PLoS ONE: Faldet i Mineralcorticoid receptor Drives Angiogene veje i kolorektal Cancer

Abstrakt

Angiogenese spiller en afgørende rolle i tumorvækst og progression. Lav ekspression af mineralcorticoidreceptoren (MR) i flere maligne tumorer korrelerer med recidiv og samlet overlevelse. Tidligere undersøgelser har vist, at MR-ekspression er nedsat hos colorectal cancer (CRC). Her hypotese vi, at faldet MR-ekspression kan bidrage til angiogenese og dårlig patientoverlevelse i kolorektale maligniteter. I en kohorte af CRC patienter, vi analyserede tumor MR udtryk, dets overensstemmelse med tumor mikrovaskulær tæthed og dens indvirkning på overlevelse. Efterfølgende forhørt vi rollen som MR i angiogenese i en in vitro-model, baseret på coloncancer HCT116, ingenierized at re-udtrykke et fysiologisk kontrolleret MR. I CRC, faldt MR ekspression blev forbundet med øget mikrovaskulær densitet og dårlig patientoverlevelse. I pchMR transficeret HCT116, aldosteron eller naturlige serum steroider i høj grad inhiberede mRNA ekspressionsniveauer af både VEGFA og dens receptor 2 /KDR. I CRC, kan MR aktivering signifikant fald angiogenese ved direkte at hæmme fejlreguleret VEGFA og hypoxi-induceret VEGFA mRNA-ekspression. Desuden MR aktivering dæmper ekspressionen af ​​VEGF receptor 2 /KDR, eventuelt dæmpe aktiveringen af ​​en VEGFA /KDR afhængig signaleringsvej vigtig for overlevelsen af ​​tumorceller under hypoxiske betingelser

Henvisning:. Tiberio L, Nascimbeni R, Villanacci V, Casella C, FRA A, Vezzoli V, et al. (2013) Faldet i Mineralcorticoid receptor Drives Angiogene veje i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (3): e59410. doi: 10,1371 /journal.pone.0059410

Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italien

Modtaget: November 22, 2012; Accepteret: 13 februar 2013; Udgivet: 28 Mar 2013

Copyright: © 2013 Tiberio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende undersøgelsen blev støttet af Adele og Francesco Lonati Foundation, Brescia, Italien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mineralcorticoidreceptoren (MR) er en nuklear receptor, der er blevet klassisk forbundet med kontrol af ion-transport i epitelceller, især i nyrerne og tyktarm. [1], [2] Denne specifikke aktivitet spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​elektrolytbalancen og blodtrykket. Imidlertid er det nu kendt, at MR også udtrykkes i hjertemyocytter, endotelceller og neuroner, hvilket antyder, at det spiller en fysiologisk rolle i en lang række ikke-epitelceller. [3], [4] I klassisk mineralocorticoid målvæv, MR bor oftest i cytoplasmaet i en inaktiv tilstand; ved binding af fysiologiske ligander, såsom aldosteron, MR undergår konformationelle ændringer, dissocierer fra molekylære chaperoner og translokerer ind i kernen, hvor det regulerer ekspressionen af ​​målgener gennem specifikke DNA responselementer. [5] Der er også beviser for eksistensen af ​​ikke-genomiske mekanismer, hvorved aktiverede MR interagerer med signalvej elementer uden for cellekernen til at regulere genekspression. [6] I alle tilfælde kan tilstedeværelsen af ​​forskellige MR isoformer, eksistensen af ​​forskellige ligand-induceret post-translationelle modifikationer af receptoren og rekrutteringen af ​​forskellige receptor-associerede corepressorer eller coaktivatorer udgør celletype-specifikke effekter af MR inden forskellige mineralocorticoid målvæv. [7], [8].

