PLoS ONE: S6K1 og 4E-BP1 Er Uafhængig Reguleret og Kontrol Cellular Vækst i Blære Cancer

Abstrakt

Aberrant aktivering og mutation status proteiner i phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /Akt /pattedyr mål af rapamycin (mTOR) og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signalveje er blevet knyttet til tumorigenese i forskellige tumorer, herunder urothelial carcinoma (UC). Imidlertid antitumorterapi med småmolekylære inhibitorer mod mTOR viste sig at være mindre vellykket end forventet. Vi kendetegnet den molekylære mekanisme af denne vej hos urothelial carcinoma ved at interferere med forskellige molekylære komponenter ved hjælp små kemiske inhibitorer og siRNA teknologi og analyseret effekter på molekylært aktiveringsstatus, cellevækst, proliferation og apoptose. I et flertal af testede cellelinier blev observeret konstitutiv aktivering af PI3K. Manipulation af mTOR eller Akt ekspression eller aktivitet kun reguleres fosforylering af S6K1 men ikke 4E-BP1. I stedet giver vi bevis for et alternativ mTOR uafhængige, men PI3K afhængig regulering af 4E-BP1. Kun den samtidige inhibering af både S6K1 og 4E-BP1 undertrykt cellevækst effektivt. Krydstale mellem PI3K og MAPK-signalvejen medieres via PI3K og indirekte ved S6K1 aktivitet. Hæmning af MEK1 /2 resulterer i aktivering i Akt men ikke mTOR /S6K1 eller 4E-BP1. Vores data tyder på, at 4E-BP1 er en potentiel ny målmolekyle og lagdeling markør for anti kræftbehandling i UC og støtte behandlingen af ​​en multi-targeting tilgang mod PI3K, mTORC1 /2 og MAPK

Henvisning:. Nawroth R, Stellwagen F, Schulz WA, Stoehr R, Hartmann A, Krause BJ, et al. (2011) S6K1 og 4E-BP1 Er Uafhængig Reguleret og Kontrol Cellular Vækst i blærekræft. PLoS ONE 6 (11): e27509. doi: 10,1371 /journal.pone.0027509

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: August 3, 2011; Accepteret: 18 oktober 2011; Udgivet 15. november, 2011

Copyright: © 2011 Nawroth et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af Siegfried Gruber Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den femte mest almindelige kræftform i verden med en anslået 357.000 nye tilfælde og 145.000 dødsfald i 2010 [1]. Urotelial carcinom (UC), der repræsenterer 90% af alle blæretumorer er en heterogen enhed bestående af papillære tumorer og faste invasive carcinomer, som kræver radikal behandling, når de har nået ind i den muskulære lag af blæren. Hvis ubehandlet, vil omkring 85% af patienter med invasiv blæretumor dør af sygdomsprogression inden for to år fra diagnose [2]. Radikal cystektomi med bækken lymfeknude dissektion er standarden for pleje for muskel-invasiv blærekræft. Med kan opnås denne fremgangsmåde 5 års progressionsfri overlevelsesrater sandsynligheder for 65-68% på tværs af alle tumor stadier [3], [4]. Trods fremskridt i cisplatin kemoterapi til patienter med metastatisk sygdom, den mediane samlede 5-års overlevelse tid er begrænset til 14-15 måneder [5]. Således nye terapeutiske tilgange er meget ønskeligt. Bedre viden om afvigende aktivering af celle signalveje, der er involveret i tumorigenese af blæren kan give egnede molekylære mål for nye behandlingsformer [6], [7], [8]. En sådan vej er PI3K /Akt /mTOR-signalvejen, som er blevet forbundet med tumorigenese i mange væv [9], [10].

Normalt ved aktivering af tyrosin receptorkinaser eller RAS-proteiner PI3K konverterer phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphat (PIP

2) i phosphatidylinsositol-3,4,5-trisphosphat (PIP

3). Denne reaktion kan vendes ved PI3K antagonisten PTEN (phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom 10). PIP

