PLoS ONE: Epigenetisk Regulering af miR-212 Expression i Lung Cancer

Abstrakt

Mange undersøgelser har vist, at microRNA udtryk i kræft kan reguleres ved epigenetiske begivenheder. For nylig fandt vi, at i lungekræft MIR-212 var stærkt nedreguleret. Men mekanismer involveret i reguleringen af ​​miR-212-ekspression er ukendte. Derfor har vi rettet dette punkt ved at undersøge de molekylære mekanismer i MIR-212 nedregulering i lungekræft. Vi identificerede histon ændringer snarere end DNA hypermethylering som epigenetiske begivenheder, der regulerer miR-212 niveauer i NSCLC. Desuden har vi fundet, at MIR-212 nedregulering in vivo er tæt forbundet med sværhedsgraden af ​​sygdommen

Henvisning:. Incoronato M, Urso L, Portela A, Laukkanen MO, Soini Y, Quintavalle C, et al. (2011) Epigenetisk Regulering af miR-212 Expression i lungekræft. PLoS ONE 6 (11): e27722. doi: 10,1371 /journal.pone.0027722

Redaktør: Tobias Eckle, University of Colorado Denver, USA

Modtaget: Juli 25, 2011; Accepteret: 24 Oktober 2011; Udgivet 15. november, 2011

Copyright: © 2011 Incoronato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af midler fra: Fondazione IRCCS SDN www.sdn-napoli.it, 5 × 1000 til Istituto di Ricerca Diagnostica e Nucleare Fondazione IRCCS SDN, Associazione Italiana Ricerca sul cancro (AIRC) (tilskud n.ro 10620) www.airc .it og MERIT (RBNE08E8CZ_002) www.miur.it GC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Worldwide, lungekræft er den mest almindelige kræftform både forekomst og dødelighed (1,35 millioner nye tilfælde om året og 1,18 millioner dødsfald), med de højeste priser i Europa og Nordamerika. De vigtigste typer af lungekræft er

småcellet karcinom

(SCLC) og

ikke-småcellet lungekræft

(NSCLC). De ikke-småcellede lungecarcinomer omfatter adenocarcinomer, planocellulært lungecarcinomer, og store celle lungecarcinomer. Disse tumorer kun har 20-30% positive klinisk respons, men årsagen til behandling resistens er stadig ukendt.

microRNA (miRNA) er konserveret evolutionært, endogene ikke-kodende RNA på omkring 22 nucleotider (nt) i længden involverede proteinindhold-udtryk regulering på posttranskriptionel niveau [1]. Med fremkomsten af ​​miRNA udtryk profilering er der gjort en betydelig indsats for at korrelere miRNA udtryk med tumor prognose [2], [3]. Til dato, en række nedregulerede miRNA i lungekræft korrelerer med patientens overlevelse [4], [5], [6] og med terapeutiske respons [7]. Dette fund førte mange forskergrupper at identificere de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for deregulering af disse miRNA i humane kræftformer.

Epigenetik refererer til ændringer i genekspression, der opstår uden ændring i DNA-sekvens. Der er to primære og indbyrdes forbundne epigenetiske mekanismer: DNA methylering af CpG-øer i promotorregioner og post-translationel modifikation af histon haler som acetylering, phosphorylering, methylering og ubiquitilation [8], [9], [10]. Udover kendte genetiske mutationer involveret i neoplastisk transformation, mange beviser tyder på, at kræftceller har en ændret epigenetisk maskiner da enten DNA methylering eller histon-modifikationer er modificeret i forhold til normale celler [11].

For nylig fandt vi begge

in vivo

in vitro

at mIR-212 var stærkt nedreguleret i lungekræft, og at dens ektopisk ekspression øget TRAIL (tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand) følsomhed lungecancerceller [ ,,,0],12]. Da mange microRNA’er nedreguleret i cancer er blevet stramt relateret til CpG ø hypermethylering og /eller ændring i histon mærker ændringer [13], [14], [15] vi spekulerede på, om de samme ændringer kan være involveret i miR-212 lyddæmpning i lungekræft . Derfor, i dette håndskrift undersøgte vi begge DNA mønstre for methylering og histon modifikationer af MIR-212 promotorregionen i Calu-1 (NSCLC) og MRC5 (normale humane fibroblaster afledt fra føtal lunge fibroblast) celler, der bærer forskellige MIR-212 ekspressionsprofiler. Vores resultater viser, at selv det transkriptionelle startsted af MIR-212 er indlejret i et CpG island, er dets transkriptionelle inaktivering i lungekræft ikke er associeret med DNA hypermethylering status, men i stedet til en ændring i status for methylering af histon haler koblet til promotorområdet af denne microRNA. Endvidere ved anvendelse af vævsprøver for lungekræft ved forskellige TNM mellemstationer analyserede vi ekspressionsniveauerne af MIR-212 og fandt, at dets nedregulering er tæt forbundet med sværhedsgraden af ​​sygdommen.

