PLoS ONE: Afdækning direkte mål for MIR-19a Involveret i lungekræft Progression

Abstrakt

Micro RNA (miRNA) regulere ekspressionen af ​​målgener posttranscriptionally ved parring ufuldstændigt med mRNA i en sekvens-specifik måde. Omkring 30% af humane gener reguleres af miRNA, og en enkelt miRNA er i stand til at reducere produktionen af ​​hundreder af proteiner ved hjælp af ufuldstændig parring upon miRNA-mRNA binding. Sidst, bevismateriale, der implicerer miRNA i udviklingen af ​​lungekræft er nye. Især MIR-19a, som er overudtrykt i ondartede lungecancerceller, betragtes som den væsentligste miRNA for tumorigenese. Men dens direkte mål forbliver underrapporteret. I nærværende undersøgelse har vi fokuseret på seks mulige miR-19a målgener udvalgt af miRNA target forudsigelse software. For at evaluere disse gener som direkte miR-19a målgener, vi udførte luciferase, pull-down, og Western blot-analyser. Luciferaseaktiviteten af ​​plasmider med hver MIR-19a-bindingssted blev observeret at falde, mens øget luciferaseaktivitet blev observeret i nærvær af anti-MIR-19a låst nukleinsyre (LNA). Pull-down assay viste biotinyleret miR-19a til at binde til AGO2 protein og til fire af seks mulige target mRNA. Western blot analyse viste, at ekspressionsniveauerne af de fire gener ændres afhængigt af behandling med MIR-19a efterligner eller anti-MIR-19a-LNA. Endelig

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, og

TUSC2

blev identificeret som miR-19a mål. For at undersøge funktionen af ​​disse fire målgener i lungecancerceller, blev LK79 (som har høj MIR-19a-ekspression) og A549 (som har lav MIR-19a ekspression) anvendes. Ekspressionen af ​​de fire målproteiner var højere i A549 end i LK79 celler. De fire miR-19a target cDNA ekspressionsvektorer undertrykt cellelevedygtighed, kolonidannelse, migration og invasion af A549 og LK79 celler, men LK79 celler transficeret med

FOXP1

TP53INP1

cDNA’erne viste ingen forskel sammenlignet med kontrol- celler i invasionen assay

Henvisning:. Yamamoto K, Ito S, Hanafusa H, Shimizu K, Ouchida M (2015) Afdækning direkte mål for MIR-19a involveret i Lung Cancer Progression. PLoS ONE 10 (9): e0137887. doi: 10,1371 /journal.pone.0137887

Redaktør: Partha Mukhopadhyay, National Institutes of Health, UNITED STATES

Modtaget: 18 juni 2015; Accepteret: August 24, 2015; Udgivet: 14 September, 2015

Copyright: © 2015 Yamamoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en Grant-in-Aid fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (nr 24.591.905 til MO). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Micro RNA’er (miRNA) er ~ 22-bp ikke-kodende små RNA’er, der posttranscriptionally regulerer genekspression i en sekvens-specifik måde [1]. miRNA kodes af enten deres egne gener eller indlejret i introner af “vært” gener og transskriberes med RNA-polymerase II som en del af en lang udjævnede og polyadenyleret transcript (PRI-miRNA) [2]. Pri-miRNA undergår yderligere behandling, der involverer fjernelse af en hårnål struktur sammen med flankerende sekvenser af et medlem af RNAse III familien drosha at skabe pre-miRNA [3-4]. Pre-miRNA eksporteres i cytoplasmaet af exportin-5, hvor de yderligere spaltes af Dicer der fjerner terminal løkke skabe en ufuldkommen RNA duplex [3-5]. En af strengene er fortrinsvis bundet af RNA-induceret silencing kompleks (RISC), som indeholder Argonaute (siden) familie proteiner. Selvom begge strenge kan blive stabilt forbundet med AGO familie proteiner (lastning trin) kun én streng (guide streng; miRNA) tilbageholdes af AGO protein, mens den anden streng (passager streng; miRNA *) nedbrydes. De humane AGO proteiner (AGO1 til 4) er karakteriseret ved en konserveret PIWI domæne, der er strukturelt ligner RNAse H. PIWI domæne interagerer med 5′-enden af ​​modent miRNA og er involveret i spaltning af target mRNA’er. Alle fire humane AGO proteiner viser bemærkelsesværdigt lignende strukturelle præferencer for små RNA rækkehuse: centrale misforholdet (guide position 8-11) fremme RISC lastning, og uoverensstemmelser i frøet (guide position 2-7) eller 3′-mid regioner (guide position 12-15) er nødvendige for afvikling [6]. Det er svært for små RNA rækkehuse bærer uoverensstemmelser i frøet regionen til at indlæse i AGO proteiner [6-12]. På den anden side, anerkendelse af en miRNA med target mRNA kræver komplette eller næsten komplette kampe med frø regionen. Mere end 2.500 miRNA er rapporteret i mennesker (GRCh38, https://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl?org=has), og 30% af menneskelige gener anses for at være reguleret af miRNA [13] .

