PLoS ONE: Silencing af PTK7 i Colon Cancer Cells: Caspase-10-Dependent Apoptose via mitokondrie Pathway

Abstrakt

Protein tyrosinkinase-7 (PTK7) er en katalytisk inaktiv receptor (RTK). PTK7 opreguleres i mange almindelige humane cancere, herunder coloncancer, lungecancer, mavecancer og akut myeloid leukæmi. Årsagen til denne opregulering er endnu ikke kendt. At udforske den funktionelle rolle af PTK7, ekspressionen af ​​PTK7 i HCT 116-celler blev undersøgt under anvendelse lille interferens (siRNA) -medieret gendæmpning. Efter transfektion siRNA held undertrykte PTK7 mRNA og proteinekspression. Knocking ned af PTK7 i HCT 116 celler hæmmede celledeling i forhold til kontrolgrupper og induceret apoptose. Endvidere var dette apoptose karakteriseret ved nedsat mitokondrie membranpotentiale og aktivering af caspase-9 og -10. Tilsætning af et caspase-10 inhibitor totalt blokeret denne apoptose, hvilket antyder, at caspase-10 kan spille en kritisk rolle i PTK7-knockdown-induceret apoptose, nedstrøms for mitokondrier. Disse observationer kan indikere en rolle for PTK7 i celledeling og celle apoptose og kan give en potentiel terapeutisk vej til behandling af en række kræftformer

Henvisning:. Meng L, Sefah K, O’Donoghue MB, Zhu G, Shangguan D, Noorali A, et al. (2010) Silencing af PTK7 i Colon Cancer Cells: Caspase-10-Dependent Apoptose via Mitokondriel Pathway. PLoS ONE 5 (11): e14018. doi: 10,1371 /journal.pone.0014018

Redaktør: Zhongjun Zhou, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Juli 12, 2010; Accepteret den 28. oktober 2010; Udgivet: November 16, 2010

Copyright: © 2010 Meng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH), Agency # R01GM066137 (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Receptortyrosinkinaser (RTK’er) komponere en klasse af transmembrane signalering proteiner, der overfører ekstracellulære signaler til det indre af cellen. Fejlagtig regulering af RTK spiller en vigtig rolle i udviklingen og /eller progression af mange former for kræft [1]. Proteintyrosinkinase-7 (PTK7), som også er kendt som coloncarcinom kinase-4 (CCK4), er en relativt ny og kun få undersøgelser medlem af RTK-superfamilien. Den indeholder et ekstracellulært domæne med syv immunoglobulinlignende sløjfer, et transmembrant domæne og et katalytisk inaktiv tyrosinkinasedomæne [2], [3]. Men som følge af en aminosyresubstitution indenfor det katalytiske domæne, PTK7 er en pseudokinase uden påviselig katalytisk tyrosinkinaseaktivitet [1], [4]. Det blev oprindeligt identificeret som et gen-udtrykt coloncancer-afledt cellelinie, men den er ikke udtrykkes i humane voksne colonvæv [2]. I modsætning hertil er høje niveauer af PTK7 ekspression set i føtale mus koloner [1], [2], [4]. Ekspressionen af ​​PTK7 opreguleres i mange almindelige humane cancere, herunder coloncancer, lungecancer, mavecancer og akut myeloid leukæmi [2], [5], [6], [7], [8], [9] . For nylig PTK7 blev identificeret som en ny regulator af ikke-kanonisk WNT eller plane cellepolaritet (PCP) signalering [10], [11]. PTK7 synes også at spille en vigtig rolle i rør-dannelse, migration, invasion af endotel og angiogenese i HUVEC-celler [12]. Imidlertid stadig, funktionelle rolle PTK7 i celleproliferation og apoptose uklar.

Aptotosis er programmeret celledød, typisk medieret af en familie af cysteinproteaser kaldet caspaser [13]. Caspaser syntetiseres som inaktive proenzymer med enten en lang (caspase-8, -9 og -10) eller en kort (caspase-3, -6 og -7) prodomænet [14], [15]. Disse sidstnævnte proteaser spalte en række væsentlige intracellulære proteiner, der fører til celledød [16].