Mange data i litteraturen antyder, at aldosteron, gennem MR-afhængige mekanismer, kan også mediere negative virkninger for patogenese og progression af iskæmiske sygdomme, hvor angiogenese spiller vigtig rolle i redning af hypoperfuserede væv. [9], [10], [11] Indeed, behandling med MR-antagonister fremmer en hurtigere og bedre revaskularisering reducere omfanget af vævsbeskadigelse i iskæmi i lemmerne, hvilket antyder, at aldosteron via MR-aktivering, udøver en negativ rolle på angiogenese. Denne fortolkning understøttes yderligere af den konstatering, at i denne eksperimentelle indstilling, MR hæmning også korrelerer med øget ekspression af pro-angiogene faktorer. [12] Desuden aldosteron svækker vaskulær regenerering af knoglemarv afledte endotel stamceller, en proces, der adskiller sig fra angiogenese, der er relevante for at stille sikkerhed kilde af blodgennemstrømningen i reaktion på kritisk indsnævring af en større arterie [13].

afgrænsningen af ​​molekylære mekanismer for adaptive angiogenese i iskæmiske væv har afsløret en kritisk rolle hypoxi-inducerbare faktor-1 (HIF-1) i den transkriptionelle regulering af gener kodende for angiogene vækstfaktorer, som medierer genvækst af det vaskulære netværk. [14] I hypoxiske celler, aktivering af den heterodimere transskriptionsfaktor HIF-1 er primært induceret af mangel på de posttranslationelle modifikationer af alfa-subunit (HIF-1α) med oxygen-afhængig hydroxylase, der fører til dets hurtige nedbrydning under normoxiske betingelser . Som følge heraf under lave iltkoncentrationer, er HIF-1α stabiliseret, heterodimeriserer med βsubunit HIF-1β) og binder til hypoxi-respons elementer (HRE) i målgener [14].

Da en vigtig funktion af faste tumorer er hypoxi, det er godt accepteret, at tumor fremkalder en angiogen respons hovedsagelig som følge af en HIF-1α-drevet stigning i angiogen faktor ekspression, selv om dysregulering, grundet iboende genetiske mutationer, skal også tages i betragtning. [15] Blandt forskellige angiogene vækstfaktorer, der udskilles af både tumor og stromale celler og direkte reguleret af HIF-1α, VEGFA spiller en central rolle i at fremme neovascolarization i kræft. [16] Mere specifikt VEGFA har været involveret i kolorektal cancer (CRC) progression, bliver opreguleret i patienter med lokaliseret samt metastaserende CRC. [17], [18] VEGFA og andre medlemmer af VEGF familien binder til tre relaterede membran receptorer (VEGFRs), nemlig VEGFR1 /Ftt1, VEGFR2 /KDR og VEGFR3 /FLT4, med VEGF receptor 2 /KDR spiller en central rolle i at mediere celle overlevelse, mitogenese og differentiering af endotelceller. VEGF receptor 2 /KDR udtrykkes også på humane cancerceller, hvilket tyder på det kan udøve specifikke roller. [19], [20] Faktisk Calvani og samarbejdspartnere fremlagt beviser, at en VEGF /KDR /HIF-1α autokrine loop medierer overlevelse under hypoxiske dyrkningsbetingelser for HCT116, en coloncancercellelinie [21].

A tidligere undersøgelse rapporterede, at et fald på MR udtryk er en tidlig begivenhed i CRC progression og foreslog, at MR potentielt fungerer som en tumor-suppressor. [22] Dette begreb er i overensstemmelse med de seneste rapporter, som viste, at der i lungetumorer, MR ekspressionsniveauerne kan sammenlignes med dem, der findes i normalt lungevæv positivt korrelere med patienter samlet overlevelse tid. [23] Desuden undersøgelsen i CRC viste, at MR underekspression er forbundet med VEGF receptor 2 /KDR overekspression og foreslog, at underekspression af MR kan spille en rolle i pro-angiogene kontakt af tumoren. [22] Men til dato har der ikke været nogen mekanistisk forklaring på denne sammenhæng.

I den foreliggende undersøgelse, vi først undersøgt MR udtryk, angiogenese og patient overlevelse i en kohorte af patienter med CRC og viste, at faldet MR udtryk er korreleret til øget mikrokar densitet (MVD) og nedsat overlevelse af patienten. Vi anvendte derefter et in vitro system baseret på coloncancer HCT116, genetisk manipuleret til at udtrykke høje niveauer af funktionelt aktivt MR, for at teste den hypotese, at MR-aktivering med agonister negativt kan regulere tumor angiogenese. Vi viste, at aldosteron behandling af MR-transficerede HCT116 celler reducerer ekspressionen af ​​VEGFA mRNA i både normoxiske og hypoxiske dyrkningsbetingelser. Desuden viste vi, at der i de samme celler, aldosteron dæmper ekspression af VEGF receptor 2 /KDR mRNA.