Lungekræft er ansvarlig for 19,4% af alle kræftrelaterede dødsfald, som udgjorde ca. 1.590.000 dødsfald på verdensplan i 2012 (https://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/) . Lungekræft progression er tilknyttet flere genetiske og epigenetiske ændringer, der påvirker genekspression af en lang række forskellige gener. Især har ændringer i ekspressionen af ​​mere end to dusin miRNA blevet rapporteret hos patienter med lungecancer [14], herunder nylig rapporteret overekspression af miR-17-92 klynge (oncomiR-1), der koder blandt andre miR-19a og 19b [14]. OncomiR-1 er involveret i reguleringen af ​​celleoverlevelse, proliferation, differentiering, og angiogenese [15, 16]. Nogle gener, såsom

STAT3

MAPK14

, som er involveret i tumorigenese, er blevet rapporteret som target gener af miR-17-92 i lungekræft celler [17]. MIR-19a, som er overudtrykt i ondartede lungecancerceller, anses nøglen miRNA i tumorigenese [18]. Cell vækstrate og levedygtighed variere mellem lymfomer transficeret med vild eller muteret miR-19a; derfor kan MIR-19a også være forbundet med cellevækst [18]. Desuden MIR-19a aktiverer Akt-mTOR pathway ved at undertrykke tumor suppressor

PTEN

[18, 19]. Desuden

SOCS-1

[20],

THBS1

[21],

IMPDH1

,

NPEPL1

[22], og

TNF -α

er også kendt som mål for miR-19a [23].

Men som miRNA-mRNA binding afhænger frø sekvenser og ufuldkomne parring af deres tråde, miR-19a skal have endnu-uidentificeret målgener der påvirker indtræden og progression af lungekræft. I den foreliggende undersøgelse identificerede vi hidtil ukendte målgener af MIR-19a og viste den undertrykkende evne målgenerne på væksten, migration og invasion af lungecancerceller.

Materialer og metoder

Valg af miR-19a target kandidatgener

Potentielle målgener af miR-19a blev forudsagt ved hjælp af følgende miRNA target forudsigelse software: PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu), Targetscan ( https://targetscan.org), Miranda (https://cbio.mskcc.org), og miGTS (Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd. Tokyo, Japan). Forudsigelsen gav 3.398 gener. For at indsnævre området for mulige miR-19a mål blev gener involveret i kræft udvindes ved søgning raffinement ved at inkludere mere end to ord relateret til kræft (tumor, suppressor, og apoptose) i den indledende litteratursøgning. Selv om mere end 10 gener forblev som MIR-19a target kandidater, seks gener (undtagen generne allerede rapporteret som MIR-19a mål), nemlig forkhead box P1 (

FOXP1 Salg), p53-afhængig beskadigelse-inducerbar nukleare protein 1 (

TP53INP1

), TNF-α-induceret protein 3 (

TNFAIP3

), tumor suppressor kandidat 2 (

TUSC2

), SIVA apoptose-inducerende faktor 1 (

SIVA1

), og tumornekrosefaktorreceptor superfamilien 12A (

TNFRSF12A

), blev udvalgt til denne undersøgelse.