3 rekrutter PDK1 (protein afhængig kinase 1) til cellemembranen hvor det binder og phosphorylerer Akt ved aminosyrerest T308. Akt betragtes som den mest kritiske signalering node i denne pathway regulering forskellige substrater påvirker cellulære processer involveret i kontrollen af ​​cellevækst og overlevelse [11]. Akt signalering konvergerer gennem knolde sclerose proteiner 1/2 (TSC1 /2) og den lille GTPase Rheb på mTOR, en serin /threonin-kinase, som danner to adskilte proteinkomplekser med enten raptor (regulatorisk-associeret protein af mTOR), hvilket gav mTORC1 eller Rictor (rapamycin ufølsom følgesvend af mTOR), hvilket gav mTORC2 [10]. mTORC2 kan aktiveres ved PI3K direkte og phosphorylerer Akt ved S473, som sammen med phosphorylering på T308 resulterer i fuld aktivering af Akt [12], [13]. Akt phosphoryleret ved S473 er ​​blevet forbundet med dårlig prognose i mange cancere herunder bugspytkirtlen, leveren, prostata og bryst [13]. De bedst definerede substrater af mTORC1 er de kinaser p70S6K1 (S6K1) og eIF4E-bindende protein 1 (4E-BP1), som begge er vigtige i kontrollen af ​​protein translationsinitiering [14], [15], [16]. Dephosphoryleret 4E-BP1 kan binde til elF4E proteinkompleks at forhindre cap-afhængig translation og spiller en vigtig rolle i mediering signaling begivenheder af PI3K og MAPK-vejen i tumorer [15]. Phosphoryleret S6K1 er nødvendig for oversættelse af 5′-terminal oligopyrimidine (TOP) mRNA. Dephosphorylering af S6K1 resulterer i en tilbagekoblingssløjfe, der resulterer i opregulering af receptortyrosinkinaser eller insulin receptor substratproteiner (IRS), som derefter aktiverer PI3K og også MAPK signalvejen [17], [18]. Krydstale mellem PI3K og MAPK signalering netværket forekommer også i form af RAS og ERK1 /2, ved at aktivere PI3K og derudover mTORC1 gennem TSC1 /2 [19], [20], [21], [22].

mTORC1 kan selektivt inhiberes ved rapamycin, et makrolid antibiotikum, der i et kompleks med det cytosoliske protein FKBP12 inhiberer mTORC1 og ved højere koncentrationer også mTORC2 [23], [24]. Nye mTOR-hæmmere i klinisk brug såsom everolimus (RAD001) eller temsirolimus (CCI-779) er derivater af rapamycin. Administreret som anti-tumor narkotika, responsraterne hos patienter adskiller sig fra 0-30% afhængig af tumoren [25]. Der er mistanke om, at den største begrænsning i den kliniske anvendelse af mTOR-hæmmere resultater fra mTORC1-S6K1-PI3K feedback-sløjfe. Dette resulterede i udviklingen af ​​inhibitorer, der er målrettet både, PI3K og mTOR, såsom NVP-BEZ235 en imidazo [4,5-c] quinolin-derivat [24].

I UC, genetiske ændringer i PI3K pathway er almindelige og forekommer oftest i PIK3CA, PTEN, Akt eller TSC1 /2 [26]. PTEN deletioner og mutationer samt formindsket proteinekspression findes især ved højere tumor stadier og kvaliteter. Phosphoryleret S6K1 er en uafhængig prædiktor for sygdomsspecifikke overlevelse [27], [28]. I prækliniske undersøgelser med UC cellelinier, PI3K inhibering med LY294002 udviste afhængig cellelinie anvendes minimal til 40% reduktion af proliferative virkninger og blokeret celleinvasion [29], [30], [31]. Rekonstituering af PTEN undertrykte tumorvækst og genetisk lyddæmpning af Akt medførte øget radiosensitivitet af tumorcellerne [27], [32]. Den potentielle anvendelse af rapamycinderivater i UC-terapi blev støttet af deres evne til at reducere cellernes levedygtighed i forskellige blære cancer-afledte cellelinjer og i en musemodel af progressiv blærekræft, hvor p53 og PTEN slettes i blæren urothelium [9], [33], [34], [35], [36]. På trods af disse lovende prækliniske observationer, foreløbige resultater fra en enkelt-arm, fase II forsøg med everolimus som monoterapi viste kun beskeden antitumoraktivitet hos patienter med metastatisk UC [37]. Data om den funktionelle rolle og molekylære mekanisme af PI3K /Akt /mTOR og MAPK signalveje i UC er meget begrænset til dato, og kan ikke forklare de kliniske resultater. Således har vi karakteriseret den molekylære mekanisme i PI3K /AKT /mTOR signalvejen og dens cross-regulering med MAPK pathway in vitro i cellelinjer huser typiske mutationer for UC. Funktionelle konsekvenser på cellesignalerende begivenheder og cellevækst blev undersøgt efter farmakologisk eller genetisk indgreb i forskellige molekylære bestanddele af denne vej via småmolekylære inhibitorer eller siRNA /shRNA oligonukleotider. Vores resultater giver ny indsigt i den molekylære netværk af signalveje undersøgt, at resultatet i et rationale for nye behandlingsstrategier og foreslår kandidat proteiner til molekylær lagdeling for patienter, der lider metastatisk UC.