Materialer og metoder

Etik Statement

Tredive konsekutive patienter, der gennemgår operation for primær sporadisk kolorektal cancer blev inkluderet i immunhistokemi og overlevelse analyser. Alle patienter blev informeret og gav deres skriftlige samtykke til undersøgelsen, og den anonyme brug af deres data, før de tilmeldt. Den menneskelige undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Spedali Ċivili Brescia og forsøgsprotokollen var i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen af ​​gode kliniske retningslinjer.

MR og CD34 Immunhistokemi (IHC) og Survival Analysis

Primære endepunkter var tumor udtryk for MR og CD34, både vurderet ved immunhistokemi. CD34 endotel markør blev anvendt for at vurdere tumor mikrokar densitet (MVD). [24] Følgende variabler blev evalueret med henblik på at vurdere sammenhængen med de nævnte endpoints: alder og køn af patienter, colon site, scene, grad af differentiering, mucinous undertype, og lymphovascular invasion af tumor, hensigter og indstilling af primær behandling, samlede 5-års overlevelse. Prøver af tumor og normal colorektal mucosa blev opnået fra formaldehyd-fikseret kirurgiske prøver. Paraffinsnit blev farvet med hematoxylin-eosin, PAS og PAS Diastase. For den immunhistokemiske evaluering følgende antistoffer blev anvendt: MR (Ab2774, fortynding 1:250 ABCAM, Cambridge, UK), efter at pH 6 citratbuffer behandling i 40 minutter og CD34 (CD34Ab1, fortynding 1:30 Thermo Scientific, Astmoor Runcon, UK) efter 3 citratbuffer pH 6 cyklusser. Antallet af positive celler blev talt for hver patient i 10 højeffekt felter (HPF, x40) af en patolog (VV), og resultaterne blev kategoriseret i tre niveauer af ekspression i forhold til andelen af ​​positive celler; MR udtryk: lav eller MR 1+: 33%, mellemliggende eller MR 2+: mellem 33% og 67%, høj eller MR 3+: 67%, CD 34 udtryk: low CD34 1 + 33% , mellemliggende eller CD34 2+: mellem 33% og 67%, høj eller CD34 3 +:. 67%

Celler

Den menneskelige tyktarmskræft HCT116 var en slags gave Dr. G Melillo (National Cancer Institute, Frederick, MD, USA) [21]. Vildtype HCT116-celler blev holdt i RPMI med forskellige koncentrationer af FCS, mens transficerede HCT116 celler blev dyrket i McCoys medium med forskellige koncentrationer af kul-strippet FCS eller FCS som beskrevet nedenfor.

Plasmider

PchMR, som udtrykker HMR [25] og pFC31-luc som udtrykker ildflueluciferase under kontrol af tandem glucocorticoid responselement-holdige musebrysttumorvirus-promotoren [26] var en venlig gave fra Dr. ME Rafestin-Oblin (INSERM U, Paris , Frankrig); pRL-TK, som udtrykker

Renilla

luciferase under kontrol af herpes simplex virus-thymidinkinase-promotoren blev indkøbt fra Promega; pcDNA3 blev købt hos Invitrogen.

transient transfektion

HCT116 blev transficeret under anvendelse af FuGENE HD transfektionsreagens (Roche) ifølge producentens anvisninger. Transfektionseffektiviteten for pchMR blev vurderet ved 24 timer efter transfektion ved immunohistokemi og fundet at være 53,5 ± 8%. For en omfattende beskrivelse af denne analyse, se tekst S1.

Etablering af Hypoxi

normoksi blev opretholdt ved voksende celler ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2 i luft. Hypoxi blev etableret ved at opretholde dyrkningskolber ved 37 ° C under en konstant strøm af en hypoksisk gasblanding sammensat af 95% N

2 og 5% CO

2 i 90 minutter som beskrevet. [27] Så kolber blev forseglet og inkuberet ved 37 ° C i den ønskede tid for hypoxi.