Resultater Salg

ekspression af miR-212 i forskellige lungecancer stadier

for nylig demonstrerede vi begge

in vitro

in vivo Hoteller, som miR-212-ekspression i lungekræft er nedreguleret sammenlignet med normal lunge [12]. For at teste, om dens nedregulering korrelerer med stadium af tumoren, blev vævsprøver indsamlet fra 34 NSCLC-ramte patienter på forskellige TNM staging (kliniske træk er opsummeret i tabel 1). Vi analyserede derefter MIR-212-ekspression ved QRT-PCR (figur 1A). Som vist i T1 /T2 prøver, ekspressionen af ​​MIR-212 er hovedsagelig heterogen. Tværtimod i T3 /T4 prøver, MIR-212-ekspression var homogent nedreguleret. Figur 1B viser gennemsnittet af T1 /T2 prøver sammenlignet med T3 /T4. Disse data viser, at inaktivering af MIR-212 er tæt forbundet med sygdommens sværhedsgrad.

(A) Samlet RNA ekstraheret fra vævsprøver indsamlet fra 34 NSCLC-ramte individer på forskellige TNM staging (T1-T2 -T3-T4) blev anvendt til at analysere mIR-212 ekspression af Real-Time PCR. (B) Middel ± SD af miR-212 udtryk for pool T1 /T2 vs T3 /T4. Fejlsøjler indikerer SD. * P 0,05 ved t test. Som vist, i T1 /T2 iscenesættelse ekspression af miR-212 er klart heterogen mens i T3 /T4 mellemstationer af miR-212 udtryk er stærkt tavshed og korrelerer med sværhedsgraden af ​​sygdommen.

rolle epigenetisk på miR-212 expression- Brug af CpG Island Searcher program (https://www.cpgislands.com/) fandt vi, at miR-212 locus blev indlejret i en CpG ø. Det er kendt, at adskillige miRNA epigenetisk er stumme i association med CpG island hypermethylering i cancerceller [16], [17]. Vi således undersøgt, om tabet af MIR-212 ekspression i NSCLC var forbundet med DNA hypermethylering. Vi analyseret ved bisulfit genomisk sekventering status DNA methylering af de forudsagte transkriptionelle startsteder (TSSs) af PRI-MIR-212 [18], [19] i Calu-1 og MRC5-cellelinier, der udtrykker forskellige mængder af MIR-212 (figur 2A). Som vist i figur 2B, i Calu-1 regionen analyseret blev stort set under-methyleret. For at bekræfte, at den transkriptionelle inaktivering af MIR-212 i lungekræft ikke var forbundet med CpG-methylering blev Calu-1-celler behandlet med to forskellige koncentrationer af DNA-methyleringsinhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (5’Aza) som angivet . MIR-212-ekspression blev derefter evalueret af q-RT-PCR (fig. 2C-D). Som vist i figur 2C-D, upon 5’Aza behandling, MIR-212 ekspressionsniveauer var uændrede. Taget sammen indikerer disse resultater, at methylering ikke er relateret til MIR-212 nedregulering i NSCLC.

(A) Ekspression analyse af MIR-212 i NSCLC (Calu-1) og normale humane fibroblaster afledt fra føtal lunge (MRC5 ) ved Real- Time PCR. (B) bisulfit genomisk sekventering analyser af MIR-212 CpG ø i Calu-1 og MRC5 celler. Otte enkelte kloner er repræsenteret for hver prøve. Sorte og hvide firkanter repræsenterer methyleret og umethyleret CpG henholdsvis, og hver lodret bjælke illustrerer en enkelt CpG. (C) Ekspression analyse af modent MIR-212 af Real-Time PCR i Calu-1-celler i fravær (kontrol) eller i nærvær af 1 uM (venstre panel) og 5 um (højre panel) af DNA-methyleringsinhibitor 5-aza- 2′-deoxycytidin (5-aza-2dC), som angivet. I NSCLC, er DNA hypermethylering af CpG ø ikke fundet tyder på, at denne epigenetiske modifikation er ikke ansvarlig for miR-212 lyddæmpning. Betyder ± SD af fire uafhængige forsøg i tre eksemplarer er givet.