Der er identificeret to væsentlige apoptoseveje. Den indre vej (mitokondrier pathway) involverer et fald i mitochondriemembranpotential og frigivelse af cytochrom

c

[17], som aktiverer caspase-9 gennem apoptosome. Derefter, caspase-9 initierer en proteolytisk caspasekaskaden der dræber cellerne. Den ydre vej (død receptor pathway) involverer tumornekrosefaktor (TNF) -receptor-superfamilien. Som reaktion på TNF ligandbinding, disse membranreceptorer rekruttere adaptormolekyler og aktivere caspase-8 i død-fremkaldende signaler kompleks (DISC). Aktiveret caspase-8 enten direkte aktiverer nedstrøms effektor-caspaser, såsom caspase-3, eller forbindelse til indre vej gennem spaltning af BCL-2 interagerende domæne (BID) til trunkeret Bud (tBid) [18].

caspase-10-genet er bundet til caspase-8-genet ved den humane kromosom locus 2q33-34 [19]. Imidlertid forbliver de fysiologiske funktioner af caspase-10 dårligt forstået, selv om det menes at spille en rolle i dødsreceptor pathway. Caspase-10 blev også rapporteret at blive aktiveret nedstrøms for mitokondrier i cytotoksisk lægemiddel-induceret apoptose af tumorceller [20]. Erhvervet inaktiverende mutationer af caspase-10 er blevet identificeret i tumorceller fra patienter med solide tumorer [21], [22], [23]. For nylig, caspase-10 blev vist at spille en rolle i apoptose induceret af paclitaxel, et anticancerlægemiddel, gennem en Fas-associeret protein med dødsdomænet (FADD) -afhængig mekanisme [24].

Udtrykket RNA-interferens (RNAi) blev første gang brugt af Fire

et al.

[25] i deres arbejde med

Caenorhabditis elegans

. RNAi er en cellulær mekanisme, hvorved små interfererende RNA’er (siRNA’er) (19-23 nukleotider lange) udløse nedbrydningen af ​​specifikke mRNA [25], [26]. Det er blevet påvist, at siRNA’er kan slå sammenhørende genekspression via RNAi pathway i pattedyrceller [27]. Egenskaberne af RNAi, herunder strenge target-gen specificitet og enkelhed i konstruktion og test [28], har i høj grad udvidet dens potentiale for mekanistiske studier af proteiner, såvel som for terapeutiske fremgangsmåder til behandling af sygdomme, herunder cancer [29], [30 ].

i denne undersøgelse blev en siRNA targeting human PTK7 mRNA anvendes til maksimal inhibering af PTK7 modstykke for at undersøge den rolle, PTK7 i apoptose og proliferation. Banker ned PTK7 i HCT 116 celler hæmmede celledeling og induceret apoptose. Endvidere var dette apoptose karakteriseret ved nedsat mitokondrie membranpotentiale og aktivering af caspase-9 og -10. Tilsætning af et caspase-10 inhibitor totalt blokeret denne apoptose, hvilket antyder, at caspase-10 kan spille en kritisk rolle i PTK7-knockdown-induceret apoptose nedstrøms for mitokondrier. Derfor kan disse observationer indikerer en rolle for PTK7 i celledeling og celle apoptose

Materialer og metoder

Materialer

McCoys 5A medier blev købt fra ATCC.; føtalt bovint serum (FBS) (varmeinaktiveret) blev indkøbt fra GIBCO, og penicillin-streptomycin blev indkøbt fra Cellgro. Micro-FastTrack 2.0 Kit blev købt fra Invitrogen. En kolorimetrisk bromdeoxyuridin (BrdU) kit var fra BD Pharmingen. IScript One-Step RT-PCR Kit med SYBR Green var fra Biorad. Proteaseinhibitorcocktail (blanding af 4- (2-aminoethyl) benzensulfonylfluorid (AEBSF), E-64, bestatin, leupeptin, aprotinin, og natrium-EDTA) og 0,4% trypanblåt var fra Sigma. Proteinet assaykit var fra Bio-Rad. Antistoffer mod caspase-9 og β-actin var fra Cell Signaling Technology. Antistof mod caspase-10 var fra Millipore. Antistof mod PTK7 var fra Abnova. Gede-anti-muse-IgG HRP-konjugeret sekundært antistof og gede-anti-kanin IgG HRP-konjugeret sekundært antistof blev indkøbt fra Cell Signaling Technology. Vybrant Apoptose Assay Kit # 2, 4 × NuPAGE LDS prøvebuffer, 4-12% NuPAGE Bis-Tris geler, 20 × NuPAGE MOPS SDS kører buffer, og 20 × NuPAGE transfer buffer var fra Invitrogen. Immobilon-P overførselsmembran var fra Millipore. SuperSignal West Dura Extended-Varighed Substrat og gendannelse plus Western blot Stripping buffer var fra Thermo Scientific. X-ray film var fra ISCBioExpress. JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’ tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid) blev købt fra Anaspec. Caspase-9-inhibitor (Z-LEHD-FMK), caspase-3 inhibitor (Z-DEVD-FMK), caspase-8 inhibitor (Z-IETD-FMK), caspase-familien inhibitor (Z-VAD-FMK), caspase- 1-inhibitor (Z-YVAD-FMK), caspase-10 inhibitor (Z-AEVD-FMK) og caspase-2-inhibitor (Z-VDVAD-FMK) blev indkøbt fra BioVision. Caspase-10 Fluorometrisk Protease Assay Kit var fra Millipore.