Cell kultur

Humant normalt lunge fibroblast cellelinie WI-38 og humant normalt embryonisk nyrecellelinie HEK293 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). Menneskelig lunge småcellet karcinom cellelinjer SBC-5 og LK-79 og human ikke-småcellet lungecancer cellelinier PC3, PC14, LK2, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H520, SQ5, Lu65A, smører 99c, har RERF-LCMS, og A549 blevet anvendt i vores laboratorium [24]. HEK293, SBC-5, Lu-65A, PC3, PC14, LK2, NCI-H23, NCI-H460, NCI-H520, SQ5, Lu-99c, og RERF-LCMS blev dyrket i DMEM (Life Technologies, Foster City, Californien , USA) eller RPMI-1640 (Wako, Osaka, Japan). LK-79 og A549 blev dyrket i blandet DMEM og RPMI-1640 (1: 1) suppleret med 10% FBS (Life Technologies), 100 enheder /ml penicillin G og 100 mg /ml streptomycin (Meiji Seika, Tokyo, Japan). Alle celler blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

Eksogen miRNA transfektionsforsøg blev udført med MIR-19a mimic (1, 5, og 10 nM) (CosmoBio, Tokyo, Japan) under anvendelse HiPerFect transfektionsreagens (Qiagen, Venlo, Holland). Sekvenserne var som følger: MIR-19a mimic, fornemmer 5′-p-AUC CGC GCG AUA GUA CGU AUU-3’og antisense 5′-p-UAC GUA CUA UCG CGC GGA UUU-3′; tilfældig miRNA (kontrol miRNA), fornemmer 5′-p-UGU GCA AAU CUA UGC AAA ACU GA-3’og antisense 5′-p- UUA GUU UUG CAU AGU UGC AC-3′. Udtrykket af miR-19a blev slået ned ved transfektion med anti-miR-19a låst nukleinsyre (LNA) (30 nM; 5′-TCA GTT TTG CAT AGA TTT GCA CA-3′) eller en kontrol-LNA oligonukleotid målrettet GFP (5′ -ATC ACT CTC GGC ATG GAC GAG C-3′) (Gene design Inc., Osaka, Japan) under anvendelse HiPerFect transfektionsreagens (Qiagen). MIR-19a target cDNA-ekspressionsplasmider blev transficeret i cellerne under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies). De transficerede celler blev udsat for cellelevedygtighedsassays og RNA-ekstraktion 24 timer efter transfektion og protein ekstraktion 72 timer efter transfektion. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af et vandopløseligt tetrazoliumsalt assay, nemlig 2- [2-methoxy-4-nitrophenyl] -3- [4-nitrophenyl] -5- [2,4-disulfophenyl] -2H-tetrazolium mononatrium salt assay (WST-1, Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland).

Colony dannelse assay

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, og

TUSC2

cDNA-ekspressionsplasmider blev transficeret ind A549 og LK79 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 og udvalgt af G418 (100-400 pg /ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ) i 6-brønds plader. Efter 3 uger blev kolonierne, der består af mere end 200 celler farvet med krystalviolet. Antallet af kolonier blev derefter talt, og gennemsnitlige værdier blev beregnet i tredobbelte brønde.

Cellevækst

A549 eller LK79 celler transficeret med

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, eller

TUSC2

cDNA udtryk plasmidvektor blev udvalgt af G418 for at opnå celler med stabil ekspression. Efter 3 uger blev størstedelen population af G418-resistente celler opsamles og anvendes til cellevækst assay migration assay, og invasion assay. For cellevækst assayet blev celler med stabil ekspression dyrket ved 500 celler /brønd i en 96-brønds plade. Efter 24, 48 og 72 timer blev cellerne talt under anvendelse Hoechst 33342-farvning og mikroskopi. Gennemsnitlige værdier af cellerne med klart farvede kerner blev beregnet i tredobbelte brønde.

Migration assay

Celler blev dyrket til 95% konfluens i en 60 mm plade og ridset med en pipettespids. De flydende celler blev fjernet ved vask med phosphatbufret saltvand (PBS), og mikroskopiske billeder af sårene blev opnået ved 24 timer.

Invasion assay

A Corning Matrigel Invasion Chamber (24- brønds plade 8,0 mikron, Corning, NY, USA) blev anvendt for invasionen assay. A549 (1 × 10

5) eller LK79 (2,5 x 10

4) celler blev dyrket med serum-frit DMEM i det øvre kammer adskilt fra de nedre kamre, der blev leveret med DMEM med 10% FBS ved gennemtrængelig gennemskinnelige PET membraner. Efter 24 timer blev cellerne fikseret og farvet med Cyto Quick A og B Solution (Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan). Ikke-invasive celler på den øvre side af membranen blev forsigtigt fjernet ved aftørring, og celler på den nedre side blev farves og observeres af et mikroskop. Antallet af invasive celler blev talt, og gennemsnitlige værdier blev beregnet i syv felter pr kammer.