Materialer og Metoder

cellelinjer og reagenser

cellelinjer RT4, HT1376, 647V, 486P, J82, 253J, EJ28, T24 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) og RT112 (tysk samling af mikroorganismer og cellekulturer) blev holdt ved 37 ° C i RPMI 1640 eller DMEM suppleret med 10% FCS i en fugtig atmosfære indeholdende 5% eller 7,5% CO

2. NVP-BEZ235 og RAD001 blev venligst stillet til rådighed af Novartis Pharma. U0126 blev købt fra Cell Signaling Technology og LY294002 fra Promega. Stamopløsninger blev fremstillet i DMSO. Arbejdsopløsninger var frisk tilberedt i cellekultur medium ved afbildede koncentrationer.

Konstruktioner, transfektion og infektion

siRNA oligonukleotider mod 4E-BP1, S6K1 og kontrol blev designet af og indkøbt fra Qiagen GmbH og Akt 1, -2, -3 stealth siRNA oligonukleotider fra Invitrogen. Forbigående transfektioner blev udført under anvendelse af X-treme gen transfektion eller lipofectamin-reagens (Roche Diagnostics, Invitrogen) ifølge producentens instruktioner, under anvendelse af 2 ug /siRNA /6 brønde. For tredobbelt transfektion adenovirus mTOR shRNA og kontrol shRNA blev købt fra SIRION Biotech. 1,5 × 10

5-celler blev podet på plader med 6 brønde én dag før infektion og adenoviruspartikler tilsat ved en infektionsmultiplicitet på 30. Suppression af protein-ekspression blev analyseret ved immunoblots 2-6 dage efter transfektion eller infektion.

immunblotting og antistoffer Salg

Celler blev lyseret i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, proteaseinhibitorcocktail (Roche Diagnostics ), phosphataseinhibitor Mix (SERVA) i 20 min på is. Uopløseligt materiale blev pelleteret ved centrifugering i 30 minutter ved 4 ° C blev 30.000 g. Proteinkoncentrationen kvantificeret med BCA ™ protein Assay (Pierce). Lige store mængder protein blev . underkastet SDS-PAGE på 7,5 til 12% polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membran (Zefa) for immunoblotting, de anvendte antistoffer omfattede: Akt (C67E7), Akt1, Akt2, Akt3, Phospho-Akt (Ser473), Phospho-Akt (Thr308), GSK3p, Phospho-GSK3p (Ser9), mTOR, Phospho-mTOR (Ser2448), 4E-BP1, Phospho-4E-BP1 (Thr37 /46), S6K1, Phospho-S6K1 (Thr389), S6RP, phospho- S6RP, P44 /42 MAPK, Phospho-P44 /42 MAPK, c-Raf, Phospho-c-Raf (Ser338) (cellesignalering Technologies). Sekundære HRPO-konjugerede antistoffer blev købt hos Dianova. Immunoblotting blev udført som beskrevet tidligere eller modificeret i overensstemmelse med producentens anbefaling [38]. ECL-reaktion blev visualiseret ved hjælp af Hyperfilm ECL autoradiografi film (GE Healthcare). For kvantificering blev kemiluminescens signal analyseres via ChemiDoc ™ XRS og Mængde one® Software fra Bio-Rad Laboratories, Inc.

Cellevækst

At evaluere cellevækst, celler blev podet ved 1000 celler /96 brønde og behandlet som beskrevet. Efter høst blev cellerne farvet med trypane blå og levende celler blev talt i et Neubauer kammer.

Cell spredning

Cell proliferation blev målt 24 timer efter behandling af celler med RAD001, NVP-BEZ235 og U0126 eller 48-72 timer efter transfektion /infektion med siRNA’er /shRNAs. Bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering til påvisning af nyligt syntetiseret DNA og 7-amino-actinomycin D (7-AAD) farvning for detektion af dobbeltstrenget DNA blev udført ved anvendelse af en APC BrdU Flow Kit (BD Biosciences) ved at pulsere cellerne i to timer efter producentens protokol efterfulgt af flowcytometri analyse.