Cell Culture

HCT 116 (coloncarcinom) celler blev opnået fra ATCC (Manassas, VA) og holdt i vævskultur ved 37 ° C og 5% CO

2. p53-null HCT 116 celler blev tilvejebragt af Dr. Bert Vogelstein (The Johns Hopkins Kimmel Cancer Center). Celler blev dyrket i McCoys 5A-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (varmeinaktiveret) og 100 IU /mL penicillin-streptomycin.

RNA-interferens

HiPerFect transfektionsreagens, HP- Valideret siRNA specifikt for PTK7, opkaldt PTK7 siRNA (sense: 5′- CGGGATGATGTCACTGGAGAA-3 ‘), og en ikke-specifikke siRNA (AllStars Negative Control siRNA) blev indkøbt fra Qiagen. HCT 116-celler blev transficeret med siRNA af HiPerFect transfektionsreagens. På dag 1 blev cellerne i eksponentiel vækstfase høstes og suspenderes i vækstmedium. Celler blev inddelt i fire grupper og blev behandlet med PTK7 siRNA, et uspecifikt siRNA som negativ kontrol, HiPerFect kun vehikel, eller forblev ubehandlede. For hver transfektion blev en 500 pi cellesuspension transficeret med 25 nM siRNA anvendelse af 4 pi transfektionsreagens i plader med 24 brønde. Celler blev holdt i normale dyrkningsbetingelser og indsamles 2, 3 eller 4 dage efter transfektion til analyse.

flowcytometrisk analyse

Efter transfektion med siRNA’er som beskrevet ovenfor, blev cellerne trypsiniseret, vasket to gange i PBS og talt ved anvendelse af et hæmocytometer. Portioner af 5 × 10

5-celler blev inkuberet med overskydende phycoerythring (PE) -mærket anti-PTK7 i 200 pi bindingspuffer (PBS indeholdende 5 mM MgCl

2, 4,5 mg /ml glucose, 0,1 mg /ml gær-tRNA, 1 mg /ml BSA og 20% ​​FBS) på is i 30 minutter. Celler blev derefter vasket to gange med 1 ml bindingspuffer og suspenderet i 0,3 ml bindingsbuffer. Fluorescensen blev bestemt med et FACScan cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). PE-mærket anti-IgG blev anvendt som en negativ kontrol.

Kvantitativ RT-PCR

Total mRNA fra celler behandlet med forskellige siRNA’er blev ekstraheret med Micro-FastTrack 2,0 Kit ifølge producentens instruktioner . Real-time PCR blev udført på mRNA (50 ng) med iScript One-Step RT-PCR-kittet med brug af SYBR Green med en Biorad iCycler. Alle reaktioner blev udført i et volumen 50-pi in triplo. Primere til human PTK7 blev indkøbt fra Qiagen (QT00015568). PCR parametre var som følger: 50 ° C i 30 min, 5 min af Taq-aktivering ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler af PCR: 95 ° C x 30 s, 57 ° C × 60 s og 72 ° C × 60 s. Den relative mængde af mål-mRNA blev normaliseret til GAPDH mRNA. Specificitet blev bekræftet ved smeltekurveanalyse. Middelværdier og standardafvigelser af mindst tre gentagelser af hvert forsøg beregnes. Signifikans blev bestemt ved t-test, p value≤0.05 angivet med en asterisk.