Methylering og acetylering analyse af histoner forbundet til TSS af miR-212

Vi derefter undersøgt, om ændringerne i histonproteiner kunne udgør mIR-212 nedregulering i NSCLC. Vi udførte chipanalyse med fire antistoffer mod specifikke histon modifikationer: H3K4me3 og H3K9Ac, generelt forbundet med transkriptionel aktiv kromatin, og H3K27me3 /H3K9me2 generelt forbundet med transkriptionel inaktiv kromatin. Efterfølgende sammenlignede vi histon markerer mønster af den forudsagte MIR-212 TSS både i Calu-1 og MRC5 celler. Som forventet, vi fandt signifikante forskelle i status for methylering af H3K27 og H3K9 og i acetyleringen status H3K9 (figur 3). Specifikt i Calu-1-celler, der udtrykker lave niveauer af MIR-212, TSS af MIR-212 er beriget ved tilstedeværelsen af ​​histonproteiner med kovalente modifikationer, der er involveret i gen-silencing (H3K27me3 og H3K9me2). Tværtimod høj MIR-212 udtrykker MRC5 celler udviste en stigning i histon ændringer i forbindelse med genaktivering (H3K9Ac) sammenlignet med Calu-1-celler. Vores data tyder på, at epigenetiske modifikationer på histoner på miR-212 TSS bidrage til dens epigenetisk inaktivering i NSCLC.

chip og Real-Time PCR blev brugt til at studere, i Calu-1 og MRC5 celler, histon ændringer i promoter region miR-212 ved hjælp af antistoffer rettet mod H3K4me3, H3K27me3, H3K9me2 og H3K9Ac. En negativ kontrol-antistof (IgG) blev inkluderet i chippen assay. Betyder ± SD af fire uafhængige forsøg i tre eksemplarer er givet.

Altered miR-212-ekspression i NSCLC er forbundet med ændringer i histon modifikationer

histon methyl transferase EZH2, en bestemt H3K27 methyl transferase, er ofte overudtrykkes i human cancer [20]. Desuden analyser immunhistokemisk afsløret, at G9A, en specifik H3K9 methyltransferase, var stærkt udtrykt i lungekræft vævsprøver sammenlignet med normale lunge prøver [21].

Baseret på disse resultater, vi analyseret ved q-RT-PCR på ekspressionsniveauer af EZH2 og G9A enzymer i Calu-1 og MRC5 celler. Som vist i figur 4, udviste Calu-1-celler øgede mængder af EZH2 (A) og G9A (B) sammenlignet med MRC5 celler. Tværtimod har ekspressionsniveauer af H3K9 de-acetylase HDAC er identiske på de to celler skrive figur 4C.

(A) Ekspression analyse af EZH2, (B) G9A og (C) HDAC-enzymer ved Real- Time PCR i Calu-1 og MRC5 celler. (D) Expression analyse af moden miR-212 i Calu-1-celler ubehandlet (-) eller behandlet (+) med siEZH2 og TSA-hæmmer eller (E) med TSA og BIX01294 (Bix) hæmmere. (D) Calu-1-celler blev transficeret med specifikke EZH2-siRNA i 24 timer. Derefter blev cellerne inkuberet med 100 ng /ml TSA i 24 timer og MIR-212-ekspression blev vurderet ved QRT-PCR. Nedregulering af EZH2 ekspression efter siEZH2 transfektion blev evalueret ved Western blotting under anvendelse af anti-EZH2 antistof. For at bekræfte lige loading membranen blev immunblottet med anti-β-actin-antistof. (E) Calu-1-celler blev behandlet med 100 ng /ml af TSA i 16 eller 24 timer i nærvær eller i fravær af 10 uM BIX i 16 timer og MIR-212-ekspression blev vurderet ved Real-Time PCR. Disse resultater antyder, at opregulering af EZH2 og G9A enzymer i Calu-1-celler bidrager til at øge histon methylering og således formindske MIR-212 ekspressionsniveauer. Betyder ± SD af fire uafhængige eksperimenter i tredobbeltbestemmelse er givet.