Pull-down assay af target mRNA af MIR-19a

Semi-sammenflydende HEK293 celler på 90- mm dyrkningsskåle blev vasket med kold PBS, høstet ved en skraber, og behandlet med 0,5 ml 25 mM Tris-HCI (pH 7,5), 70 mM KCI, 2,5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 80 U /ml RNase Inhibitor (Life Technologies) og 1 × proteaseinhibitorcocktail (Sigma-Aldrich) på is i 20 minutter og centrifugeret ved 12.000

× g

i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev overført til et nyt rør. Biotinyleret dobbeltstrenget RNA (8 nmol) af MIR-19a (sense 5′-p-UGU GCA AAU CUA UGC AAA ACU GA-biotin-3’og antisense 5′-p-AGU UUU GCA UAG auu UGC AUA AG-3′) eller kontrol random RNA (sense 5′-p-AUC CGC GCG AUA GUA CGU AUU-biotin-3’og antisense 5′-p-UAC GUA CUA UCG CGC GGA uUU-3′) blev tilsat til supernatanten (500 pi) og inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter med 8-rpm rystning og derefter ved 30 ° C i 1 time med 30-rpm rystning. Ekstrakten blev inkuberet ved 4 ° C i 1 time med 10 pi Streptavidin mutein Matrix (Roche Applied Science), som blev forbehandlet med ekstraktionspuffer [250 ug RNase-fri BSA og 100 ug gær-tRNA i 500 pi 25 mM Tris-HCI (pH 7,5), 70 mM KCI, 2,5 mM EDTA og 0,05% NP-40] i 3 timer og vasket med den samme puffer to gange. Streptavidin /biotin-miRNA /mRNA-kompleks blev opsamlet efter en centrifugering ved 5.000

× g

i 30 s og vasket 5 gange ved 4 ° C i 5 minutter med 8-rpm rystning ved anvendelse af 20 mM Tris-HCI ( pH 7,4), 400 mM KCI og 0,5% NP-40. Biotin-miRNA /mRNA-kompleks blev elueret med 250 pi 20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 400 mM KCI, 0,5% NP-40, 5 mM biotin, og 80 U /ml RNase-inhibitor ved 42 ° C i 5 min.

PTEN

gen, rapporteres at være en miR-19a mål, blev anvendt som den positive kontrol, og

DAPK1

, hvis sekvens matchede ikke med miR-19a frø sekvenser i 3’uoversatte region (UTR) i sit mRNA, blev anvendt som den negative kontrol.

plasmider

cDNA’erne af

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, og

TUSC2

blev amplificeret under anvendelse af PCR med genspecifikke primere og normalt humant cDNA revers-transkriberet fra HEK293 mRNA under anvendelse ReverTra Ace-α-kit (Toyobo, Osaka, Japan). CDNA’erne blev klonet i pBluescript og bekræftet ved DNA-sekventering under anvendelse af ABI 3100 sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). FLAG tag sekvenser blev fusioneret ved 5′-enden af ​​cDNA i ramme, og de blev indsat i pIRES2-EGFP vektor (Clontech, Mountain View, CA, USA) med

Nhe

I og

Sal

I restriktionssteder. Disse sekvenser blev bekræftet ved DNA-sekventering.

Luciferase reporter assay

De 3′-UTR fragmenter indeholdende en mulig miR-19a-bindende region i kandidatgener blev syntetiseret som oligonukleotider til begge strenge, som kan producere

Xba

jeg sammenhængende slutter efter udglødning. De annealede dobbelte strenge blev klonet i 3′-UTR