Cell Number påvisning ved trypanblåtudelukkelse Assay

I fire dage efter behandling, cellesuspensioner blev fremstillet ved trypsinisering, og celler blev resuspenderet i 1 ml medier. Til 25 pi af cellesuspensionen, 25 pi 0,4% blev tilsat trypanblåt, og celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer.

proliferationsassav

Celleproliferation blev undersøgt under anvendelse af et kolorimetrisk bromdeoxyuridin (BrdU ) kit ifølge producentens instruktioner. Først blev celler transficeret med siRNA. Efter 48 timers behandling blev 10 uM BrdU tilsat til mediet. Mediet blev kasseret efter 2 timer, og cellerne blev fikseret og permeabiliseret med BD Cytofix /Cytoperm Buffer i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter fjernelse Cytofix /Cytoperm Buffer blev celler inkuberet med 100 pi fortyndet DNase (fortyndet til 300 ug /ml i PBS) i 1 time ved 37 ° C for at blotlægge inkorporeret BrdU. Celler blev derefter resuspenderet i 50 pi BD Perm /Wash buffer indeholdende fortyndet FITC-mærket anti-BrdU og inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Endelig blev celler inkuberet med 20 pi af 7-AAD opløsning. Prøver blev analyseret ved flowcytometri. Middelværdier og standardafvigelser af mindst tre gentagelser af hvert forsøg blev beregnet. Signifikans blev bestemt ved t-test; ap value≤0.05 er angivet med en asterisk.

Annexin V /propidiumiodid Double-Farvning Assay

Annexin V /propidiumiodid (PI) dobbelt-farvning blev udført under anvendelse af Invitrogen Vybrant Apoptose Assay Kit # 2. Celler blev vasket to gange i iskold PBS-buffer og centrifugeret ved 900 rpm i 3 min. Pellets blev resuspenderet i bindingsbuffer ved en densitet på 10

6 celler /ml. En prøve (100 uL) var dobbelt-farvet med 5 uL Annexin V /Alexa Fluor 488 og 2 uL 100 mg /ml PI. Efter inkubation ved stuetemperatur i 15 minutter blev 400 pi bindingsbuffer tilsat, og cellerne blev analyseret ved flowcytometri.

Western blot Analyser

Efter HCT 116-celler blev transficeret med PTK7 siRNA for 12 timer, 24 timer, 30 timer og 48 timer, hele celler blev høstet og vasket to gange med iskold PBS. Derefter blev cellerne lyseret i radioimmunudfældning puffer (150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, og 2 mM EDTA) i nærvær proteinase inhibitor cocktail i 20 minutter på is. Lysater blev centrifugeret ved 14.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C, og proteinindholdet i supernatanten blev målt under anvendelse af Bio-Rad proteinassay. Halvtreds mikrogram supernatantproteiner blev blandet med 4 × NuPAGE LDS prøvebuffer og opvarmet ved 70 ° C i 10 min. Proteinerne blev separeret på 4-12% NuPAGE Bis-Tris-geler med 1 × NuPAGE MOPS SDS-løbebuffer og derefter elektrooverført på en PVDF transfer membran med NuPAGE transfer buffer ved 50 V i 1 time. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i PBS-buffer indeholdende 0,2% Tween 20 (PBST) i 2 timer ved stuetemperatur. Membranerne blev probet med primære antistoffer i PBST indeholdende 5% fedtfri tørmælk natten over ved 4 ° C. Efter tre på hinanden følgende vask med PBST i 10 min, blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-muse-IgG-antistof eller gede-anti-kanin IgG-antistof i PBST indeholdende 5% fedtfri tørmælk i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre på hinanden følgende vask med PBST i 10 min, blev proteinerne signaler fremkaldt med en SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate kit og overført fra membranen til røntgenfilm. Protein loading blev normaliseret ved at probe den samme membran med anti-actin-antistof. For β-actin påvisning, blev tidligere anvendte membraner gennemvædet med Restore Plus Western Blot Stripping Buffer ved stuetemperatur i 30 minutter og hybridiseret med anti-β-actin.

Måling af mitokondrie membranpotentiale

Dye JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’ tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid) blev anvendt til bestemmelse mitokondrielle membranpotentiale (ΔΨ

m), tab af der betragtes som et afgørende skridt i apoptose pathway. HCT 116-celler blev transficeret med siRNA i 48 timer eller 72 timer, hvorefter cellerne blev vasket med koldt PBS og farvet ved inkubation med 2 pM JC-1 i 20 minutter ved 37 ° C. Derefter blev mitochondriemembranpotential detekteres ved fluorescensmikroskopi og flowcytometri ved 590 nm.