Kultur og behandling Betingelser pchMR-MR transficerede HCT116 celler dyrket under normoxi og hypoxi

Fem timer efter transfektion med pchMR blev HCT116 celler inkuberet i Mc Coy medium indeholdende 10% hormonfrit trækulstrippet føtalt bovint serum (Invitrogen) i luft i 12 timer (normoxi eksperimenter) eller 24 timer (hypoxi eksperimenter eller CoCl

2 behandling ). Celler blev derefter behandlet med 3 nM aldosteron (Sigma-Aldrich) og /eller spironolacton (1 uM, givet 1 time før aldosteron) (Sigma-Aldrich) og yderligere inkuberet i 36 timer i luft (normoxi), eller eksponeret i 20 timer enten at sænke ilt (hypoxi), eller til 100 uM CoC

2 behandling (CoCl

2). Alternativt kan fem timer efter transfektion med pchMR eller pcDNA3 blev celler inkuberet i 10% FCS-suppleret medium i 48 timer i luft (normoxi) eller inkuberet i 24 timer i luft, efterfulgt af udsættelse for lav oxygen i 20 timer (hypoxi).

Kvantitativ RT-PCR

RNA blev ekstraheret og retrotranskriberet som beskrevet. [28] transkriptniveauer blev analyseret med real-time PCR i et iCycler apparat (Bio-Rad, Milano, I) med iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) under betingelser anbefalet af leverandøren. PCR primere, se tabel S1, blev opnået fra Eurofins MWG Operon. Messenger RNA ekspressionsniveauer blev normaliseret til p-actin af Q-genet softwareapplikation. [29] Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer og PCR-produkter blev også adskilt på 2,5% agarose gel til kontrol.

Western blot analyse

For en omfattende beskrivelse henvises tekst S1. Følgende antistoffer blev anvendt til detektion: anti-human MR (fortynding 1:300, venligst doneret af Dr. Gomez-Sanchez, GV Sonny Montgomery VA Medical Center, Jackson, MS, USA) [30], anti-human HIF-1α ( torsk. 610.658, fortynding 1:800, BD Transduction Laboratories), anti-human GAPDH (sc-32233, fortynding 1:5.000, Santa Cruz).

Gene Reporter Assay

For en omfattende beskrivelse henvises tekst S1 i online supplement. PchMR- eller pcDNA3- transficerede celler blev co-transficeret med plasmid indeholdende reportergener. Til påvisning af MR-drevet luciferase-ekspression, pFC31-luc og pRL-TK tjente som reporter eller coreporter genvektor hhv. Resultaterne er givet som normaliseret relativ luciferaseaktivitet.

Immunofluorescens

For en omfattende beskrivelse henvises tekst S1 i online supplement. Fikserede celler blev inkuberet med anti-MR-antistof (fortynding 1:100) og med Alexa Fluor 448 gede-anti-muse-IgG, (Invitrogen). Cellekerner blev modfarvet med DAPI. Cellerne blev afbildet af LSM konfokal mikroskop (Zeiss).

Statistisk analyse

Sammenfattende statistikker for kontinuerte variable med ikke-normal fordeling (som vurderet af Kolmogorov-Smirnov tests) præsenteres som medianer, mens normalfordelte variabler samlet som middelværdi ± SEM. Gruppeforskelle blev analyseret med Wilcoxon-Mann-Whitney, t-test eller ANOVA efterfulgt af Bonferroni t-test efter behov. Korrelationen mellem ekspressionen af ​​MR og CD34 blev evalueret ved at anvende Cohens Kappa og Kramers Phi tests. Kaplan-Meier-metoden og logrank test blev anvendt til at undersøge effekten af ​​forskellige variable på den samlede overlevelse. Ingen multivariat analyse blev udført betragtning af den begrænsede stikprøve størrelse og lavt forhold mellem hændelser pr variabel. Den statistiske analyse er udført ved hjælp af open source statistisk pakke R. Alle statistiske tests blev tosidede og udføres på p på 0,05.