Xba

I-stedet af

Renilla

luciferase i PTK-HRG-vektor, som var en phRG-B-vektor (Promega, Madison, WI, USA), der bærer luciferase cDNA nedstrøms for herpes thymidinkinasepromotoren at vi havde indsat. De indsatte fragmenter blev sekventeret, og deres orientering og fragment antal blev bestemt. For luciferaseanalyse, PTK-HRG-konstruktioner (180 ng) blev co-transficeret med ildflueluciferase reporterplasmidet POA-SRa-luciferase (20 ng) som en intern kontrol i HEK293-celler. PTK-HRG konstruktion uden insert blev anvendt som kontrol. Luciferaseaktiviteten blev målt 48 timer efter transfektion under anvendelse af en dobbelt luciferase reporter assaysystem (Promega) på en Labosystems Luminoskan RT instrument (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA). Den relative luciferase aktivitet blev beregnet ved normalisering

Renilla

luminescens til ildflue luminescens. For hvert eksperimentelt forsøg blev hver prøve analyseret in duplo.

s

-værdi blev beregnet ved hjælp af den tosidede

t

-test. For det andet luciferaseanalyse, PTK-HRG konstruktionerne blev cotransficeret med anti-miR-19a LNA eller kontrol LNA (100 nM) under samme betingelser. PTK-HRG konstruktion bærer en mismatch med den centrale region i MIR-19a frø sekvenser blev anvendt som en negativ kontrol.

Kvantitativ revers-transkription PCR

trukket ned biotin-miRNA /mRNA-kompleks blev behandlet med guanidium-phenol chloroformekstraktion procedure med ISOGEN-LS (Nippon Gene, Tokyo, Japan), efterfulgt af DNase i (Sigma-Aldrich) og ISOGEN-LS behandling. MRNA blev revers-transkriberet i et samlet volumen på 20 pi ved anvendelse af ReverTra Ace-α kit. CDNA’et af biotin-miRNA /mRNA-kompleks blev amplificeret ved PCR i et volumen på 20 pi indeholdende 0,2 pi af hver revers transkriptionsreaktion og 10 pi af TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix (Life Technologies) i en 7300 Fast Real- Time PCR System (40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 58 ° C i 5 minutter). Primere til påvisning af kandidat MIR-19a target cDNA’er blev konstrueret flankerende en mulig MIR-19a-bindende region i mål-mRNA (S1 tabel). TaqMan probesekvenser med 5′-FAM og 3′-TAMRA mærkning for real-time PCR er vist i S2 tabel. Udtrykket niveau, dvs., tærskel cyklus (CT) værdi af hvert mål mRNA i pull-down prøve med miR-19a-biotin blev sammenlignet med CT-værdi, der i pull-down prøve med miR-random-biotin og vist som det relative forhold. Hver PCR blev udført fire gange, og

s

-værdi blev beregnet ved hjælp af den tosidede

t

-test.

For miR-19a udtryk analyse, totalt cellulært RNA blev ekstraheret under anvendelse af ISOGEN (Nippon Gene). Den kvantitative real-time PCR-analyse af MIR-19a blev udført med en TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit, TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix og TaqMan MicroRNA assay (Life Technologies). Totalt RNA (10 ng) blev revers-transcriberet i et samlet volumen på 15 pi ved anvendelse af en TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit. Portioner af hver revers transkriptionsreaktion blev amplificeret ved PCR i en 20-pi totalvolumen indeholdende 10 pi af TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix. PCR blev udført på en 7300 Fast Real-time PCR System med 50 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s. Ekspressionsniveauet (CT-værdi) af MIR-19a blev normaliseret til CT værdien af ​​en lille nukleare RNA, U6B, som blev co-amplificeret som en endogen kontrol. Den ACt blev beregnet som forskellen i CT-værdier mellem MIR-19a og det indre U6B kontrol i én prøve. Sammenligningerne af miRNA ekspressionsniveauer blev udført under anvendelse af ΔΔCT metode, hvor ΔΔCT var forskellen i ACt værdier af en testprøve sammenlignet med den for kontrolprøven, og 2

-ΔΔCT repræsenterer gange ændring i miRNA ekspression.

til kvantitativ real-time PCR-analyse af miR-19a målgener,

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, og

TUSC2

cellulært mRNA blev revers transkriberet med ReverTra Ace First Strand cDNA Synthesis Kit (Toyobo), og cDNA’et blev amplificeret ved PCR i en 20-pi totalvolumen indeholdende 0,2 pi af hver revers transkriptionsreaktion og 10 pi af TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix (Life Technologies) i en 7300 Fast Real-Time PCR System med 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 58 ° C i 5 min. Primerne og proberne anvendes til påvisning af disse cDNA’er var de samme som til påvisning af cDNA’er af biotin-miRNA /mRNA-kompleks beskrevet ovenfor. CT blev beregnet som forskellen i CT-værdier mellem hver MIR-19a målgen og β-actin-genet i en prøve. Ekspressionsniveauerne af target mRNA blev også målt ved hjælp af ΔΔCT metoden.

