PLoS ONE: Identifikation af sAPRIL Binding peptid og dens væksthæmning effekter i Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

En proliferationsinducerende ligand (april) er medlem af tumoren nekrose faktor (TNF) super familie. Det binder sig til dets specifikke receptorer og er involveret i flere processer under tumorigenese og tumorceller spredning. Høje niveauer af April ekspression er tæt korreleret til vækst, metastase, og 5-FU lægemiddelresistens af colorektal cancer. Formålet med denne undersøgelse var at identificere en specifik APRIL bindingspeptid (BP) i stand til at blokere APRIL aktivitet, der kan anvendes som en potentiel behandling af kolorektal cancer.

Metoder Salg

Et fag-display-bibliotek blev anvendt til at identificere peptider, der bandt selektivt til opløseligt rekombinant humant april (sAPRIL). Peptiderne med den højeste bindingsaffinitet for sAPRIL blev identificeret under anvendelse af ELISA. Virkningerne af sAPRIL-BP om celledeling og cellecyklus /apoptose

in vitro

blev evalueret ved brug af CCK-8 assay og flowcytometri hhv. En

in vivo

musemodel af colorektal cancer blev anvendt til bestemmelse af anti-tumor effekt af sAPRIL-BP.

Resultater

Tre kandidatpeptider blev karakteriseret fra otte fag kloner med høj bindingsaffinitet for sAPRIL. Peptidet med den højeste affinitet blev udvalgt til yderligere karakterisering. Det identificerede sAPRIL-BP undertrykte tumorcelleproliferation og cellecyklusprogression i LoVo celler på en dosisafhængig måde.

In vivo

i en mus kolorektal udfordring model, den sAPRIL-BP reducerede væksten af ​​tumorxenoplantater i nøgne mus ved at hæmme proliferation og inducere apoptose intratumoralt. Desuden i en

in vivo

metastase model, sAPRIL-BP reducerede levermetastaser af kolorektal cancer celler.

Konklusioner

sAPRIL-BP signifikant undertrykte tumorvækst

i vitro

in vivo

og kunne være en kandidat til behandling af kolorektal kræft, der udtrykker høje niveauer af april

Henvisning:. Han XQ, Guan J, Liu F, Li J, han Hr (2015) Identifikation af sAPRIL Binding peptid og dens væksthæmning effekter i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 10 (3): e0120564. doi: 10,1371 /journal.pone.0120564

Academic Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, TAIWAN

Modtaget: August 1, 2014 Accepteret: 5 februar 2015; Udgivet: Marts 31, 2015

Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af Genstand for Guangzhou Videnskab og Teknologi planlagte projekter (2012J4300091)

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige fordøjelsesforstyrrelser kræftformer i hele verden og patienter ofte dør af kræft celle metastaser [1]. Traditionel kemoterapi har ulemper, herunder, forskellige grader af celle cytotoksicitet og forbi mål effekter, der kan skade sundt væv, disse bivirkninger har en skadelig virkning på patientens livskvalitet. Det er afgørende at udvikle en målrettet kræftbehandling, der har lav cytotoksicitet og er meget selektiv at forbedre prognosen og overlevelsesraten for patienter med tarmkræft.

En proliferationsinducerende ligand (april) er en ligand i tumor nekrose faktor (TNF) superfamilien, der fungerer som et opløseligt faktor [2]. April er primært udtrykt af hæmatopoietiske celler og har biologiske roller i B-celle overlevelse og celle-aktivering T [3-5]. Normale væv udtrykker meget lave APRIL dog cancercellelinier og tumorer, såsom fordøjelsessystem cancer, hæmatologiske malignitet og urotelial cancer, udtrykke høje niveauer APRIL [6-9]. April er involveret i flere proces relateret til tumorigenese såsom fremme tumorcelleproliferation og overlevelse i forskellige typer af kræft [10-14]. I kolorektal cancer, er høj ekspression APRIL tæt korreleret med tumorvækst, metastase, og 5-fluoruridin (5-FU) resistens [12, 13, 15].