De samme resultater blev opnået i en anden NSCLC cellelinje, A549. Som vist i figur S2, A549-celler viser lave niveauer af MIR-212 (A), opregulering af EZH2 (B) og G9A (C) og tilsvarende niveauer af HDAC (D), sammenligne med MRC5.

for at bekræfte involveringen af ​​histon modifikationer i mIR-212 nedregulering i NSCLC, vi hæmmede både EZH2 ekspression og HDAC-aktivitet og derefter analyseret virkningerne på mIR-212 ekspression i Calu-1-celler. Til dette formål blev Calu-1-celler transficeret med EZH2-siRNA og /eller behandlet med TSA, en specifik inhibitor af HDAC. MIR-212 blev derefter evalueret af q-RT-PCR. Som forventet, enten siRNA-medieret knock-down af EZH2 methylase eller TSA-medieret inhibering af HDAC de-acetylase medvirkede til at øge MIR-212 ekspressionsniveauer (figur 4D). Interessant effekten var større (firedobbelte) i nærvær af begge hæmninger. Den samme virkning blev observeret i A549-celler (Figur S2E). Hæmningen af ​​EZH2 og HDAC produceret en stigning (to-folder) af miR-212 også i MRC5 celler (Figur S2F).

For at fastlægge den rolle, G9A på miR-212 lyddæmpning, Calu-1 celler blev behandlet med BIX01294, en specifik inhibitor af G9A methylase i nærvær eller i fravær af TSA. MIR-212 blev vurderet ved q-RT-PCR. Som forventet, behandling med begge reagenser, bidraget til at øge MIR-212 ekspressionsniveauer op til 5 folder (Figur 4E). Taget sammen tyder disse resultater på, at opregulering af EZH2 og G9A enzymer i lungekræft bidrager til at øge histon methylering og således formindske MIR-212 ekspressionsniveauer. Når de anvendes på samme tid, siEZH2 /TSA eller BIX01294 /TSA produceret større virkninger på MIR-212-ekspression sammenlignet med den enkelt inkubation. Således er det muligt at spekulere, at H3K27me3 eller H3K9me2-medieret inaktivering maskiner kræver HDAC-aktivitet, som tidligere rapporteret af Lachner M

et al

[22].

Virkninger af inhibering af EZH2, G9A og HDAC om histonproteiner

Baseret på denne fund, vi spekulerede på, om hæmning af EZH2, G9A og HDAC-enzymer i Calu-1 celler kan forårsage en ændring i H3K27me3, H3K9me2 og H3K9Ac histon markerer mønster på TSS af mIR-212 påvirker således mIR-212 ekspressionsniveauer. Til dette formål blev Calu-1-celler behandlet med siEZH2 og TSA og chip analyser blev udført ved anvendelse H3K27me3 og H3K9Ac antistoffer, henholdsvis. Interessant inhibere både methylase (EZH2) og de-acetylase (HDAC), stærkt forøget acetylering af H3K9 og formindskede signifikant methylering af H3K27 af MIR-212 TSS sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5A). Disse resultater korrelerer med opregulering af MIR-212 i samme eksperimentelle betingelse (sammenlign figur 4D med figur 5A). Desuden blev Calu-1-celler behandlet med BIX01294 og TSA-inhibitorer og chip analyser blev udført under anvendelse H3K9me2 og H3K9Ac antistoffer, henholdsvis. Som forventet, fandt vi, at inhibering af katalytisk aktivitet af enten methylase (G9A) eller de-acetylase (HDAC), stærkt reducerede methylering af H3K9 og øgede signifikant acetylering af H3K9 på MIR-212 TSS sammenlignet med ubehandlede celler (figur 5B) . Tilsammen disse resultater kraftigt vise, at specifikke ændringer i histon modifikationer bestemme miR-212 nedregulering i NSCLC.

chip og QRT-PCR blev brugt til at analysere, i Calu-1 celler, histon modifikationer på den forudsagte miR- 212 TSS (A) i fravær (scrb) eller i nærværelse af TSA og siEZH2, og (B) i fravær (scrb) eller i nærværelse af TSA og Bix inhibitorer hhv. (A-B) Calu-1-celler blev behandlet i nærvær af de angivne inhibitorer som beskrevet i teksten i figur 4. Resultaterne viser, at histon modifikation katalyseret af EZH2, G9A og HDAC-enzymer sites er involveret i MIR-212 nedregulering i NSCLC. Betyder ± SD af fire uafhængige eksperimenter i tredobbeltbestemmelse er givet.