Resultater

I colorectalt carcinom patienter Expression af mineralcorticoidreceptoren er omvendt korreleret til mikrokardannelse Density og dårlig prognose

baseline kliniske karakteristika og information om de 5-års opfølgning af patienten kohorte inkluderet i undersøgelsen er sammenfattet i tabel S2.

mikrokar densitet, som bedømt ved ekspression af endotel markør CD34, og MR-ekspression blev vurderet ved IHC. Et repræsentativt mønster af CD34 og MR ekspression i en CRC prøve sammenlignet med en normal tyktarmsslimhinde er vist i fig. 1B og 1A, hhv. Resultater fra lignende analyser i tumor prøver fra vores patient kohorte, baseret på bestemmelse af andelen af ​​både CD34 og MR positive celler i de forskellige medlemmer af denne gruppe, viser, at CD34-ekspression var lav i 12 fag, mellemprodukt i 2 fag, og høj i 16 forsøgspersoner, mens MR-ekspression var lav i 17 forsøgspersoner, og høj i 13 individer (fig. 1). Der var en signifikant omvendt korrelation mellem tumor ekspression af CD34 og tumor ekspression af MR (Kramer Phi koefficient: 0,95, Cohens kappa: -0,844, p 0,001). De udtryk for både CD34 og MR var forbundet (direkte med p 0,001, og omvendt med p 0,001 henholdsvis) med tumor stadie kategoriseret i fase I og II i modsætning til fase III og IV. Blandt de øvrige klinisk-patologiske variabler, blev ingen statistisk associeret til CD34 eller MR udtryk.

Spredte fartøjer positive for CD34 i lamina propria. (X20) og (A højre panel) Diffus nukleare positivitet for MR i krypter af colon mucosa. (X40). (B) H (B), x20; (C), x40.

Efter log rank test, den samlede overlevelse viste sig at være relateret til ekspression af CD34 (p = 0,006), til ekspressionen af ​​MR (p = 0,021) ( fig. 2), til hensigten med behandling (p = 0,002). Ingen af ​​de andre klinisk-patologiske variabler viste sig at være forbundet til samlet overlevelse, men virkningen af ​​tumor etape på overlevelse var på grænsen af ​​den vifte af signifikans (p = 0,054).

VEGFA og VEGFR2 /KDR Expression hæmmes af mineralcorticoidreceptoren Aktivering i en Colon Cancer cellelinie

for at analysere den rolle, som MR spillet på angiogenese i CRC og i lyset af den vigtige rolle, som angiogene faktorer direkte produceret af spillet tumorceller i tumorigenese, vi oprettet en in vitro model ved transfektion HCT116, en coloncancercellelinie hvori endogen MR proteinniveauet var knap påviseligt (fig. 3A, øvre del), med en effektiv MR genekspressionssystem (pchMR plasmid) [25].

(A, øvre panel)

MR-ekspression.

Helcellelysater fra vildtype og pchMR-transficerede HCT116-celler blev analyseret ved western blot under anvendelse af anti-MR-antistoffer. Humane nyreceller (HEK293) tjente som positiv kontrol. Human GAPDH blev anvendt som protein loading kontrol. Repræsentative fluorogrammer fra to uafhængige forsøg giver lignende resultater er vist (A, bundpanel)

MR post-translationelle modifikationer.

PchMR-transficerede HCT116-celler blev behandlet i 24 timer med 3 nM aldosteron og /eller 1 uM spironolacton i Mc Coy medium med 10% kul-strippet FCS. Hele cellelysater blev analyseret ved Western blot under anvendelse af anti-MR-antistoffer. MR post-translationelle modifikationer induceret af aldosteron behandling er indikeret med den opadgående skift i mobiliteten af ​​MR. En repræsentativ fluorogram fra tre uafhængige forsøg med overlejres resultater er vist (B)

MR afhængig luciferaseaktivitet.

PCDNA3-transficerede (grå søjler) eller pchMR-transficerede (hvide søjler) HCT116-celler blev transficeret med pMMTV-Luc til udtrykke ildflueluciferase fra en MR afhængig promotor. Celledyrkning, aldosteron eller spironolacton behandling og normoxi eller hypoksi betingelser er beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Værdier af ildflue-luciferase aktivitet af aldosteron-stimuleret pchMR-transficerede celler i 10% strippet FCS eller 0,1% FCS, både i normoxiske eller hypoxiske betingelser, blev sammenlignet med dem af ikke-stimulerede pchMR-transficerede kontrolceller, angivet som 1. Værdier for ildflueluciferase aktivitet af pchMR-transficerede celler i 10% FCS blev sammenlignet med den for pcDNA3-transficerede kontrolceller, angivet som 1. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SEM (n = 4-6). ** P 0,005 og *** p 0,001, vs kontrolceller,