April udøver sine biologiske funktioner ved at interagere med flere receptorer. Kendte APRIL receptorer indbefatter B-celle modning antigen (BCMA), transmembrane aktivator og cyclophilin-ligand interaktions (TACI), og heparinsulfat-proteoglycaner (HSPGs) [7, 16]. BCMA primært udtrykt på modne B-lymfocytter [17], men er også overudtrykt på myelomatose celler [18]. TACI udtrykkes primært på modne B-celler og plasmaceller [19], og HSPGs er bredt udtrykt på overfladen af ​​mange pattedyrceller [20]. Efter binding til disse receptorer APRIL forbedrer proliferation, eller undertrykker apoptose at fremme tumorudvikling via flere molekylære mekanismer. I kronisk lymfatisk leukæmi (B-CLL), opløselig APRIL stimulerer NF- μB aktivering, og beskytter B-CLL-celler fra spontan eller lægemiddel-induceret apoptose [21]. I ikke-Hodgkins lymfom (NHL) B-celler, rekombinant APRIL aktiverer NF- μB, opregulerer anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-XL, og nedregulerer pro-apototic protein Bax at inhibere apoptose [14]. I gliomaceller, ektopisk ekspression APRIL giver beskyttelse fra døden ligand /receptor-medieret apoptose muligvis ved opregulering anti-apoptotisk protein X-linked inhibitor af apoptose protein (XIAP) [22]. I myelomatose, april fremmer cellecyklusprogression ved at øge S-fasen og G

2-M fase [23]. I humane kolorektale cancerceller, vælte APRIL hjælp RNA interferens blokke transformerende vækstfaktor (TGF) -μ1 signalering og aktivering af ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK) at fremkalde cellecyklusstop og apoptose [24].

målretning april til undertrykke tumorvækst, proliferation og overlevelse kunne være en mulig strategi til behandling af kolorektal cancer. Andre har vist, at lukke munden APRIL reducerer tumorcelleproliferation og metastase i kolorektal cancer [25-27]. Vi har tidligere vist, at nedregulering APRIL reducerer proliferation, øger apoptose, og forbedrer følsomhed over for 5-FU kemoterapi i kolorektal cellelinie LOVO, som udtrykker høje niveauer APRIL [28]. Gao

et al

. har med succes udviklet en anti-april monoklonalt antistof og demonstreret sin anti-proliferativ effekt

in vitro

in vivo

[29]. Andre grupper har brugt rekombinante sAPRIL receptorer eller mutant sAPRIL at konkurrere med endogent sAPRIL om binding til dens receptorer [30, 31]. Sammenlignet med andre strategier til målretning april, såsom siRNA eller anti-APRIL-antistoffer, polypeptider har flere fordele, herunder lav immunogenicitet, en høj grad af sikkerhed, let syntese og oprensning, evnen trænge ind til væv og organer, og mindre toksicitet. Identifikation og syntetisere anti-tumor polypeptider er blevet et populært strategi for udvikling målrettede anti-cancer behandlinger [32, 33]. Der er dog ikke APRIL specifikke polypeptider blevet rapporteret til dato. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at identificere sAPRIL specifik binding peptider ved hjælp af en fag-display-bibliotek, og vurdere dens

in vitro

og

in vivo

anti-cancer effekter til at give en terapeutisk kandidat til brug mod tarmkræft, der udtrykker høje niveauer af april

Materialer og metoder

In vitro panorering

human rekombinant sAPRIL (R streptomycin ved 37 ° C med 5% CO

2.

In vivo model

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer, og godkendt af Animal Care og brug Udvalg på Nanfang hospital. BALB /c nøgne mus (4-6 uger gamle) blev erhvervet fra Guangdong Medical Laboratory Animal Center og holdt under gnotobiotiske betingelser. LoVo-celler (2 x 10

6 celler i 100 pi PBS) blev injiceret subkutant (100 pi /injektion; injektionssted /tumor) og tumorstørrelsen blev målt hver 3. dag. Efter 3 uger blev den subkutane knude betragtes som en tumor, når den nåede 100-200 mm

3. Musene blev inddelt i tre grupper og injiceret intratumoralt med PBS (kontrol), 20 mg /kg sAPRIL-BP (lav dosis), eller 40 mg /kg sAPRIL-BP (høj dosis) hver anden dag i to uger. Tumorvolumen (V) blev beregnet ved anvendelse af formlen: V = AB

2/2, hvor A er den maksimale diameter, og B er diameteren vinkelret på den linje A.