Caspase-10 aktivitetsmåling

Caspase-10-aktivitet blev målt ved anvendelse af Caspase-10 Fluorometic Protease Assay Kit . Kort beskrevet blev celler transficeret med PTK7 siRNA, og efter 24 timer eller 48 timer blev cellerne høstet. To millioner celler blev resuspenderet i afkølet lysisbuffer og inkuberet på is i 10 min. Derefter blev 50 pi 2 x Reaction Buffer og 5 pi af 1 mM AEVD-AFC substrat (50 pM slutkoncentration) tilsat til hver prøve. Efter inkubation ved 37 ° C i 2 timer blev prøver analyseret under anvendelse af en mikropladelæser udstyret med et 400 nm excitationsfilter og et 505 nm emission filter. Middelværdier og standardafvigelser af mindst tre gentagelser af hvert forsøg blev beregnet. Signifikans blev bestemt ved t-test, er ap value≤0.05 angivet med en stjerne.

Resultater

Hæmning af PTK7 udtryk ved PTK7 siRNA

Angivelse af PTK7 i HCT 116 , humane colon carcinomceller, blev undersøgt ved flowcytometri (fig. 1A, ubehandlet) og Western blot (fig. 1B, 0 h). Sammenligning fluorescenssignalet af PE-mærket anti-PTK7 til PE-mærket anti-muse-IgG viser klart, at PTK7 udtrykkes i HCT 116-celler.

(A) Flowcytometri assay for binding af PE-mærkede anti-PTK7 med HCT 116 celler (Grå kurver). De sorte kurver repræsenterer baggrunden binding af anti-IgG-PE. Koncentrationen af ​​antistoffet i bindingsbuffer var 2 ng /nl. (B) Western blot-analyse af PTK7 i HCT 116-celler transficeret med PTK7 siRNAs. Membranen blev strippet og probet igen med β-actin antistof som en loading kontrol. (C) Undertrykkelse af PTK7 mRNA-ekspression i HCT 116-celler ved PTK7 siRNAs. Celler blev høstet efter 48 timer af behandlingen. RT-PCR blev udført under anvendelse genspecifikke primere. Mængden af ​​PTK7 mRNA-ekspression normaliseret til den ubehandlede gruppe. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. * T-test:. P 0,05

Angivelse af PTK7 blev slået ned ved hjælp PTK7 målrettet siRNA og flowcytometri resultaterne for de målrettede celler blev sammenlignet med dem, der udsættes for køretøj kun, uspecifik siRNA eller ubehandlet, som vist i fig. 1A. Efter 48 timer toppen af ​​anti-PTK7-PE i HCT 116 transficeret med PTK7 siRNA flyttet tilbage til toppen af ​​baggrunden kontrolprotein, anti-IgG-PE, hvilket angiver, at PTK7 ekspressionsniveau i HCT 116-celler transficeret med PTK7 siRNA stærkt formindsket. Samtidig var der ingen tilsvarende skift i kontrol siRNA eller vehikelbehandlede grupper, hvilket indikerer, at hverken HiPerFect transfektionsreagens eller den ikke-specifikke siRNA påvirket PTK7 ekspression. Da PTK7 ekspression blev probet efter 12 timer, 24 timer, 30 timer og 48 timer af transfektion ved anvendelse af Western blot (fig. 1B), resultaterne viste klart, at niveauet af PTK7 ekspression faldt efter 48 timers transfektion. Derudover blev totalt mRNA ekstraheret fra ubehandlede, vehikel, uspecifik siRNA, og PTK7 siRNA grupper. Som vist i fig. 1C, PTK7 siRNA induceret 75-80% reduktion af PTK7 mRNA i HCT 116-celler. Disse resultater viste, at både PTK7 protein og mRNA-ekspressionsniveauer i høj grad blev reduceret med PTK7 siRNA. Dette viste sig at funktionen og effektiviteten af ​​PTK7 siRNA og forudsat et solidt grundlag for vores undersøgelse af PTK7 funktionelle rolle.