# p 0,001 vs FCS- eller aldosteron-behandlede celler, ANOVA efterfulgt af Bonferroni t-test eller Student t-test efter behov. (C)

MR subcellulære lokalisering

. PchMR-transficerede HCT116-celler behandlet med aldosteron (3 nM) og /eller spironolacton (1 uM) i 30 minutter og farvet med et anti-MR-antistof (grøn) og DAPI (blå). Billeder blev taget med en konfokal laser scanning mikroskop.

Vi viste, at mindst 50% af HCT116 celler i kultur kan rutinemæssigt transficeret (se

Materiale og metoder

) og udtrykker MR protein på væsentlige niveauer, som vist ved at sammenligne dem til HEK293 celler, taget som en positiv kontrol (fig. 3A, øverste del). [31] Desuden ved hjælp af forskellige metoder, viste vi, at MR i pchMR-transfekterede HCT116 celler er funktionelt aktiveres af agonister. Ja, efter levering af aldosteron, MR undergik specifikke post-translationelle modifikationer (fig. 3A, nederste panel), transkriptionen af ​​en MR-reporterplasmid indeholdende luciferasegenet var stærkt forøget (fig. 3B), og MR blev translokeres ind i cellen kerne med de forventede kinetik (fig. 3C). Især aldosteron givet til cellerne dyrket i medium leveres med enten 0,1% eller 10% trækul strippet føtalt kalveserum signifikant forøget niveauerne af luciferaseaktiviteten (16 folder i aldosteron-behandlede pchMR-transficerede celler vs -untreated kontroller). Det skal bemærkes, at luciferaseaktivitet også blev aktiveret ved voksende celler i 10% føtalt kalveserum, som naturligt indeholder MR-agonister og således repræsenterer en mere fysiologisk tilstand (5 folder i pchMR-transficeret versus pcDNA3-transfekterede celler) (fig. 3B). [32] Induktion af luciferaseaktivitet ved aldosteron behandling, svarer til, hvad der findes i transficerede celler under normoxi, blev også fundet i celler udsat til lavere oxygen-koncentration (fig. 3B), tillader os at teste virkningen af ​​MR-aktivering også i celler dyrket under hypoxiske betingelser. Vi viste også, at den kompetitiv antagonist spironolacton forårsagede forsvinden af ​​det meste af aldosteron induceret post-translationelle modifikationer, mens inducerende selv nogle andre specifikke dem (fig. 3A nedre panel) og stort set, selvom ufuldstændigt, afskaffede stigning på luciferaseaktivitet fremkaldt af aldosteron (fig. 3B). Påfaldende, kunne den nukleare translokation af MR fremkaldt af aldosteron ikke blokeres, men snarere er fremkaldt ved spironolacton alene (fig. 3C).

Funktionel validering af vores celle model tillod os at undersøge den mulige årsagssammenhæng mellem MR-aktivitet og ekspressionssystemer ændringer af mRNA, der koder for forskellige angiogene faktorer både i normoxiske og hypoxiske miljø. Vi viste i pchMR-transficerede HTC116 celler dyrket under normoxiske betingelser, MR aktivering ved aldosteron inducerer et signifikant fald i VEGF-mRNA-ekspression, mens det ikke påvirker mRNA ekspressionsniveauer af andre angiogene faktorer, nemlig bFGF, PGF2 og EGF. Den aldosteron-inducerede fald i VEGFA ekspression var specifikt, om end delvis inhiberet af den konkurrencemæssige MR antagonist spironolacton (fig. 4). I det hele taget viser disse data påpege VEGFA som en pro-angiogen gen potentielt reguleret af MR-aktivitet.