For kolorektal cancer levermetastaser model, LoVo celler (2×10

6 celler /100 pi) blev injiceret i milten efter laparotomi. Tre uger efter injektion blev mus randomiseret til 3 grupper (n = 5) og intraperitonealt injiceret med PBS (200 pi) som en kontrol, den lave dosis sAPRIL-BP (20 mg /kg), eller høj dosis af sAPRIL- BP (40 mg /kg) på dag 22, 24, 26, 30, 32, og 34 efter tumorinjektion. Mus blev aflivet på dag 35. Leverne blev høstet, og antallet og størrelsen af ​​metastaseret knuder blev bestemt.

Reverse transcriptase polymerase kædereaktion (RT-PCR)

RNA fra kolorektal cancercelle linjer blev ekstraheret med Trizol (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. RNA fra hver prøve blev anvendt til cDNA-syntese under anvendelse RevertAID kit (Fermentas, Canada). PCR blev udført under anvendelse af PCR Premix (SBS Genentech Kina). Primersekvenserne for april var: forward 5′-AGAAGAAGCAGCACTCTGTC-3 ‘og revers 5′-CCATGTGGAGAGAGGTTAAG-3′ (produkt 394 bp). GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. GAPDH-primere var: forward 5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3 ‘og revers 5′-AGGGTCTACATGGCAACTG-3’ (produkt 240 bp). PCR-reaktionsbetingelserne var: 95 ° C i 3 minutter, 94 ° C i 50 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 min, i 32 cyklusser, efterfulgt af forlængelse ved 72 ° C i 7 min. PCR-produkterne blev separeret ved anvendelse af agarosegelelektroforese og visualiseret med UV-bestråling.

Western Blotting

Western blotting blev udført ifølge standardprotokoller. De anvendte antistoffer var imod APRIL cyclin D1, cyclin A, cyclin E, cyclin B1, CDK4, CDK6, p53, p27, og p16 (1: 1000, Abcam, USA) og kanin-anti-GAPDH (1: 2000, ZSGB- BIO, Kina).

Celleproliferationsassay

LoVo og SW620-celler blev podet i 96-brønds dyrkningsplader (2 × 10

3 celler /brønd) i et volumen 200 pi overnight . Fem doser af rekombinant sAPRIL bindende peptid (5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, og 80 uM) blev tilsat i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Celleproliferation blev bestemt under anvendelse af CCK-8 kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Kina) ifølge producentens instruktioner.

Cell cyklus og apoptose analyse

LoVo-celler blev podet i 6-brønds kultur plader (1 × 10

5 celler /brønd /ml). Efter 24 timer sAPRIL bindende peptid (20 uM eller 40 uM) blev tilsat i yderligere 48 timer. For cellecyklusanalyse ved flowcytometri (BD LSR flowcytometer, BD Biosciences, USA), blev cellerne høstet og fikseret med 7% ethanol i 24 timer ved 4 ° C. Efter vask med PBS blev cellerne farvet med propidiumiodid (PI) (50 ug /ml PI, 100 ug /ml RNAse A, 0,2% Triton X-100) i 30 minutter ved 4 ° C. Dataene blev analyseret ved anvendelse af Modfit LT. For apoptose analyse ved flowcytometri blev de høstede celler farvet med en apoptose detektion kit (Beyotime, Kina) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev cellerne farvet med 500 pi bindingspuffer, 5 pi Annexin V-FITC, og 5 pi PI for 5-15 minutter ved stuetemperatur i mørke.

Immunhistokemi farvning

Alle xenotransplantattumorer blev fikseret med 10% formalin og paraffin-indstøbt til sektionering. For antigen hentning blev vævssnittene anbragt i en 0,01 M citratpuffer ved pH 6,0 og derefter opvarmet ved 98 ° C til 100 ° C i 15 min i en mikrobølgeovn. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubering af sektionerne i 3% hydrogenperoxid (i frisk methanol) i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter vævssnit blev farvet med primære antistoffer specifikke for Ki-67 (1: 100, Abcam, USA) og spaltet caspase-3 (1: 200, CST, USA). En konjugeret kanin-anti-muse-IgG sekundært antistof (1: 200, Abcam, USA) blev anvendt. Positiv farvning blev visualiseret med DAB. Billeder blev taget med et Olympus BX41 lysmikroskop. Procentdelen af ​​Ki67-positive tumorceller (proliferative indeks) og procentdelen af ​​spaltede caspase-3-positive tumorceller (apoptose indeks) blev bestemt for tre separate felter med mindst 1000 naboceller for hvert objektglas.

