskræft (Figur 2). De hidtil ukendte exon 4 KRAS-mutationer viste sig at være somatisk da sektioner af noncancerous kolorektal væv fra patienter, der nærede disse mutationer viste vildtypesekvensen (figur 1).

Alle viste mutationer blev bekræftet via sekventering af fremad-strengen. Prøve nummer og mutation nomenklatur i henhold til lastbiler retningslinjer er fremhævet over hver mutation. Pile peger på placeringen af ​​basepar ændring

Bundplade er for prøve 32 viser den 2nd røde top (GGT GAT). Og den 3. sorte top (vildtype)

den funktionelle virkning af de ikke-synonyme mutationer på KRAS-proteinet blev vurderet ved anvendelse bioinformatik værktøjer og resultaterne er vist i tabel 3. for eksempel er E143K og Q150X mutationer forudsagt at have en skadelig og høj effekt på proteinet mens R135K forventes at blive tolereret eller at have neutral effekt på protein. Derudover brugte vi molekylær modellering til at vurdere funktionel virkning af disse hidtil ukendte KRAS mutationer og resultaterne er vist i figur 3. Den molekylære modellering af data passer med forudsigelsen fra POLYPHEN-2 og støvtætte, samt bevarelse data (tabel 3). For eksempel er R135K mutation forudsiges at være godartede og modellering viste også lidt forudsagte effekt på proteinstruktur. De resterende mutationer forventes at forårsage betydelige ændringer i proteinstruktur i overensstemmelse med den forventede skadelige effekt ved POLYPHEN-2.

Vild type (WT) KRAS er vist i blå farve og mutant proteiner er vist i gult . Sidekæderne af aminosyrer er vist med grønt for WT-rester og rød for de mutante rester. a) WT K-RAS viser sidekæde af A134 (grøn). b) Overlapning af WT og mutant A134V KRAS viser forudsagte konformationelle ændringer forårsaget af A134V-mutationen (bemærk ændringerne i helixen og beta-sheet). c) Overlapning af WT og mutant R135K KRAS viser forudsagte konformationelle ændringer forårsaget af R135K mutationen (bemærk ændringer i helix og loop kæder), men påvirker ikke GTP bindende lomme. d) Overlapning af WT og mutant E143K KRAS som frembyder forudsagte konformationelle ændringer forårsaget af E143K-mutationen (bemærk ændringerne i løkken nær GTP bindende lomme). e) Overlapning af WT og mutant T144I KRAS som frembyder forudsagt konformationelle ændringer forårsaget af T144I mutationen (bemærk ændringerne i GTP bindende lomme og ændringer i retningen af ​​den bundne GTP, grøn er wt og rød er mutant). f) Overlapning af WT og mutant R149G KRAS som frembyder forudsagt konformationelle ændringer forårsaget af R149G mutationen (bemærk ændringer i helix og loop kæder nær GTP bindende lomme). g) Overlapning af WT og mutant Q150X KRAS som frembyder forudsagt konformationelle ændringer forårsaget af Q150X mutationen (bemærk ændringerne i loop kæde).

Punktmutationer specificeret af EGFR mutation afsløring kit i exon 18, 20 og 21 i EGFR-genet, blev ikke påvist i nogen af ​​de 56 undersøgte tilfælde. InDel mutationer i exon 19 og 20 blev heller ikke opdaget.

De vigtigste kliniske, patologiske og immunhistokemiske fund i de rapporterede tilfælde er vist i tabel 4. Tabel 5 og 6 viser en forekomst af kvindekønnet i sager med romanen KRAS-mutationer i forhold til sager med andre KRAS mutationer og KRAS mutation negative sager (70%, 42,8% og 43,75%, henholdsvis). De viser også lavere forekomst af lymfeknudemetastase og p53-ekspression, selv om forskellene ikke er statistisk signifikant (p-værdi i området mellem 0,078 og 1,0). Vi fandt ikke EGFR eller HER2 protein udtryk, eller EGFR genmutationer i nogen af ​​de 10 sager. Der var heller ingen signifikant forskel mellem de tre grupper med hensyn til patientens alder, og tumorstørrelse, dybde og kvalitet. Vejviser

Tre af de fem patienter huser de skadelige mutationer havde mere avanceret sygdom med øget tumor dybde og lymfeknude metastaser (sager 32, 45 og 51), mens to havde lokaliseret sygdom (sager 41 og 48).

De to tilfælde med samtidig exon 2 mutation (sager 32 og 45) viste større tumorstørrelse og dybde i forhold til de fleste andre tilfælde med hidtil ukendte mutationer og også havde lymfeknudemetastaser.