Levedygtighed og spredning af PTK7 siRNA-behandlede HCT 116 celler

Effekten af ​​PTK7 undertrykkelse på levedygtigheden af ​​HCT 116 celler blev undersøgt ved at tælle det totale antal levende celler hver dag efter transfektion. Som vist i fig. 2A, antallet af levende HCT 116-celler transficeret med PTK7 siRNA blev vist at være signifikant forskellig fra den for ubehandlede grupper på dag 4. Dette resultat viste en signifikant inhibering af cellelevedygtighed i HCT 116 celler behandlet med PTK7 siRNA. For at bekræfte, at faldet af cellelevedygtighed skyldes undertrykkelse af PTK7 blev de samme analyser udført med HCT 116 celler transficeret med uspecifik siRNA eller behandlet kun med køretøjet. Resultaterne viste, at PTK7 siRNA-behandlede prøve indeholdt den mindste antal celler. Selvom køretøj-behandlede og uspecifikke siRNA-behandlede celler havde mindre celletal end ubehandlede celler, der var væsentligt færre celler i PTK7 siRNA-behandlede prøve.

Data er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. (A) Antallet af levende celler blev talt dagligt i 4 dage under anvendelse af Trypan blå. (B) BrdU-inkorporering i forhold til ubehandlede celler påvist ved flowcytometri. Celler blev inkuberet med 10 pM BrdU i 2 timer efter 48 timers behandling. Mængden af ​​BrdU inkorporering blev normaliseret til den ubehandlede gruppe. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. * T-test: P 0,05. (C) Apoptose forekomst i HCT 116 celler påvises ved Annexin V /PI plet på dag 1-4 efter transfektion. Celler farvet negativ for både Annexin V og PI blev anset sund.

For at konstatere effekten af ​​undertrykkelse af PTK7 om HCT 116 celledeling blev en BrdU inkorporering eksperiment udført for at måle DNA-syntesen. Efter 48 timers transfektion blev celler udsået i 24-brønds dyrkningsplader og inkuberet med 10 pM BrdU i 2 timer. Celler blev derefter fikseret, og BrdU-inkorporering blev detekteret under anvendelse af et FITC-mærket anti-BrdU-antistof (fig. 2B). Silencing af PTK7 hæmmes betydeligt BrdU inkorporering i HCT 116 celler, hvilket tyder på en direkte effekt af PTK7 protein på HCT 116 celleproliferation.

Forøgelse af apoptose af PTK7 siRNA-behandlede HCT 116 celler

En Annexin V /PI-farvning blev udført for at undersøge muligheden for, at banker ned PTK7 kan påvirke apoptose af HCT 116 celler. Phosphatidylserin (PS) er placeret i den indre blad af cellemembranen i raske celler. Under apoptose, bliver PS omplantes til den ydre overflade af cellemembranen, og Annexin V /PI assay detekterer PS på den ydre overflade. Resultaterne i figur 2C viser, at PTK7 siRNA gruppen viste signifikant stigning i apoptotiske celler på dag 4 sammenlignet med ubehandlet, køretøj, og ikke-specifikke siRNA kontrolgrupper.

Ændringer i mitokondrie membranpotentiale og aktivering af caspase-9 i HCT 116 celler behandlet med PTK7 siRNA

for at undersøge mekanisme, gennem hvilken vælte PTK7 inducerer apoptose i HCT 116 celler, effekten af ​​banker ned PTK7 på mitokondrie membran potentiale (ΔΨ

m) blev bestemt ved fluorescens mikroskopi (fig. 3A) og flowcytometri (fig. 3B). Dye JC-1 blev anvendt som indikator. Hos raske celler, polariserede mitochondrier har en negativ ladning, som tillader JC-1 farvestof med delokaliserede positiv ladning til at indtaste det mitokondrielle matrix og akkumuleres der. Når den kritiske koncentration er overskredet, JC-1 danner J-aggregater, og cellerne bliver fluorescerende rød (FL2). I apoptotiske celler, mitokondriemembranen potentielle kollapser, og JC-1 kan ikke ophobes i mitokondrierne. I disse apoptotiske celler, JC-1 forbliver i cytoplasmaet i en grønt fluorescerende monomer form (FL1). Efter HCT 116 celler blev transficeret med siRNA eller kontrol som beskrevet ovenfor og inkuberet i 48 timer eller 72 timer, faldt ΔΨ

m i HCT 116 celler transficeret med PTK7 siRNA blev observeret. Efter 72 timers transfektion procentdelen af ​​celler med polariseret mitokondrier var 90%, 87% og 88% for celler i ubehandlede, vehikel og ikke-specifikke siRNA grupperne. Det er imidlertid kun 35% af de samlede celler i PTK7 siRNA gruppe havde polariserede mitokondrier. Denne tendens blev set selv ved 48 h, når kun 58% celler var polariseret mitokondrier. Disse data tydede på, at mitokondriel dysfunktion var involveret i apoptose induceret af PTK7 knockdown.