Effect af inhibering af EZH2, G9A og HDAC på apoptose i Calu-1 celler Salg

Det er kendt, at inhibering af HDAC af TSA, inducerer cellecyklusstop og apoptose i forskellige cancerceller som gliom, blærecancer, leukæmiceller og SCLC [23], [24]. Desuden i humane bronchoepithelial celler, transfektion af G9A og EZH2 af siRNA’er induceret apoptose og G1 anholdelse henholdsvis [25]. Vores seneste resultater viste, at ektopisk udtryk for miR-212 sensibiliserer Calu-1 celler til TRAIL-induceret apoptose [12]. Vi verificerede derfor, om inhiberingen af ​​EZH2, G9A og HDAC-enzymer kan øge TRAIL følsomhed Calu-1-celler. Til dette formål blev Calu-1-celler behandlet med BIX01294 og TSA at inhibere G9A og HDAC-enzymer og apoptose blev vurderet ved Western blot-analyse af caspase-8-aktivering efter TRAIL behandling. Som rapporteret i figur 6A, er caspase-8 klart aktiveret i nærvær af G9A eller HDAC-inhibering. Endvidere caspase-8 aktivering yderligere stigninger i nærvær af begge enzymer inhibering, tilstand, der korrelerer med opregulering af MIR-212 (sammenlign figur 6A med figur 4E). Med samme formål blev apoptose induktion evalueret ved at hæmme EZH2 og HDAC-enzymer ved siEZH2 og TSA. Til forskel fra de opnåede resultater ovenfor, blev caspase-8 kun aktiveres i nærværelse af HDAC-inhibering og ikke i nærværelse af EZH2 knock-down (figur 6B). For yderligere at bekræfte disse resultater udførte vi Annexin V apoptose-assay (figur S1)

(A) Calu-1-celler blev behandlet i fravær. (-) Eller i nærvær (+) af 100 ng /ml TSA og /eller 10 uM BIX, som tidligere beskrevet, hvorefter cellerne blev inkuberet med 1 ng /ml Super-Killer TRAIL i 3 timer. Lysater blev analyseret ved western blotting med anti-caspase-8-antistof. Spaltning af caspase-8 var mere tydelig i Calu-1-celler behandlet i nærvær af begge inhibitorer. (B) Calu-1-celler blev transficeret med siEZH2 og behandlet i fravær eller i nærvær af 100 ng /ml TSA, som tidligere beskrevet, så celler blev inkuberet med 1 ng /ml af TRAIL. β-actin antistof blev anvendt som lastning kontrol.

Diskussion

MikroRNA’er er små ikke-kodende RNA’er molekyler, der fungerer som endogene posttranskriptionel lyddæmpere af målgener og er vigtige regulatorer af forskellig cellulære processer, herunder apoptose [26], [27]. Defekter i den apoptotiske program kan bidrage til behandling modstand og tumorprogression, og kan være forårsaget af dereguleret ekspression af anti-apoptotiske molekyler. Antallet af opdagede microRNAer og deres mål vokser hurtigt angivelse af deres afgørende rolle i opretholdelsen af ​​genekspression profil. Vi har for nylig påvist for første gang den pro-apoptotiske rolle MIR-212 i lungekræft. Konkret fandt vi, at MIR-212 var i stand til at målrette det anti-apoptotiske protein PED opreguleret i lungecancer [28] tyder på, at dets virkning kan bidrage til tumorsuppression da det negativt inhiberer et molekyle involveret i apoptose resistens [12]. Desuden analysere menneskelige væv eksemplarer af normal og lungekræft vi fandt, at opregulering af PED protein i lungekræft væv var korreleret med miR-212 lyddæmpning og

in vitro

med apoptose modstand. Imidlertid er forholdet mellem MIR-212 lyddæmpning med progression og sygdommens sværhedsgrad var stadig ukendt. Til dette formål under anvendelse af vævsprøver fra NSCLC-patienter i T1-T2-T3 og T4 stadieinddeling, fandt vi, at ekspressionen af ​​MIR-212 i T1 /T2 var heterogen hvorimod alle prøver i T3 /T4 analyseret viste miR- 212 nedregulering. Disse resultater antyder, at inaktivering af MIR-212 i lungekræft er tæt knyttet til sværhedsgraden af ​​sygdommen. Men de molekylære mekanismer, der er involveret i miR-212 lyddæmpning i lungekræft er stadig ukendt, og dette var i fokus for vores undersøgelse.