Virkninger af aldosteron på VEGFA (A), bFGF (B), PGF2 (C) og EGF (D) mRNA-niveauer i pchMR-transficerede HCT116 celler under normoxiske dyrkningsbetingelser. Cellerne blev behandlet med 3 nM aldosteron i 10% strippet FCS i fravær eller i nærvær af 1 uM spironolacton og analysen af ​​mRNA-niveauer blev udført af Real-time PCR. For hvert panel, blev mRNA-ekspression værdier af behandlede pchMR-transficerede celler sammenlignet med dem for ikke-stimulerede pchMR-transficerede kontrolceller, angivet som 1. Resultaterne er udtrykt som gennemsnit ± SEM (n = 3). * P 0,05 vs pchMR-transficerede kontrolceller, ANOVA efterfulgt af Bonferroni t-test

Det er velkendt, at hypoksi, en konstant egenskab ved fast tumor mikromiljø, kraftigt inducerer VEGFA ekspression.. På dette grundlag analyserede vi effekten af ​​MR-aktivering på VEGFA ekspressionsniveauerne under koncentration lavt iltindhold. På dette formål, vi først viste i pchMR-transfekterede HCT116 celler, niveauerne af VEGFA mRNA stige efter deres eksponering for hypoxi på samme måde som vilde typen HCT116 celler, og at CoCl

2 behandling, som efterligner hypoxi, kraftigt øger VEGFA mRNA-ekspression i transficerede celler (fig. 5B og 5A, henholdsvis). Vi derefter viste, at faldet i VEGFA udtryk fremkaldt af aldosteron i pchMR-transfekterede HCT116 celler under normoxi (fig. 4A) også blev fundet under CoCl

2 behandling eller hypoxiske dyrkningsbetingelser (fig. 6A). Disse resultater er af særlig betydning, da vi viste, at både hypoxi og CoCl

2 behandling kraftigt øger VEGFA mRNA-ekspression (fig. 4B). Endvidere viser vi også, at MR-aktivering med agonisterne naturligt forekommer i hele FCS er i stand til at formindske VEGFA mRNA-ekspression både under normoxiske og hypoxiske betingelser (fig. 6B).

Real-time PCR-analyse af VEGFA mRNA-induktion i vildtype HCT116 celler udsat for de indikerede tider med hypoxi (A) og i pchMR-transficerede HCT116 celler eksponeret for normoxi, hypoxi eller CoCl

2 behandling (B). I felt A blev værdierne af VEGFA mRNA-ekspression for hver prøve sammenlignet med den for tiden 0, indstillet som 1. I panel B blev værdierne af VEGF-mRNA ekspression af pchMR-transficerede celler udsat for hypoxi eller CoCl

2 behandling sammenlignet med den for pchMR-transficerede kontrolceller udsat for normoxi, indstillet som 1. Resultaterne er udtrykt som gennemsnit ± SEM (n = 3-4). * P. 0,05 ANOVA efterfulgt af Bonferroni t-test

Real-time PCR-analyse af VEGFA mRNA-induktion i (A) pchMR-transficerede HCT116-celler behandlet med 3 nM aldosteron i nærværelse eller i fravær af 1 uM spironolacton og eksponeret for CoCl

2 behandling eller hypoxi og (B) pchMR- eller pcDNA3-transfekterede HCT116-celler dyrket med 10% FCS alene under normoxiske og hypoxiske dyrkningsbetingelser. I felt A blev værdierne af VEGFA mRNA-ekspression for hver prøve sammenlignet med de fra ikke-stimulerede pchMR-transficerede kontrolceller, angivet som 1. I panel B blev værdierne af VEGF-mRNA-ekspression af serum-aktiverede pchMR-transficerede celler sammenlignet med dem for pcDNA3-transficerede kontrolceller, indstillet som 1. Resultaterne er udtrykt som gennemsnit ± SEM (n = 3-4). * P 0,05 vs pchMR-transfekterede kontrol celler eller pcDNA3-transfekterede celler, ANOVA efterfulgt af Bonferroni t-test eller Student t-test når det er hensigtsmæssigt

Endelig på grundlaget for seneste rapporter fra Calvani. og samarbejdspartnere om betydningen af ​​KDR udtrykt i HCT116 celler i opretholdelsen celle overlevelse efter udsættelse for langvarig hypoxi, analyserede vi, i pchMR transficerede HCT116 celler, en mulig årsagssammenhæng mellem MR aktivitet og KDR udtryk ændringer. Faktisk disse forfattere demonstreret, at KDR medierer en sen VEGF-afhængig induktion af HIF-1α, hvilket fører til den autokrine produktion af VEGFA, idet de kunne inhibere både HIF-1α-induktion og overlevelse af hypoxiske HCT116 celler, med enten anti-VEGFA eller anti-KDR-antistoffer. [21], som et indledende forsøg, viste vi således tilstedeværelsen af ​​et funktionelt VEGF /KDR /HIF1α autokrine loop i vores HCT116 cellelinie, ved at gengive den manglende sent induktion af HIF-1α af VEGFA antistoffer i celler dyrket under hypoxiske betingelser (fig. S1).