Western blotting analyse

Til bekræftelse af AGO2 proteinbinding med biotin-miRNA /mRNA på

in vitro

pull-down, blev komplekset kombineret med gelloadningspuffer, opvarmet til 95 ° C i 10 min, og derefter separeret på 12% SDS-polyacrylamidgeler og elektrooverført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Life Technologies). Membraner blev blokeret natten over ved 4 ° C i 3% BSA /PBS og derefter inkuberet i 4 timer ved stuetemperatur med anti-AGO2 monoklonalt antistof (No.016-20861, Wako, Osaka, Japan). Filtrene blev vasket med PBS /0,05% Tween-20 og derefter inkuberet med alkalisk phosphatase-konjugerede antistoffer. Proteinet signal blev visualiseret under anvendelse af FLA-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan).

I effekten af ​​MIR-19a på proteinekspression ved 72 timer efter transfektion af HEK293 og A549 med MIR-19a efterligner eller anti-mIR-19a-LNA, proteinprøverne (25 ug) blev adskilt på 8% eller 12% SDS-polyacrylamidgeler, elektrooverført til PVDF-membraner, og inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende antistoffer: anti-TP53INP1 (T -17; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), anti-FOXP1 (ab16645, Abcam, Cambridge, UK), anti-TNFAIP3 (ab74037, Abcam), anti-TUSC2 (ab70182, Abcam), anti-SIVA1 (ab67620 , Abcam), og anti-TNFRSF12A (ITEM-4, Santa Cruz Biotechnology). Anti-β-actin (AC-15; Sigma-Aldrich). Blev anvendt som en loading kontrol

Statistisk analyse

De relative ratioer i luciferase, RNA-ekspression, cellelevedygtighed, cellevækst, kolonidannelse, og invasion forsøg er udtrykt som middelværdier ± SD og blev analyseret ved den tosidede

t

-test. En værdi på

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Evaluering af miR-19a target kandidatgener ved luciferase reporter analysen

Vi fokuserede på seks miR-19a target gen kandidater,

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

,

TUSC2

,

SIVA1

, og

TNFRSF12A

, som havde blevet udvalgt under anvendelse miRNA target forudsigelse software. Nukleotidsekvenserne af den mulige miRNA-bindende site på 3′-UTR af deres mRNA’er blev opnået fra miRNA target forudsigelse software (Fig 1A). For at kontrollere, om miRNA-bindende sites er reguleret af miR-19a

in vivo

, vi konstrueret luciferase reporter plasmider med hver miR-19a bindingssted i 3′-UTR af

Renilla

luciferase gen (fig 1B). Luciferase reporter plasmider med sekvenserne egnede til at behandle den MIR-19a frø region omfattede den negative kontrol. Vi transficeret

Renilla

luciferase reporter plasmider, der bærer mulige miR-19a-bindingssteder af miR-19a mål kandidater og intern kontrol ildflueluciferase plasmider ind HEK293 celler, hvor miR-19a udtryk blev bekræftet. Plasmiderne blev derefter undersøgt for luciferaseaktivitet ved dual-luciferase system. Den luciferaseaktiviteten af ​​alle plasmider med miRNA-bindingssteder var signifikant lavere end for den tomme vektor kontrol (Fig 1C), hvilket tyder på, at miR-19a-bindende sekvenser i hver miR-19a target kandidat mRNA anerkendes korrekt af endogene miR- 19a i HEK293-celler. Endvidere undersøgte vi luciferaseaktiviteten af ​​de plasmider, som bærer de miRNA-bindingssites under MIR-19a knockdown ved co-transfektion med anti-MIR-19a LNA. Luciferaseaktiviteten af ​​alle plasmider med de miRNA-bindingssteder steg betydeligt i cellerne behandlet med anti-MIR-19a LNA sammenlignet med den for de celler behandlet med kontrol LNA (Fig 1D). Disse resultater tyder på muligheden af, at disse gener er MIR-19a målgener. Vi derefter udført andre forsøg for at vurdere muligheden for disse er miR-19a målgener.