Flere undersøgelser har analyseret ekspression af miR-212 i forskellige typer celler for at bestemme dets rolle i vævsspecifik fysiologi. MIR-212 ekspressionsniveauer blev fundet højere i forhjerne regioner af den voksne rottehjerne [29] kraftigt nedreguleret i væv af fostre med anencephalitis [30] og i samarbejde med MIR-132, højere i hippocampale neuroner. Desuden har miR-212 blevet beskrevet som involveret i normal dendritceller modning hos nyfødte neuroner i den voksne hippocampus [31].

Til dato, få rapporter viser en involvering af miR-212 i kræft, men alle af dem angiver at denne miRNA er dereguleret i forskellige human cancer. Især MIR-212-ekspression fald i både gastriske carcinoma (GC) celler og i humane primære GC væv tyder på, at dets nedregulering kan være relateret til gastrisk carcinogenese gennem sine målgener, såsom methyl-CpG-binding protein [32]. I pancreas adenocarcinom væv MIR-212 er overudtrykt og målretter retinoblastoma tumor suppressor [33] Anvendelse af microarray analyse tretten miRNA, herunder MIR-212, blev fundet signifikant overudtrykt i orale tumorer [34]. Desuden forøget ekspression af HB-EGF (heparinbindende EGF-lignende vækstfaktor) som følge af nedregulering af MIR-212 i hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er blevet beskrevet som en mulig mekanisme for cetuximab resistens [35 ].

Kræftceller har et specifikt epigenome. I det sidste årti mange undersøgelser har vist, at aberration af epigenetiske mærker såsom DNA-methylering i CpG-øer og kovalente modifikationer af histon proteiner involveret i kromatin organisation, bidrager væsentligt til malign transformation. På den anden side er det blevet påvist, at ekspressionen af ​​miRNA kan påvirkes af epigenetiske ændringer. I blæretumorer blev det konstateret, at miR-127 er bragt til tavshed af promotor methylering og dens udtryk kunne genoprettes ved hypomethylerende agenter [16]. Lujambio

et al

behandlet adskillige cancer cellelinjer afledt lymphonode metastaser med DNA demethylering agenter og brug af miRNA udtryk microarray analyse fandt, at miR-148a, miR-34b /c, og miR-9 familie viste kræft specifikke CpG island hypermethylering [36]. Tilsvarende i colon cancerceller MIR-124a silencing var forbundet med CpG island hypermethylering [17]. Brug bioinformatiske programmer fandt vi en CpG ø i promotoren for miR-212-genet. Aberrant methylering af promotor CpG ø region er en fælles epigenetisk mekanisme for transkriptionel nedregulering. Derfor målte vi virkningerne af AZA på den transkriptionelle regulering af MIR-212 i Calu-1-celler, der udtrykker lave niveauer af miRNA. Overraskende, selvom promotorelement af MIR-212 befinder sig inden et CpG øen vi fandt, at Calu-1 behandling med specifik inhibitor for DNA-methylase ikke ændrede ekspression af MIR-212.

epigenetisk inaktivering i pattedyrceller er medieret af mindst to forskellige histon modifikationer: H3K27 trimethylation og H3K9 dimethylering [37]. Forholdet mellem DNA hypermethylering og disse histon modifikationer er ikke fuldstændigt forstået. Interessant, Kondo