Apoptose assay

Apoptose blev påvist ved måling af en aktivitet af caspase 3/7 ved anvendelse af caspase-Glo 3/7 assay fra Promega GmbH, ifølge producentens protokol.

Cellelevedygtighed

Celler blev behandlet med RAD001, NVP-BEZ235 og U0126 i plader med 96 brønde. Ved 36 timer blev cellerne inkuberet i 3 timer med XTT. Den enzymatiske reaktion blev analyseret ved 450 og 650 nm i en ELISA-læser.

Statistisk analyse

Student T-test blev anvendt til at sammenligne midlerne i forskellige grupper. Statistiske beregninger blev udført ved hjælp af Microsoft Office Excel.

Resultater

Expression og aktivering status PI3K /Akt /mTOR pathway i urotelial karcinom cellelinjer

Vi analyserede udtryk og aktivering status af molekylære nøglekomponenter i PI3K pathway i et panel af 9 UC afledte cellelinier. Celler blev høstet og lyseret for protein analyse i et subkonfluent fase. Ekspression af Akt, mTOR, S6K1, S6RP, 4E-BP1 og PTEN blev påvist i alle cellelinjer (figur 1A). Phosphorylering af Akt på T308 og S473 og mTOR, 4E-BP1, S6K1 og S6RP blev observeret i 7 ud af 9 cellelinier. Ingen aktivering af Akt kunne påvises i RT4 og 647V-celler. I disse to cellelinjer mTOR, S6K1 og S6RP fosforylering blev reduceret betydeligt, mens 4E-BP1 stadig var phosphoryleret i RT4 celler. Således er størstedelen af ​​de undersøgte cellelinier udviste en konstitutivt aktiveret PI3K /Akt /mTOR-signalvejen. Ekspression af PTEN forhindrer ikke denne aktivering under de undersøgte vækstbetingelser. For yderligere forsøg besluttede vi at arbejde med de to UC cellelinier RT112 (overekspression FGFR3) og T24 (onkogene H-Ras, homozygot PTEN mutation), både udstiller ofte findes genomiske forandringer i blærekræft [39], [40], [41 ]

A:. til proteinanalyse blev celler lyseret i RIPA-buffer anvendt til SDS-PAGE og overført til PVDF-membran. Phosphorylering og ekspression status proteiner blev analyseret i immunoblots. B, C: Cellelinier blev behandlet i 1 time med de angivne koncentrationer af RAD001 og NVP-BEZ235. Styringen (0) indeholdt samme koncentration af DMSO som i prøver med kemiske forbindelser. Et repræsentativt resultat fra 3 uafhængige eksperimenter er vist. D: Den inhibitoriske koncentration på 50% (IC50) blev bestemt for målproteiner af PI3K og mTORC1. Kemiluminescens-signaler blev kvantificeret ved anvendelse af ChemiDoc billeddannende system (BioRad Laboratories) og normaliseret til proteinekspression niveau. De gennemsnitlige værdier fra tre eller flere uafhængige forsøg er vist

RAD001 /CCI-779 og NVP-BEZ235 blok PI3K og mTOR downstream mål i en dosisafhængig måde -. MTORC1 uafhængig regulering af 4E-BP1

for at karakterisere den funktionelle relevans af denne vej i UC vi brugt rapamycinderivater RAD001 og CCI-779 og PI3K-inhibitor NVP-BEZ235. Da virkningerne af CCI-779 og RAD001 behandling var identiske vi kun skildrer RAD001 resultater. Først blev dosis-respons-assays udført for at vurdere aktiviteten af ​​RAD001 og NVP-BEZ235 1 time efter cellulær behandling. Aktivitet af forbindelserne var præget af phosphorylering mønster af S6K1 /S6RP /4E-BP1 for begge stoffer og derudover for Akt ved brug af NVP-BEZ235. Signalintensiteter blev målt ved en kemiluminescens imaging system og inhibitoriske koncentrationer på 50% (IC50) for phosphorylering niveau normaliseret til proteinniveauet blev beregnet (figur 1B, D). RAD001 inhiberede phosphorylering af S6K1 og S6RP men ikke af 4E-BP1 (figur 1B). Når udsætte celler for NVP-BEZ235, inhibering af S6K1 /S6RP blev observeret ved lavere IC50 koncentrationer end dem, der er nødvendige for at hæmme Akt phosphorylering på T308 /S473 (figur 1C, D). 4E-BP1 fosforylering blev stærkt formindsket ved koncentrationer, der korrelerede med der er nødvendige for Akt hæmning. Således hæmning af mTORC1 ved rapamycinderivater reguleres kun S6K1 /S6RP fosforylering mens hæmning af PI3K og mTORC1 /2 hæmmede både, S6K1 og 4E-BP1 /S6RP fosforylering. T24 celler reagerede på lignende koncentration til RAD001 behandling som RT112 men 3 gange så følsomme over for NVP-BEZ235 behandling.