(A) Oversigt over miR-19a target kandidat mRNA. MIR-19a-bindingssteder identificeret ved anvendelse PicTar, Targetscan eller Miranda software er vist i 3′-utranslaterede (UTR) region af MIR-19a target kandidat mRNA’er. (B) Konstruktion af luciferase vektorer. MIR-19a-bindingssteder af kandidatgener og negative kontrolsekvenser (negativ Ctrl) blev klonet nedstrøms for luciferase ORF på

Xba

restriktionssite af PTK-HRG vektor. Sense (

øvre

) og antisense (

lavere

) strenge af komplementære sekvenser angiver miRNA målområdet af mRNA 3′-UTR og miR-19a-sekvenser, henholdsvis. Understreger indikerer miR-19a frø sekvenser. Den negative kontrol plasmid har uoverensstemmelser i centrum af miR-19a frø sekvenser. (C) Luciferaseaktiviteten af ​​konstruktioner med MIR-19a-bindingssteder blev sammenlignet med den for den tomme vektor, som havde ingen insert på

Xba

site (nr-Insert Ctrl), og blev analyseret statistisk . (D) Luciferase plasmider med miR-19a-bindingssted og negativ kontrol plasmid blev transficeret med anti-miR-19a-LNA eller kontrol-LNA (Ctrl). Luciferaseaktiviteten af ​​celler behandlet med anti-MIR-19a-LNA blev sammenlignet med den for celler behandlet med kontrol-LNA. *,

s

0,05 og **,

s

0,005 hjælp tosidede

t

-tests.

Evaluering af kandidatgener af en

in vitro

pull-down assay under anvendelse biotinyleret miR-19a

miRNA målgener blev for nylig udvundet ved en to-trins fremgangsmåde, hvor mRNA’et /miRNA /FLAG-AGO2 kompleks blev først trukket ned med et anti-FLAG-antistof, og derefter blev mRNA /biotinyleret miRNA kompleks oprenset ved streptavidinkugler i ekstraktet af cellerne transficeret med biotinyleret miRNA og FLAG-AGO2 cDNA ekspressionsvektor [25]. At vurdere vores kandidatgener som miR-19a mål, vedtog vi derfor forbedret

in vitro

pull-down assay (Fig 2A). I første omgang celleekstrakten var mildt forberedt fra HEK293-celler, hvor tilstrækkelig ekspression af hver kandidat mRNA blev påvist (figur 2B). Det biotinylerede dobbeltstrengede MIR-19a eller kontrol tilfældig RNA blev inkuberet i celleekstrakt til frembringelse af et kompleks af den biotinylerede miRNA enkelt streng med RISC og mRNA. Det biotinylerede miRNA /mRNA /RISC-komplekset blev inkuberet med streptavidin-perler i ekstraktet, opsamlet ved kort centrifugering, og elueret med elueringsbuffer indeholdende 5 mM biotin fra streptavidinkugler. Det biotinylerede miRNA /mRNA-kompleks blev behandlet ved phenol-chloroform-ekstraktion, DNase I, og revers transkription. Før RT-PCR-analyse af mål-kandidatgener, bekræftede vi, om det biotinylerede MIR-19a /mRNA-kompleks indeholder RISC komponent AGO2 ved western blotting. Pull-down kompleks med biotinyleret MIR-19a udviste signalet fra AGO2 proteinet (fig 2C, bane 1), medens intet signal blev bemærket for pull-down kompleks med biotinyleret tilfældig RNA (fig 2C, bane 2), hvilket antyder, at biotinyleret mIR-19a, mål-mRNA, og AGO2 kan danne et kompleks i denne pull-down assay. Derefter sammenlignede vi mængden af ​​kandidat target mRNA’er i komplekserne trukket ned med biotinyleret MIR-19a og kontrollere tilfældige RNA ved kvantitativ realtids-PCR. PCR-primere for kandidat- målgener blev designet til at opformere regionen (100 ~ 300 bp) indeholdende MIR-19a-bindingssites i deres 3′-UTR’er (S1 tabel). Blandt de seks kandidater,

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, og

TUSC2

mRNA niveauer blev væsentligt højere i komplekset trukket ned med biotinyleret miR -19a end kontrollen (fig 2D). Til bekræftelse af denne pull-down-system, vi undersøgte en positiv kontrol miR-19a target gen,

PTEN

, samt en negativ kontrol-gen, hvis sekvens ikke matche miR-19a frø sekvenser. Vi har registreret en øget grad af

PTEN

mRNA og nedsat niveau af den negative kontrol gen mRNA i pull-down kompleks ved hjælp af biotinyleret miR-19a. Derfor har vi fokuseret på at evaluere

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, og

TUSC2

gener som miR-19a targets.