Discussion

Aktivering af KRAS oncogenet har været impliceret i colorektal carcinogenese, idet muteret i 30-40% af adenocarcinomer [5] – [8], en prævalens svarende til den, observeret i den foreliggende undersøgelse (42,85%). MRNA-transkriptet af KRAS-genet består af 5765 baser, der koder for 188 aminosyrer. Exon 1, 2, 3, 4 og 5 indeholder 181, 122, 179, 160, og 5123 baser, henholdsvis [21]. Størstedelen af ​​somatiske mutationer forekommer ved kodon 12 og 13 (beliggende i exon 2). Andre mindre hyppige mutationer forekommer i exon 3 (kodoner 59/61) og exon 4 (kodoner 117/146) [22] – [23]. Ca. en tredjedel af tarmkræft nærede mutationer på G12 og G13 codon mens exon 4 mutationer codon 117 og 146 blev påvist i kun op til 5,5% af tumorer [24]. Vores undersøgelse viste en meget lavere forekomst af exon 2 mutationer (23,21%) og en meget højere forekomst af exon 4 mutationer (19.64%) med exon 4 mutationer lokaliseret mellem kodoner 134 og 150 i stedet involverer kodoner 117 og 146.

exon 4 KRAS-mutationer er undervurderet, da alle bestræbelser på klinisk afprøvning med fokus på exon 2 (codon 12 og 13) og exon 3 (codon 61) mutationer [22] – [25]. Alle syv nye KRAS mutationer rapporteret i denne artikel fandt sted i exon 4 og lokaliseret mellem codon 134 og 150. Således foreslår vi bl.a. codon 134-150 som et hotspot for rutinemæssig KRAS mutationsanalyse i kolorektal cancer patienter, snarere end kun at fokusere på codon 117 og 146. Vi har detekteret missense og vrøvl exon 4 mutationer i 12,5% af de sager, der er højere end hvad der tidligere blev rapporteret, som beløb sig til 10%, men også omfattede exon 3 og de nationale tilsynsmyndigheder i tillæg til exon 4 mutationer [24]. Alle hidtil ukendte mutationer viste sig at være somatisk da alle dele af noncancerous kolorektal væv fra de 10 tilfælde, der nærede mutationerne viste vildtypesekvensen.

Den funktionelle virkning af de hidtil ukendte ikke-synonyme mutationer på KRAS-proteinet var vurderet ved anvendelse bioinformatiske værktøjer og molekylær modellering (tabel 2 TAG) bestemmelse af en tidlig stopsignal ved codon 22 (Gln22Stop) er tidligere blevet fundet i en patient med metastatisk colorektal cancer ved Palmirotta et al [27]. BRAF og p53-gener blev ikke fundet, der skal ændres, og mikrosatellit instabilitet ikke var til stede. Patienten blev imidlertid fundet at være ikke reagerer på et anti-EGFR behandling. Interessant vores to patienter, der huser beskærer mutation var EGFR negative ved IHC. De havde også ingen EGFR genmutationer. Flere prækliniske [28] og klinisk [29] undersøgelser har vist, at forekomsten af ​​KRAS mutationer i colorektal cancer er en uafhængig forudsigende parameter for EGFR målrettet terapi modstand. Endelig, skønt de synonyme roman exon 4 mutationer rapporteret i den foreliggende undersøgelse (herunder G138G mutation, der blev påvist i tre patienter) ikke ændrede protein aminosyresammensætning, kan de stadig vise sig signifikant i tumorogenesis. Der er stigende tegn på, at synonyme mutationer (ofte fejlagtigt omtalt som “tavse”) kan påvirke transkription, splejsning, mRNA transport og oversættelse, som alle kunne ændre fænotype, hvilket gør synonym mutation ikke-tavs [30].

Vi har detekteret en af ​​de nye mutationer i tre tilfælde (G138G) og en anden i yderligere to tilfælde (Q150X). Vores prøvestørrelse er temmelig lille til at foretage frekvens analyse og sammenligning med større offentliggjorte undersøgelser. det faktum, at disse nye mutationer blev set i 5/56 tilfælde viser dog, at yderligere undersøgelser skal gøres.

EGFR er over udtryk på mange typer af kræft, især tyktarmskræft, og synes at afspejle mere aggressiv histologiske og kliniske adfærd [31]. Det er også blevet vist, at p53-protein-overekspression kan hjælpe i potentielt forudsige metastatisk spredning til lymfeknuderne i colorektal cancer [32]. Baseret på sådanne oplysninger, den lave forekomst af lymfeknudemetastase og p53-ekspression i vores patienter, der huser de hidtil ukendte mutationer kombineret med fraværet af EGFR og HER2-protein-ekspression og EGFR-genet kan mutationer generelt vist et low-grade vej hos kolorektal kræft udvikling i de patienter, der sandsynligvis er også modstandsdygtige over for anti-EGFR og anti-HER2-terapi. Denne spekulation er i tråd med den konstatering, at mutationer i exon 4 af KRAS forudsige for en mere gunstig klinisk resultat hos patienter med kolorektal cancer [24]. Ironisk nok, fire af de syv nye exon 4 mutationer fundet i nærværende undersøgelse forventes at være skadelige for KRAS protein som afsløret ved molekylær modellering. Desuden er det kun tre ud af de fem patienter, der huser de skadelige mutationer havde mere fremskreden sygdom med øget tumor dybde og lymfeknudemetastaser (tilfælde 32, 45 og 51), mens to havde lokaliseret sygdom (tilfælde 41 og 48)! Kunne nogle af de fundne mutationer alternativt have en gavnlig snarere end en skadelig virkning på værten, muligvis tilskrives miljøfaktorer? Det er for nylig blevet klart, at mutant ras kan resultere i meget forskellige konsekvenser i forskellige væv og miljøer [33].