Langtidsbehandling med RAD001 og NVP-BEZ235 resultater i S6K1 medieret hyperaktivering af PI3K /Akt

det er blevet beskrevet, at S6K1 aktivering resulterer i en negativ feedback loop regulering ikke kun PI3K aktivitet, som er sandsynligvis ansvarlig for den begrænsede succes med rapamycinderivater i klinisk anvendelse [17]. Således har vi rettet virkningen af ​​forbindelserne anvendt på denne feedback-sløjfe. Vi anvendte tre forskellige koncentrationer af RAD001 og NVP-BEZ235 der resulterede i ca. 50% til 100% inhibering af deres molekylære mål og analyserede virkninger på PI3K signaling pathway aktivering over en periode på 72 timer. RAD001 behandling resulterede i S6K1 dephosphorylering og induceret hyperphosphorylering af Akt om T308 og S473 på en koncentrationsafhængig måde i hele observationsperioden (1-72 h) i RT112 celler mens Akt hyperactivation i T24 celler blev induceret kun 24-72 timer efter behandling (figur 1B /C, 2A, data for 72 timer ikke vist). Aktiveringen status Akt nedstrømsmål GSK3-β korrelerede med phosphoryleringen niveauet af Akt i begge cellelinier (figur 2A). 4E-BP1 fosforylering eller proteinniveau blev ikke påvirket af RAD001 behandling. Ved brug NVP-BEZ235 den indledende dephosphorylering af Akt 1 time efter behandling vendes efter 24 timer og endda koncentrationer 100-fold over IC50 ikke var tilstrækkelige til at forhindre phosphorylering på T308 og kun delvist på S473 (figur 2B). Svarende til aktiveringsstatus af Akt iagttoges phosphorylering af Akt substrat GSK3-β. Især gentagen behandling med frisk fremstillet NVP-BEZ235 1 time, før høst af cellerne forhindrede ikke denne hyperaktivering af Akt (data ikke vist). Phosphorylering af 4E-BP1 forblev undertrykt i hele observationsperioden (Figur 2C)

A, B:. Effekt af RAD001 eller NVP-BEZ235 behandling i løbet af 24 timer på phosphoryleringsniveauet af Akt, S6K1, 4E-BP1 og GSK3 -β i RT112 og T24-celler. Hele cellelysater blev anvendt til SDS-PAGE og blottet på PVDF-membraner efterfulgt af immunblots at påvise ekspression og phosphorylering niveau afbildede proteiner. Styringen (0) indeholdt samme koncentration af DMSO som i prøver med kemiske forbindelser. C: RT112 celler blev transficeret med to uafhængige S6K1 specifikke siRNA oligonukleotider og en tilfældig siRNA oligonukleotid som kontrol (CTR siRNA). Tre dage efter transfektion, udtryk og fosforylering niveau af S6K1, Akt og GSK3-β blev analyseret i immunoblots.

Om S6K1 direkte induceret PI3K /Akt aktivitet blev behandlet af lyddæmpende S6K1 udtryk ved hjælp af to specifikke siRNAs rettet mod S6K1. To dage efter transfektion, western blot-analyser viste en reduktion i S6K1 proteinniveauet (figur 2C) 90-96%. Den nedregulering af S6K1 udtryk korreleret med hyperphosphorylering af Akt på S473 og T308 og GSK3-β, støtter den beskrevne S6K1-PI3K /Akt feedback-sløjfe.