et al

viste et nyligt identificeret epigenetisk aspekt af gen deregulering i kræftcellen [38]. De fandt, at op til 5% af generne på CpG microarray blev stille i cancerceller ved udtalt forhøjede i H3K27me3 forbundet med relativt lave niveauer af promotor-DNA-methylering. Desuden blev det for nylig konstateret, at MIR-22 nedregulering involverer akkumulering af H3K27me3 uafhængig af promotor-DNA-methylering i akut lymfoblastisk leukæmi [39]. Disse data antyder, at H3K27me3 er en alternativ form for gendæmpning i cancer uafhængig af DNA-methylering. I overensstemmelse med disse nyere undersøgelser udførte vi chipanalyse i lungecancerceller (Calu-1) og i normale humane fibroblaster afledt fra føtal lunge (MRC5) for at undersøge ændringer af histon modifikationer forbundet med transkriptionelle aktive og /eller inaktive kromatin af MIR-212-promotoren område. Som forventet, fandt vi stigende mængder af H3K27me3 og H3K9me2 (covalent modifikation involveret i gendæmpning) i promotorregionen af ​​MIR-212 i Calu-1 sammenlignet med MRC5 celler og stigende mængder af H3K9Ac (covalent modifikation involveret i genekspression) i promotorregion af mIR-212 i MRC5 sammenlignet med Calu-1-celler. Endvidere fandt vi, at inhibitorer for de med histon modifikationer, dvs. siEZH2, TSA og BIX01294, enzymer kunne opregulere MIR-212-ekspression i Calu-1-celler. Taget sammen indikerer disse resultater, at selv om DNA hypermethylering forekommer at være essentiel for gendæmpning, den transkriptionelle inaktivering af MIR-212 i NSCLC involverer H3K27me3 /H3K9Ac eller H3K9me3 /H3K9Ac-associeret histon modifikation uafhængig af promotor-DNA-methylering.

Vi har også testet virkningerne på TRAIL-inducerede celler død i NSCL af de forskellige inhibitorer.

faktisk vores seneste resultater viste, at ektopisk udtryk for miR-212 sensibiliserer Calu-1 celler til TRAIL-induceret apoptose [12]. Vore data viser, at TRAIL følsomhed Calu-1, vurderes af Western blot-analyse af caspase 8 og ved FACS-analyse, blev større forøget ved inhibering af G9A end i af EZH2. Fraværet af virkningen af ​​siEZH2 på TRAIL følsomhed i Calu-1-celler kan tilskrives forskellige mekanismer. Det er muligt, at: (i) 70% reduktion af EZH2 opnået ved behandling med den specifikke siRNA ikke er tilstrækkelig til at forøge TRAIL respons (ii) EZH2 knock-down, foruden MIR-212, kan regulere andre vigtige signaleringsmolekyler involveret i TRAIL signalering (iii) at regulere trail signalvejen, kan EZH2 brug samtidig HDAC-inhibering, der kan modulere ekspressionsniveauerne af forskellige molekyler, der er involveret i TRAIL respons. Der er behov for yderligere undersøgelser for at undersøge disse forskellige hypotese.

Som konklusion viser denne undersøgelse, at MIR-212 nedregulering er korreleret til sværhedsgraden af ​​sygdommen, da det er væsentligt nedreguleret i T3 /T4 staging snarere end i T1 /T2 iscenesættelse og at dens lyddæmpning i lungekræft er associeret til histon ændringer snarere end DNA hypermethylering.

Materialer og metoder

Cell kultur

Calu-1 (NSCLC) og MRC5 (normale humane fibroblaster afledt af føtale lunge fibroblast) celler blev dyrket i DMEM. Medier blev suppleret med 10% varme-inaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 100 U /ml penicillin /streptomycin.

Lungekræft prøver

I alt 34 Formalin -Faste, paraffinindlejrede (FFPE) vævsprøver bestående af både adeno og planocellulært karcinom blev indsamlet fra arkiverne i Patologisk Institut, University Hospital of Kuopio, Finland. Tilladelse til at bruge materialet blev opnået fra den nationale tilsynsmyndighed for velfærd og sundhed Finland og undersøgelsen blev accepteret af etiske komité af den nordlige Savo Hospital District, Kuopio, Finland.

RNA ekstraktion og Real-Time PCR

cellekultur.