Statistik

Alle resultater blev analyseret med SPSS-version 17.0 software. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) med mindre andet er angivet. Statistisk signifikans blev vurderet ved anvendelse af en envejs ANOVA eller to-halet t-test. Forskellen mellem grupperne blev betragtet som signifikant, når

s

. 0,05

Resultater

Identifikation af specifikke sAPRIL-bindende peptid

Et fagbibliotek blev anvendt at identificere 20 enkelte kloner, der udtrykker potentielle sAPRIL bindende peptider. Klonerne blev tilfældigt udvalgt efter fire runder af panning. Otte enkelte kloner blev identificeret som “positiv” indikerer en høj bindingsaffinitet (defineret som en OD ≥6 gange OD af den positive kontrol) for sAPRIL ved ELISA (Fig 1A). De otte kloner repræsenterede tre DNA-sekvenser der svarer til følgende bindende polypeptider (BP): AAAPLAQPHMWA, SSTTTSDKYLSA, og SNLHDNNTEKNV (tabel 1). Affiniteten for sAPRIL blev målt for hvert polypeptid ved ELISA og sammenlignet med et ubeslægtet polypeptid (HWDPFSLSAYFP) som en negativ kontrol. De tre peptider identificeret ved anvendelse fagbiblioteket havde sAPRIL bindingsaffiniteter, der var 13,7, 10,8, og 9,3 gange højere end kontrollen peptid (fig 1B). Bindingsaffiniteten af ​​sAPRIL-BP’er blev også testet mod en anden TNF superfamilien ligand BAFF (B-celle-aktivering faktor TNF-familien). Bindingsaffiniteterne for hver sAPRIL-BP var 1,2, 1,1 og 0,9, (fig 1B). Tilsammen disse resultater viste, at sAPRIL-BPs binder specifikt til april og ikke krydsreagerer med BAFF. sAPRIL-BP1 (AAAPLAQPHMWA) havde den højeste bindingsaffinitet og blev efterfølgende brugt

in vitro

at vurdere, om det var i stand til at hæmme sAPRIL bindende i den faste humane kolorektal cancer cellelinje LoVo celler (Fig 1C). sAPRIL-BP1 viste en dosisafhængig inhiberende virkning på sAPRIL binding til LoVo celler. Derfor blev sAPRIL-BP1 (herefter sAPRIL-BP) udvalgt til yderligere funktionel karakterisering.

(A) Bindingsaffiniteten af ​​fagkloner No.1-20 for sAPRIL blev bestemt ved ELISA. Klon 21 blev anvendt som en positiv kontrol. Folden ændring af den optiske densitet blev normaliseret til den positive kontrol. Kloner, der havde mindst 6 gange større affinitet end den positive kontrol blev betragtet “positiv” for sAPRIL binding. (B) tre bindingspeptider blev syntetiseret og deres bindingsaffinitet med sAPRIL (sorte søjler), blev bestemt og sammenlignet med den negative kontrol (NC) ved anvendelse af ELISA. Krydsreaktivitet blev vurderet ved måling af bindingsaffiniteten til BAFF (grå søjler). (C) Klon BP1 (sAPRIL-BP) blev blandet med sAPRIL i forskellige doser til at konkurrere om binding med faste LoVo celler.

Anti-proliferative virkninger af sAPRIL bindende peptider i LoVo celler

for at vurdere betydningen af ​​april kolorektal cancer, var april udtryk undersøgt i fem humane kolorektale cellelinjer ved RT-PCR (fig 2A og 2B) og vestlige blotting (fig 2C og 2D). Den HCT116 og LoVo cellelinjer havde signifikant højere niveauer af April mRNA (

s

0,05) og protein (

s

0,05) end SW480, SW620, og HT29 cellelinier. Derfor blev virkningen af ​​sAPRIL-BP evalueret i LOVO og HCT116 (April

høj) celler, og SW620 og HT-29 (April

Lav) celler. For at bestemme om der var dosis effekter, blev celleproliferation målt ved forskellige koncentrationer af sAPRIL-BP. Hastigheden af ​​proliferation var signifikant hæmmet (

s

0,05) ved behandling med sAPRIL-BP i LOVO og HCT116 celler (Fig 3A) i en tids- og dosisafhængig måde. Men dette var ikke tilfældet i SW620 og HT-29-celler (Fig 3B). Der resultater antyder, at anti-proliferative virkninger af sAPRIL-BP er specifikke for april

høje celler.