Hæmning af PI3K /mTOR men hverken lyddæmpning af mTOR eller Akt udtryk regulerer 4E-BP1 fosforylering

Disse resultater fik os til at karakterisere signalering kredsløb af PI3K, mTOR, Akt og 4E-BP1 nærmere. I de fleste foreslåede modeller, S6K1 og 4E-BP1 er nedstrøms mål for Akt og mTORC1 og fosforylering i de fleste rapporter er samtidig reguleret [14], [15]. Vores resultater viser, at kun UC celler behandlet med NVP-BEZ235 men ikke RAD001 udstillet undertrykkelse af både S6K1 og 4E-BP1 fosforylering tyder på, at 4E-BP1 er reguleret forskelligt end S6K1. Da NVP-BEZ235 mål medlemmer af PI3K-protein-familien, kan PI3K eller dets nedstrømsmål Akt eller mTOR være involveret i regulering 4E-BP1 phosphorylering. Vi først testet, hvis vi kunne verificere virkninger NVP-BEZ235 ved hjælp af grundigt karakteriseret kinase inhibitor LY293002 som oprindeligt blev designet som en specifik PI3K inhibitor, men viser også aktivitet over for andre PI3K ikke-relaterede kinaser [42], [43]. S6K1 phosphorylering blev reduceret med en IC50 på 3 nM hvorimod IC50 fordoblet til 7 nM til at inducere en reduktion i Akt (S473 /T308) og 4E-BP1 phosphorylering, hvilket ligner kinetikken for NVP-BEZ235 aktivitet på Akt /4E-BP1 phosphorylering (figur 3A og 1B)

A:. Dosisrespons assay med celler behandlet 24 timer med PI3K-inhibitoren LY294002. Cellelysater blev analyseret i immunoblots viser dosisafhængige virkninger på ekspression og phosphorylering niveau af Akt, S6K1 og 4E-BP1 i RT112 celler. B: Silencing af mTOR udtryk 3 dage efter infektion med adenoviral mTOR shRNA eller kontrol shRNA (ctr shRNA). Hele cellelysater blev analyseret i immunoblots for phosphorylering og ekspressionsniveauet af S6K1, S6RP, Akt og 4E-BP1. C: Akt ekspression regulerer phosphorylering af S6K1 men ikke 4E-BP1. Transfektion af celler med specifikke stealth siRNA oligonukleotider eller kontrol siRNA tavshed ekspression af alle tre isoformer af Akt. 3 dage efter transfektion blev celler lyseret anvendt på SDS-PAGE blottet til PVDF membran og ekspressionsniveauet af Akt isoformer og udtryk og phosphorylering niveau af 4E-BP1 og S6K1 blev analyseret.

For yderligere at undersøge denne observation, brugte vi en adenoviral shRNA tilgang til tavshed mTOR protein udtryk, som bør resultere i konkrete inaktivering af både, mTORC1 og mTORC2 proteinkomplekser. To dage efter infektion, analyser western blot bekræftet en 85-96% knockdown i mTOR proteinniveauet der forblev stabil i 5 dage (figur 3B). Knockdown resulterede i dephosphorylering af S6K1 og S6RP uden at påvirke protein ekspressionsniveau. Kun mindre effekter på 4E-BP1 fosforylering i forhold til 4E-BP1 proteinniveauet blev opdaget. Især blev Akt fosforylering reduceret med 40-60% på T308 og S473-rester.

Endelig har indflydelse Akt om 4E-BP1 fosforylering blev karakteriseret ved hjælp af siRNA’er rettet mod de tre forskellige isoformer af Akt. Tre dage efter transfektion, den kombinerede vælte af alle tre isoformer resulterede i 90% reduceret protein ekspression af alle tre Akt isoformer (figur 3C). Kun S6K1 fosforylering, men ikke 4E-BP1 fosforylering niveau blev reduceret uden at påvirke protein niveau, der angiver, at 4E-BP1 modsætning S6K1 ikke nedstrøms Akt i de undersøgte cellelinier.

Krydstale mellem PI3K og MAPK signalvejen sker ved flere trin

i betragtning af betydningen af ​​PI3K og MAPK pathway biologi, vi undersøgte samspillet mellem de to veje i blærekræft. Celler blev behandlet med RAD001, NVP-BEZ235 eller med MEK1 /2-inhibitoren U0126 og aktiveringsstatus af centrale proteiner i begge pathways 1-72 timer efter behandling blev analyseret i western blots. Inhibering af mTORC1 af RAD001 induceret aktivering af ERK1 /2 phosphorylering 24-72 timer efter behandling (figur 4A, øvre panel). Den samme virkning blev observeret, når silencing S6K1 proteinekspression som resulterede i forøget Raf1 /ERK1 /2 phosphorylering (figur 4B). Men hæmning af både PI3K og mTOR af NVP-BEZ235 hurtigt induceret ERK1 /2 phosphorylering hele den observerede periode på 1-72 timer (figur 4A, nedre panel). Vi konkluderer, at undertrykkelsen af ​​PI3K /Akt /mTOR aktivitet resulterer generelt i aktivering af Raf /MEK /ERK signalvej, men kinetikken af ​​processen afhænger af, hvilke molekylært mål i den tidligere pathway inhiberes