Total RNA’er (miRNA og mRNA) af Calu-1 og MRC5 celler blev ekstraheret under anvendelse miRNeasy mini Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol.

vævsprøve: Salg Total RNA (miRNA og mRNA) fra FFPE vævsprøver blev ekstraheret under anvendelse RECOVERALL Total Nucleic Acid isolation Kit (Ambion) ifølge producentens protokol. Revers transkription af totalt miRNA og mRNA blev udført under anvendelse 500 ng (fra cellekultur) eller 50 ng (fra FFPE vævsprøver) af total RNA /prøve ved miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol. Kvantitativ analyse af MIR-212, EZH2, G9A og HDAC blev udført ved RealTime PCR under anvendelse miScript SYBR Green PCR-kittet (Qiagen) ifølge producentens protokol. Som intern reference, vi brugte RNU5A og GAPDH. EZH2 undtagen (Fw: CCACCATTAATGTGCTGGAA Rv: TTCCTTGGAGGAGTATCCACA) alle anvendte primere blev indkøbt fra Qiagen. Omsætningen til detektion af miRNA og mRNA’er blev udført som tidligere beskrevet [12]. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer for hvert datapunkt, og blev udført dataanalyse ved hjælp af software (Bio-Rad)

DNA Methyleringsanalyse

CpG Island Searcher program (http:. //www.cpgislands.com/) blev anvendt til at fastslå, at mIR-212-kodende region er indlejret i et CpG island. DNA methylering status blev evalueret ved sekvensanalyse af bisulfit modificerede genomisk DNA indeholdt i den tilsvarende CpG øen. Bisulfitbehandling inducerer kemisk omdannelse af ikke-methyleret cytosin til uracil forlader methyleret cytosin uændret. Genomisk DNA blev modificeret under anvendelse af EZ DNA-methylering Kit (Zymo Research) ifølge fabrikantens protokol. Bisulfit behandlede DNA blev anvendt som template til amplifikation regionen, herunder MIR-212 transkriptionsstartstedet på revers streng under anvendelse af de følgende primere: 5′-TTTTGGGTGGTATTTGAATTTT-3 ‘; RV 5’-CCCCTCCTCAATTCCTAAA-3 ‘. Derefter blev PCR-produkter klones ind i p-GEM-T Easy Vector System II (Promega), og otte uafhængige kloner fra hver prøve blev sekventeret.

chromatin immunpræcipitationsanalyse

kromatin immunopræcipitationsanalyser blev udført under anvendelse Lowcell chIP Kit (Diagenode) ifølge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev cellerne behandlet med 1% formaldehyd, et tværbindingsmiddel, i 10 min. Derefter kromatin blev klippet med en Bioruptor (Diagenode) til en gennemsnitlig længde på 0,4-0,8 kb. Sheared chromatin blev immunopræcipiteret i 16 timer ved 4 ° C under anvendelse af følgende antistoffer: anti-thrimethyl-K4 histon H3, anti-thrimethyl-K27 histon H3, anti-dimethyl-K9 histon H3 og anti-acetyl-K9 histon H3 (Diagenode) . Desuden blev 1/100 af opsamlet før tilsætning antistofopløsningen anvendt som en intern kontrol for mængden af ​​indført DNA. Real-Time PCR blev udført i 25 pi indeholdende 5 pi af immunopræcipiterede DNA, 12,5 pi SYBR green PCR Master Mix (Qiagen) og 150 nM af specifikke primere (FW 5′-GGAGTCCAGCTTCCTCTCCT-3 ‘; RV 5’-GCTCCTGGGGGTCTTCAC) . PCR-protokol indebar 10 minutter ved 95 ° C og 40 cykler af 15 sekunder ved 94 ° C og 1 min ved 60 ° C. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer for hvert datapunkt, og blev udført dataanalyse ved hjælp af software (Bio-Rad).

Små interfererende RNA transfektion

siRNA duplex til negativ kontrol og EZH2 mRNA (Dharmacon) blev transient transficeret i 48 timer i Calu-1-celler under anvendelse af LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Derefter blev ekspressions værdier af EZH2 og MIR-212 niveauer evalueret af Real-Time PCR og western blot-analyse. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer for hvert datapunkt.

Protein isolation og Western blotting

Celler blev vasket to gange i iskold PBS, og lyseret i JS-buffer (50 mM HEPES pH 7,5 indeholdende 150 mM NaCl, 1% glycerol, 1% Triton × 100, 1,5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, og 1 × proteaseinhibitorcocktail). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford assay (Biorad) under anvendelse af bovint serumalbumin som standard, og lige mængder af proteiner blev analyseret ved SDS-PAGE (12,5% acrylamid). Geler blev elektroblottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Bedford, MA).