April ekspression blev vurderet i fem humane kolorektale cellelinjer (angivet) under anvendelse af RT-PCR (A) og Western Blotting (C). Repræsentative gelbilleder vises. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. De optiske densiteter af April mRNA (B) og protein (D) bånd blev analyseret og normaliseret til den interne kontrol. *

P

. 0,05 sammenlignet med SW620, HT-29, eller SW480

(A) April

høj LOVO og HCT116 celler og (B) April

lav SW620 og HT-29-celler blev behandlet med de angivne doser af sAPRIL bindende peptider i 24, 48 og 72 timer, og proliferation blev bestemt ved anvendelse af CCK-8 kit. Satsen for spredning hæmning blev beregnet som: (%) = [(gennemsnit af OD

kontrol-gennemsnit af OD

eksperimentel) /gennemsnit af OD

kontrol] x 100%

.

Virkninger af sAPRIL bindende peptider på cellecyklus og apoptose i LoVo celler

Da proliferation af cancerceller primært er reguleret af cellecyklusen, vi næste afgøres, hvilken fase af cellecyklussen blev påvirket af sAPRIL behandling. Baseret på proliferationen resultater (Fig 3A), vi valgte at teste 20 uM og 40 uM sAPRIL-BP i LoVo-celler for at bestemme, hvordan inhibering sAPRIL ændret cellecyklus og apoptose. Ved flowcytometri, sAPRIL-BP steg betydeligt procentdelen af ​​celler i G

0 /G

1 fase ved den lave dosis (20 uM sAPRIL-BP: 73,1 ± 0,6%;

s

0,001) og den høje dosis (40 uM sAPRIL-BP: 76,2 ± 0,1%;

s

0,001) sammenlignet med Vehicle kontrol (65,2 ± 0,8%). sAPRIL-BP reducerede også signifikant procentdelen af ​​celler i G

2 /M fase sammenlignet med vehikelkontrolgruppe (24,3 ± 0,8%) ved den lave dosis (20 uM sAPRIL-BP: 15,1 ± 0,5%;

p

0,05) og den høje dosis (40 uM sAPRIL-BP: 13,7 ± 0,5%;

s

0,001, fig 4A og 4B). Dette antyder, at anti-proliferative virkninger af sAPRIL-BP i LoVo celler skyldes en ophobning af celler i G

0 /G

1 fase, som blokerer cellecyklusprogression. Med hensyn til de apoptotiske virkninger af sAPRIL-BP, flowcytometri analyse viste, at sAPRIL-BP havde dosisafhængige virkninger på procentdelen af ​​LoVo-celler i tidlig apoptose (PI

– Annexin V

+ -celler). Sammenlignet med Vehicle kontrol (1,76 ± 0,12%) den lave dosis (20 uM sAPRIL-BP: 2,49 ± 0,23%;

s

0,05) og høj dosis (40 uM sAPRIL-BP: 3,82 ± 0,36 %;

s

0,05) signifikant forøget tidligt apoptotiske celler (fig 4C og 4D). Vi yderligere undersøgt den mulige molekylære mekanisme, der ligger virkningen af ​​sAPRIL-BP på cellecyklusprogression. Behandling med sAPRIL-BP havde ingen virkning på cyclin A, B, E1, CDK6, p53, p27, og p16-ekspression (Fig 5A). Men ekspressionen af ​​G1 /S-specifikt protein cyclin D1 (Fig 5A og 5B) og celledeling kinase cyclin-afhængig kinase 4 (CDK4) (Fig 5A og 5C) blev nedreguleret på en dosis-afhængig måde ved behandling med sAPRIL- BP.