(A) Oversigt over

in vitro

pull-down assay. Det biotinylerede dobbeltstrengede MIR-19a eller kontrol tilfældig RNA blev inkuberet i celleekstrakt (trin 1) til opnåelse af et kompleks af den biotinylerede miRNA enkelt streng med mål-mRNA og RISC (trin 2). Det biotinylerede miRNA /mål-mRNA-kompleks blev inkuberet med streptavidinkugler og trukket ned (trin 3). Komplekset blev behandlet ved DNase I og revers-transcriberet (trin 4). (B) Udtrykket af miR-19a target kandidat mRNA i HEK293 celler.

PTEN

, kendt som en af ​​MIR-19a målgener, blev anvendt som en positiv kontrol. Genet, hvis sekvens matchede ikke med MIR-19a frø sekvenser, blev anvendt som negativ kontrol. (C) Bekræftelse af AGO2 protein i biotinyleret miRNA /mål-mRNA-komplekset ved western blotting med AGO2 antistof. Biotinyleret MIR-19a (bane 1), biotinyleret kontrol random RNA (bane 2), og biotin (bane 3) blev anvendt til pull-down assay og underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese og Western-blotting. Totale celleekstrakt blev anvendt som positiv kontrol (bane 4). (D) Påvisning af target mRNA i biotinyleret miRNA /target mRNA kompleks med real-time RT-PCR. Det relative niveau for hvert mål-mRNA i komplekset trækkes ned ved hjælp af biotinyleret MIR-19a blev sammenlignet med den af ​​komplekset trækkes ned ved hjælp af biotinylerede kontrol tilfældige RNA. **,

s

0,005 hjælp tosidede

t

-tests.

Evaluering af fire kandidatgener ved western blotting

Gener

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, og

TUSC2

blev evalueret som miR-19a mål ved hjælp af en anden analyse for at undersøge posttranskriptionel regulering af miR-19a i cellerne. I første omgang blev MIR-19a efterligner eller kontrol tilfældig miRNA transficeret i HEK293-celler til at undersøge, om MIR-19a reducerede ekspressionen af ​​de fire MIR-19a målproteiner. Ved western blotting ved 72 timer efter transfektion, nedsat ekspression af de fire målproteiner blev observeret i MIR-19a efterligner-behandlede celler sammenlignet med den for kontrol miRNA-behandlede celler (fig 3A). For det andet blev anti-MIR-19a LNA eller kontrol LNA transficeret i HEK293-celler til at vælte endogen MIR-19a, og ekspressionen af ​​de fire kandidat-proteiner blev analyseret ved Western blotting. Forøget ekspression af de fire målproteiner blev observeret i anti-MIR-19a LNA-behandlede celler sammenlignet med den for kontrol LNA-behandlede celler (fig 3B). Tilsammen

FOXP1

,

TP53INP1

,

TNFAIP3

, og

TUSC2

blev bekræftet at være miR-19a målgener. Ingen ændring i SIVA1 eller TNFRSF12A ekspression blev observeret i anti-MIR-19a LNA-behandlede celler sammenlignet med den i kontrol LNA-behandlede celler (S1 Fig).

(A) Ekspression analyse af kandidat proteiner ved western Blot-analyse under anvendelse af proteiner af HEK293-celler transficeret med mIR-19a efterligner eller kontrol oligo RNA.-, kontrol oligo RNA; +, MiR-19a efterligner. (B) Ekspression analyse af kandidat-proteiner ved Western blot-analyse under anvendelse af proteiner af HEK293-celler transficeret med anti-MIR-19a LNA eller kontrol LNA.-, kontrol LNA; *,

s

*,

s