(A) fluorescensmikroskop påvisning af mitochondriemembranpotential i behandlede HCT 116 celler. (B) Flowcytometri påvisning af mitochondriemembranpotential i behandlede HCT 116 celler. (C) Aktivering af caspase-9 er involveret i apoptose induceret ved at banke ned PTK7. Membranen blev strippet og probet igen med β-actin-antistof, som belastningskontrol.

En række signalveje kan være involveret i apoptose, og mitokondrierne spiller en stor rolle. Mitokondriel dysfunktion forårsager frigivelse af cytochrom

c

, som aktiverer caspase-9, til gengæld giver næring apoptose. Caspase-9-aktivering blev påvist ved Western-blot efter HCT 116-celler blev transficeret med PTK7 siRNA og dyrket i 12 timer, 24 timer, 30 timer og 48 timer henholdsvis. Som vist i figur 3C, blev caspase-9 aktiveret og involveret i apoptose induceret af PTK7 knockdown.

Rolle caspase-10 i PTK7-knockdown-induceret apoptose

For at bestemme om caspaser mægle den apoptose induceret af knock down af PTK7 blev celler forbehandlet med en pancaspase inhibitor eller en af ​​flere enkelt-caspase-specifikke inhibitorer. Redning af cellerne fra apoptose ville betyde, at den inhiberede caspase blev impliceret i PTK7-deficient celledød. Efter præ-inkubering af HCT 116 celler med 20 pM pancaspase-familie inhibitor ved 37 ° C i 3 timer blev cellerne transficeret med siRNA i 48 timer. Efter inkubation i 48 timer blev cellelevedygtighed testet ved anvendelse Annexin V /PI (fig. 4A). Celler præ-inkuberet med pancaspase-familie inhibitor viste god cellelevedygtighed (80 ± 13%) efter transfektion med PTK7 siRNA, inden usikkerheden af ​​cellen levedygtighed uspecifikke siRNA-gruppen (83 ± 7,5%). I mellemtiden celler direkte transficeret med PTK7 siRNA havde signifikant lavere cellelevedygtighed (36 ± 12%). Pancaspase-familie inhibitor blokeret caspaseaktivitet og også blokeret apoptose induceret af banke ned af PTK7, hvilket viser, at apoptose induceret af banke ned af PTK7 er caspase-afhængig.

(A) apoptose induceret ved at banke ned PTK7 var caspase -afhængig. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. * T-test: P 0,05. (B) Caspase-10 inhibitor totalt blokeret af apoptose induceret af banke ned af PTK7. Data: gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg, * t-test: P 0,05

For at undersøge hvilken caspase spiller den afgørende rolle i denne apoptose, HCT 116 celler forbehandlet med caspase-9-hæmmer (Z. -LEHD-FMK), caspase-3 inhibitor (Z-DEVD-FMK), caspase-8 inhibitor (Z-IETD-FMK), caspase-familien inhibitor (Z-VAD-FMK), caspase-1-inhibitor (Z-YVAD -FMK), caspase-10 inhibitor (Z-AEVD-FMK), caspase-2-inhibitor (Z-VDVAD-FMK), eller DMSO-vehikel ved 37 ° C i 3 timer, efterfulgt af transfektion med PTK7 siRNA. Efter inkubation i 48 timer blev cellelevedygtighed testet af Annexin V /PI anvendelse af flowcytometri. Som vist i fig. 4B, inhibering af caspase-10 blokerede apoptose i 79 ± 3% af cellerne levedygtige. Dette betød, at caspse-10 kan spille en afgørende rolle i den apoptotiske vej induceret af banke ned af PTK7.

For at bekræfte aktiveringen af ​​caspase-10 i apoptose induceret af PTK7 knockdown, procaspase-10 protein niveauer i celle lysater transficeret med PTK7 siRNA blev undersøgt under anvendelse af Western blot (fig. 5A). Procaspase-10 faldt efter 12 timers transfektion og øget efter 30 timers transfektion. Også, som forbindelsen mellem indre vej og ydre vej, blev spaltningen af ​​Bid til tBid undersøgt, og der var ingen indlysende tBid, hvilket indikerer, at der ikke var noget signal overførsel fra ydre vej til indre vej. I et andet forsøg blev PTK7 ekspression i HCT 116 oprindeligt undertrykkes ved anvendelse PTK7 siRNA, hvilket resulterer i apoptose i disse celler. Evnen af ​​cellelysater at spalte peptidsubstrater (Ac-AEVD-AFC) blev testet som en indikator for caspase-10-aktivitet. Resultaterne i figur 5B viser signifikant stigning i caspase 10 aktivitet i celler behandlet med PTK7 siRNA.