LoVo celler blev behandlet med de angivne doser af sAPRIL-BP i 48 timer. Celler blev farvet med PI for cellecyklus-analyse (A og B) og PI + Annexin V for apoptose analyse (C og D) ved flowcytometri. *

s

0,05 sammenlignet med Vehicle kontrol; #

s

0,05 sammenlignet med gruppen lav dosis

LoVo celler blev behandlet med de angivne doser af sAPRIL-BP til 48 h.. (A) Ekspressionsniveauerne for de angivne cellecyklusproteiner blev vurderet ved Western blotting-analyse. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. Proteinet størrelse cyclin D1 er 34 kDa, cyklin A 49 kDa, cyclin E 50 kDa, cyklin B1 55 kDa, CDK4 34 kDa, CDK6 37 kDa, p53 53 kDa, p27 27 kDa, p16 40 kDa, og GAPDH 36 kDa. De optiske densiteter af cyclin D1 (B) og CDK4 (C) proteinbånd blev analyseret og normaliseret til den interne kontrol, som gange ændring. *

P

0,05 sammenlignet med Vehicle gruppe; #

P

0,05 sammenlignet med 10 pM gruppe, †

P

0,05 sammenlignet med 20 pM gruppe

Effekt af sAPRIL-BP på. xenograft tumorvækst

Så

in vivo

effekt af sAPRIL-BP blev evalueret i kolorektal cancer xenograft model. LoVo celler blev subkutant injiceret i nøgne mus efterfulgt af kontrol, lav (20 mg /kg) eller høj (40 mg /kg) dosis sAPRIL-BP injiceret intratumoralt en gang tumoren blev etableret. Musene blev aflivet på dag 14, er repræsentative billeder af musene og tumorer er vist i fig 6A. Behandling med sAPRIL-BP dosisafhængigt reduceret tumorvolumen (fig 6A) og tumorvægt (Fig 6B) i musemodellen. Fra dag 8 i sAPRIL-BP injektion blev tumorstørrelsen af ​​lave og høje grupper dosis betydeligt

(p

0,05). Mindre end kontrolgruppen (Fig 6C)

LoVo celler injiceret subkutant i nøgne mus og lades vokse i 3 uger. Når tumoren var indfører blev musene inddelt i 3 grupper (n = 5) og behandlet med PBS (kontrol), lav (20 mg /kg), eller høj dosis (40 mg /kg) af sAPRIL-BP hver anden dag . (A) Repræsentative eksempler på tumorerne fra hver gruppe er vist. Topplade: Scale bar, 8 mm. Bundplade: Scale bar, 7 mm. (B) Mus blev aflivet efter to ugers behandling med sAPRIL-BP og tumorvægte blev registreret. *

s

0,05 sammenlignet med kontrol. #

s

0,05 sammenlignet med gruppen lav dosis. (C) Den tumorvolumen blev registreret hver anden dag under behandlingen. *

s

. 0,05 sammenlignet med kontrol

Effekt af sAPRIL-BP på celledeling og apoptose i xenograft tumor

For yderligere at undersøge den mekanisme, som sAPRIL-BP inhiberer xenograft tumorvækst, udførte vi H 0,05 sammenlignet med kontrol. #

s

. 0,05 sammenlignet med 20 mg /kg gruppen

Effekt af sAPRIL-BP på xenograft tumormetastaser

For yderligere at undersøge, hvorvidt sAPRIL- BP behandling hæmme metastase, vi etableret en levermetastaser model ved at indsprøjte LoVo celler i milten. Repræsentative billeder af den metastatiske levertumor blev vist i fig 8A. Behandling med sAPRIL-BP reducerede antallet af metastatiske knuder på en dosis-afhængig måde (figur 8B;

s Restaurant 0,05). Fordelingen af ​​nodule størrelser var ens i hver gruppe (figur 8C). Samlet set viser disse resultater tydede sAPRIL-BP behandling ikke kun reduceret tumorvækst, men også faldet levermetastaser i en musemodel af colorektal cancer.

LoVo-celler blev injiceret i miltene fra nøgne mus for at observere eksperimentelt levermetastaser. Tre uger efter injektion blev musene inddelt i 3 grupper (n = 5) og behandlet med PBS (kontrol), lav (20 mg /kg), eller høj (40 mg /kg) doser af sAPRIL-BP hver anden dag. Mus blev aflivet efter to ugers behandling med sAPRIL-BP. (A) Repræsentative billeder af metastatiske levertumorer fra hver gruppe er vist. (B) antal metastatiske knuder per mus blev registreret. *

P

0,05 sammenlignet med kontrol. #

P

0,05 sammenlignet med gruppen lav dosis. (C) Antal metastatiske knuder med den angivne størrelse blev registreret. Samlede antal metastatiske knuder:. N = 197 (con), n = 130 (20 mg /kg) og n = 84 (40 mg /kg)

Discussion

i denne undersøgelse har vi identificeret og karakteriseret en sAPRIL-BP, der kunne være en potentiel terapeutisk for kolorektal cancer.