A.: RT112 og T24-celler blev behandlet med RAD001 eller NVP-BEZ235 i 1 time eller 24 timer. Ekspression og phosphorylering status ERK1 /2 blev analyseret i immunoblots på helcellelysater. B: To dage efter transfektion med siRNA oligonukleotider mod S6K1 eller kontrol siRNA (CTR siRNA), cellerne blev lyseret og phosphorylering og ekspression status Raf og ERK1 /2 blev analyseret i immunoblots. C: Cellerne blev behandlet i 24 timer med RAD001, NVP-BEZ235 og U0126 alene eller i kombination, og effekter på udtryk og phosphorylering niveau af Akt, S6K1 og ERK1 /2 blev analyseret i immunoblots

Vi. derefter analyseret de biokemiske konsekvenser, når inhibering både PI3K /AKT /mTOR og MAPK-vejen under anvendelse RAD001, NVP-BEZ235 eller U0126 i kombination eller U0126 alene. Når celler blev behandlet med U0126 alene, blev ERK1 /2 phosphorylering helt afskaffet henviser Akt phosphorylering på S473 og T308 blev opreguleret (figur 4C). Interessant, kunne vi ikke påvise eventuelle ændringer i S6K1 phosphorylering. Ved kombination af U0126 med enten RAD001 eller NVP-BEZ235 blev Akt hyperphosphorylering væsentligt forøget i forhold til behandling med enten enkelt stof i T24-celler.

PI3K /AKT /mTOR og MAPK signalering regulere celleproliferation, levedygtighed og apoptose

Næste vi besluttet, hvordan manipulation af PI3K og MAPK signalering påvirkninger celleproliferation i UC. Først blev celler behandlet med RAD001, NVP-BEZ235 og U0126 alene eller i kombination og celleproliferation blev overvåget over tid. Tre dage efter behandling, RAD001 inhiberede celleproliferation med 62% i RT112 og 40% i T24 celler i forhold til opløsningsmidlet kontrol (figur 5A). Behandling med NVP-BEZ235 fuldstændig hæmmet celleproliferation i RT112 celler og reducerede det med 66% i T24-celler. U0126 behandling inhiberede proliferation med 70% og 76% i RT112 eller T24-celler. Kombination RAD001 eller NVP-BEZ235 med U0126 kun givet additiv effekt, med kombinationen af ​​NVP-BEZ235 /U0126 er mest effektive (figur 5A). For at karakterisere disse virkninger i mere detaljeret, blev cellecyklusanalyse målt ved at kombinere inkorporering af BrdU og 7-AAD-farvning, den apoptotiske respons ved måling caspaseaktivitet og levedygtighed /metabolisme ved XTT-assays. Som for cellecyklusanalyse, RAD001 behandling formindsket den del af celler, som undergår S-fase ved 11% i begge cellelinier (figur 5B). NVP-BEZ235 reducerede S-fase celler med 84% i RT112 og med 22% i T24, mens U0126 reducerede celler i S-fase ved 97% i T24, men kun med 52% i RT112 celler. Kombinationen af ​​PI3K og MAPK signalering hæmmere havde additive virkninger på celleproliferation med kombinationen af ​​NVP-BEZ235 /U0126 er mest effektive til at reducere celle numre i S-fase ved 94-98%. Alle stoffer inducerede en forøgelse af celler standset i G1-fasen, som korreleret til faldet i celler ind S-fase, hvilket indikerer, at inhiberingen af ​​enten pathway resulterer i G1 arrest i UC cellelinier (figur 5B). Apoptose blev målt ved caspaseaktivitet (figur 5C) [11]. Både, RAD001 og NVP-BEZ235 behandling faldt caspaseaktivering i RT112 celler med 32-45%. I T24-celler, RAD001 og NVP-BEZ235 reduceret caspaseaktivitet med 43-48%. U0126 havde ingen signifikant effekt på caspase aktivitet og steg ikke aktiviteten af ​​RAD001 eller NVP-BEZ235 når de kombineres. Til måling af cellelevedygtighed, blev samme antal celler analyseret ved anvendelse af et XTT-assay. Afhængig af den cellulære baggrund, observerede vi en reduktion på 30-50% med RAD001 og 70-85% med NVP-BEZ235 (figur 5D). Interessant, kunne vi ikke registrere additive virkninger ved den kombinerede hæmning af PI3K /Akt /mTOR og MAPK veje. Vi konkluderer, at PI3K /mTOR og MAPK pathway aktivitet i UC kontrol celleproliferation, apoptose og celle vitalitet og at begge veje delvist kan erstatte tabet af hinanden med hensyn til spredning.