(A) Western blot analyse af procaspase-10 og Bid i HCT 116 celler transficeret af PTK7 siRNA’er. Membranen blev strippet og probet igen med β-actin-antistof, som lastning kontrol. (B) Caspase-10-aktivitet i HCT 116-celler: ubehandlet og behandlet med vehikel, uspecifik siRNA og siRNA. Resultaterne blev givet som nøgletal til caspase-10 aktivitet i ubehandlede celler. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. * T-test: p. 0,05

Protein p53 involvering i PTK7-knockdown-induceret apoptose

Protein p53 er blevet bevist som et tumorsuppressorprotein hos mennesker [31] , og HCT 116 celler udtrykker bred-p53. [32], [33] for at studere inddragelse af p53 i apoptose induceret af PTK7 knockdown, p53-null HCT 116 blev anvendt som den anden cellelinje til at udføre PTK7 knockdown og andre relaterede eksperimenter. Første, PTK7 ekspressionsniveauet uden /med siRNA behandling blev overvåget ved flowcytometri (fig. 6A). De p53-nul HCT 116 celler udtrykker en høj mængde PTK7 på cellemembranen, men efter 48 timers PTK7 siRNA transfektion toppen for anti-PTK7-PE i p53-nul-HCT 116 forskydes tilbage til toppen af ​​baggrunden kontrol protein, anti-IgG-PE. Dette indikerede, at PTK7 ekspressionsniveau i p53-nul HCT 116-celler transficeret med PTK7 siRNA blev stærkt formindsket. Dernæst blev antallet af levende p53-nul HCT 116-celler transficeret med PTK7 siRNA vist sig at være signifikant forskellig fra den for ubehandlede grupper på dag 4, hvilket viser en signifikant inhibering af cellelevedygtighed i p53-nul HCT 116-celler ved behandling med PTK7 siRNA (fig. 6B). Og i en BrdU inkorporering eksperiment, nedregulering af PTK7 inhiberede signifikant BrdU-inkorporering i p53-nul HCT 116 celler, hvilket antyder en direkte virkning af PTK7 protein på celleproliferation (fig. 6C). På den anden side viste Annexin V /PI-farvning eksperiment, at PTK7 siRNA-behandlede p53-null HCT 116 viste signifikant stigning i apoptotiske og døde celler på dag 4 sammenlignet med ubehandlet, køretøj, og ikke-specifikke siRNA kontrolgrupper.

(A) Flowcytometri assay for binding af PE-mærket anti-PTK7 med p53-nul HCT 116 celler (grå kurver). De sorte kurver repræsenterer baggrunden binding af anti-IgG-PE. Koncentrationen af ​​antistoffet i bindingsbuffer var 2 ng /nl. (B) Antallet af levende p53-nul HCT 116 celler blev talt på dag 4 efter behandling med køretøjet, uspecifik siRNA og PTK7 siRNA. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. * T-test: P 0,05. (C) BrdU-inkorporering i forhold til ubehandlede celler påvist ved flowcytometri. p53-nul HCT 116 celler blev inkuberet med 10 pM BrdU i 2 timer efter 48 timers behandling. Mængden af ​​BrdU inkorporering blev normaliseret til den ubehandlede gruppe. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse. af tre uafhængige forsøg. * T-test: P 0,05. (D) Apoptose forekomst i p53-nul HCT 116 celler påvises ved Annexin V /PI plet på dage 4 efter transfektion. Celler farvet negativ for både Annexin V og PI blev anset sund og procentdel blev vist i figuren.

apoptose induceret af PTK7 knockdown har vist sig at være caspase-10 afhængig i vildtype HCT 116. så apoptose pathway i p53-nul-HCT 116 induceret af PTK7 knockdown blev yderligere undersøgt. JC-1 forsøg blev monitoreret ved både fluorescensmikroskopi (fig. 7A) og flowcytometri (fig. 7B). Det er klart, mitrokondriemembranen faldt i p53-nul HCT 116 celler behandlet med PTK7 siRNA. Samtidig blev en caspaseinhibitor eksperiment udført ved anvendelse af p53-nul HCT 116 celler. Som vist i fig.