In vitro

studier viste både anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger af sAPRIL-BP. Konsekvent, sAPRIL-BP reducerede

in vivo

tumorvækst ved at reducere intratumoral celledeling og stigende intratumoral celle apoptose. Desuden sAPRIL-BP reducerede signifikant levermetastaser af kolorektale cancerceller i en musemodel. Virkningerne af sAPRIL-BP er påvist i denne undersøgelse vil skulle testes yderligere i kliniske forsøg. Anti-cancer polypeptider har flere fordele, såsom let syntese og oprensning, lav immunogenicitet, og høj dækningsgrad. Dette sAPRIL-BP kunne være en mulig strategi til behandling APRIL

høje cancere [34-38].

A fagvisningsbibliotek indeholder et stort antal forskellige polypeptider udtrykt på overfladen af ​​fager [39]. Denne teknik er meget brugt til mål screening narkotika, receptor agonist /antagonist, antigenepitop analyse, vaccine design og analyse af proteinstruktur [40-42]. Vi anvendte denne metode til at udvikle sAPRIL specifikke bindende peptider. Fordi en af ​​mekanismerne bag tumorigenese er forstyrrelse af balancen mellem celleproliferation og apoptose, er anti-cancer strategier, der omfatter inhibering af proliferation og /eller inducere apoptose i cancerceller anbefalet [43, 44]. Vi antager, at de bindende peptider, der konkurrerer med endogene APRIL receptorer til at binde den opløselige form af april ville have terapeutisk virkning i forhold til april

høje kræftformer. Lignende strategier rettet mod april skal sådanne som, under anvendelse af de opløselige former af decoy receptorer til at konkurrere med ligandbinding og silencing april har vist sig at hæmme tumorvækst i visse former for kræft. For eksempel har den opløselige form af BCMA blevet vist at inhibere den proliferative aktivitet APRIL

in vitro

og nedsætte tumorcelleproliferation i nøgne mus [45]. Nedregulering af April af lentivirus-medieret RNAi effektivt hæmmer væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller

in vitro

og

in vivo

[46]. Wang

et al

. [15, 26] også brugt siRNA til tavshed april en nøgen mus kolorektal cancer model og fandt I april blev knockdown øget kræft celle apoptose og nedsat tumorvækst og metastase. Ligeledes har vi tidligere vist, at lentivirus-medieret RNAi knockdown APRIL hæmmer væksten i LoVo celler og øger antallet af celler i G0 /G1-fasen og nedsætter antallet i G2 /M-fase [28]. I overensstemmelse med det tidligere arbejde, denne undersøgelse viste, at målrette APRIL hjælp sAPRIL-BP har en vis effekt mod tyktarmskræft linjer.

Tidligere arbejde [14, 21, 22, 24] foreslået, at anti-apoptotiske mekanismer sAPRIL -BP måske tilskrives blokere NF-KB-signalering, og regulering af anti-apoptotiske proteiner (bcl-2, Bd-XL, XIAP, ERK, og TGF-beta) eller pro-apoptotiske proteiner såsom Bax. Men de detaljerede molekylære mekanismer, hvorigennem sAPRIL-BP øget apoptose i LoVo celler forbliver, som skal undersøges nærmere. Derudover sAPRIL-BP vi identificeret viste specifik bindingsaffinitet med sAPRIL og betydelig evne til kompetitivt at inhibere sAPRIL binding til APRIL-receptorer på LoVo celler. HSPG er den eneste APRIL receptor, som findes på LoVo-celler (data ikke vist). Derfor, om sAPRIL-BP og HSPG deler de samme bindende epitoper på sAPRIL og den strukturelle lighed mellem HSPG og sAPRIL-BP kræver yderligere undersøgelse.

april-reguleret celleproliferation er blevet impliceret i mange forskellige cancere, men til dato er der kun få publicerede undersøgelser, der viser den molekylære mekanisme bag April-medieret celle cyklus regulering. Wang

et al

. viste en reduktion i cyklin D1 og CDK4, der er kritiske regulatorer af G1 /S overgang, da April var slået ned i kolorektale cancerceller. Disse resultater antydede, at cyklin D1 og CDK4 kan være involveret i april-medieret regulering af celledeling [24, 25, 47].