Vi demonstrerede derefter, i pchMR-transficerede HCT116 celler, MR aktivering inducerede et signifikant fald i niveauerne af KDR mRNA. KDR mRNA-ekspression blev reduceret i aldosteron stimulerede pchMR-transficerede HCT116-celler til omkring 65% i forhold til deres ikke-stimulerede kontroller (fig. 7A) og endda i højere grad i serum stimuleret pchMR- transficeret HTC116 sammenlignet med pcDNA3-transficerede kontroller (fig. 7B ). Slående, selvom spironolacton ikke signifikant ændre KDR ekspressionsniveauerne, viste det sig kun at vende delvist effekten af ​​aldosteron behandling i pchMR-transfekterede HCT116 celler. Selv hvis en lignende nedgang i KDR ekspression blev observeret i aldosterone- og spironolacton-aldosteron-behandlede celler sammenlignet med kontroller, i sidstnævnte tilfælde faldet ikke var statistisk signifikant (fig. 7A). Grunde, der kan tegne sig for forskellige spironolacton styrken til ophævelse fremkaldt af aktiv MR på forskellige mål eller i forskellige sammenhænge vil blive diskuteret nedenfor.

Virkninger af aldosteron

(A)

eller serum

(B)

om KDR mRNA-niveauer.

Cellekultur og behandlinger var som i figur 4, eller figur 6 panel B-normoxi hhv. Analyser af KDR mRNA-niveauer blev udført ved Real-time PCR og resultater (n = 5) er angivet som i figur 5. * p 0,05 vs pchMR-transficerede kontrolceller eller pcDNA3-transfekterede celler, ANOVA efterfulgt af Bonferroni t-test eller Student t-test, når det er relevant.

diskussion

da tidligere undersøgelser har vist, at MR udtryk nedreguleret i både kolorektal og lungekræft, er det blevet foreslået, at MR kan fungere som et tumor-suppressor-genet [23].

Her etablerer vi en sammenhæng mellem underekspression af MR, nedsat patientens overlevelse og opregulering af tumorangiogenese i fremskreden cancer stadium. Anvendelse af en in vitro model baseret på en koloncarcinomcellelinie, hvori vi tvunget MR-ekspression, giver vi også beviser for, at aktiverede MR kan dæmpe ekspressionen af ​​VEGFA og dens receptor 2 /KDR.

Et link mellem MR-ekspression og angiogenese i CRC er tidligere blevet foreslået. [22] Her demonstrerer vi, at omfanget af MR-positive celler er omvendt korreleret til MVD i tumorprøver, understøtter den hypotese, at faldet MR ekspression frigiver en undertrykkende rolle udøvet af MR på tumorangiogenese. At give indsigt i den rolle, som MR spillet i CRC angiogenese, viste vi, at re-ekspressionen af ​​aktiveret MR i en coloncancercellelinie, karakteriseret ved en ganske lav MR proteinniveau, dermed efterligne et centralt element til stede i CRC in vivo, fører til en specifik reduktion i mRNA-ekspression af VEGFA blandt andet angiogen faktor analyseres, i celler under normoxiske dyrkningsbetingelser. Disse data giver en direkte påvisning af en suppressiv rolle MR i tumorangiogenese drevet af den maligne epitel. Det er bemærkelsesværdigt, at vores resultater i kolon celler er i overensstemmelse med resultaterne af en nylig undersøgelse i en transgen musemodel viser, at langvarig

in vivo

MR overekspression, i nærvær af fysiologiske mængde aldosteron, der specifikt nedreguleret VEGFA genekspression i hjertet [33].

vides kun lidt om reguleringen af ​​angiogene vækstfaktorer i væv under normoxiske betingelser.