RT112 og T24 celler blev behandlet med RAD001 (5 nM), NVP-BEZ235 (100 nM for T24, 500 nM for RT112) og U0126 (25 nM) alene eller den angivne kombination, og en DMSO-kontrol (CTR). A: For celletal, celler blev farvet med trypanblåt og antal levende celler blev bestemt. B: Cell cyklus analyse efter 24 timers behandling med kemiske forbindelser ved BrdU inkorporering i kombination med 7-AAD farvning. C: Måling af caspase 3/7 aktivitet som parameter for apoptose og D: XTT-test til påvisning af cellelevedygtighed udført 24 timer efter behandling. De viste værdier er gennemsnit ± standardafvigelse fra 3 uafhængige eksperimenter. Student t-test blev udført for statistisk analyse. (*: P 0,05)

Den kombinerede aktivitet S6K1 og 4E-BP1 regulere celledeling i urotelial karcinom

Endelig vi fat på spørgsmålet om, hvorfor NVP-BEZ235 påvirker cellevækst mere virkningsfuldt end RAD001. Vi viste, at NVP-BEZ235 modsætning RAD001 påvirker både, S6K1 og 4E-BP1 phosphorylering. Således har vi brugt enten siRNA oligonukleotider rettet mod S6K1 eller 4E-BP1 eller kombinerede RAD001 med 4E-BP1 siRNAs at efterligne den formodede ekstra effekt af NVP-BEZ235. To dage efter transfektion siRNA’er mod 4E-BP1 eller S6K1 reducerede protein-ekspression med 80-96% (figur 6A, 2C). Celler tavshed for S6K1 eller 4E-BP1 udtryk udstillet væsentligt reduceret celleproliferation med 40% (RT112) til 60% (T24) sammenlignet med kontroller (Fig. 6B), hvilket giver virkninger svarende til dem, der observeres efter everolimus behandling (figur 5A). Kombinationen af ​​4E-BP1 siRNA og everolimus behandling reducerede cellevækst med 80-85%, i samme grad som observeret med NVP-BEZ235. Analyse af celleproliferation viste, at effekten igen blev medieret af standsning af cellecyklus i G1 /G0 fase (data ikke vist). Sammenfattende både mTORC1 nedstrømsmål S6K1 og 4E-BP1 er et tilsvarende omfang involveret i reguleringen af ​​UC-celleproliferation ved at styre cellecyklusprogression fra G1 /0 til S-fase og cellelevedygtighed Salg

Sv:. To dage efter transfektion med siRNA’er mod 4E-BP-1, protein ekspression i RT112 og T24-celler blev påvist i immunoblots. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. B: Vækst af levende celler, tavse for S6K1 eller 4E-BP1 udtryk eller celler tavse til 4E-BP1 udtryk og inkuberet med everolimus (RAD001) blev overvåget over tid. Middelværdier ± standardafvigelser er vist; statistiske sammenligninger blev udført ved hjælp af Student t-test. (*: p 0,05)

Diskussion

På trods af en bedre forståelse af blærekræft biologi inden de seneste år, kun mindre forbedringer i det terapeutiske håndtering af denne sygdom er blevet opnået i løbet af de sidste to årtier. PI3K /Akt /mTOR og MAPK signalveje er tilbøjelige til at mutationer og afvigende aktivering i denne tumor enhed og kan give egnede mål for mere effektive behandlingsformer [44]. Derfor vi karakteriseret både signalveje i forbindelse med aktivering status, molekylær mekanisme og relevans for celleproliferation i UC. Vi kunne bekræfte tidligere beskrevne regulatoriske kredsløbssystemer, der styrer aktivering af disse veje.