PLoS ONE: Den microRNA miR-34a Hæmmer ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Vækst og CD44hi Stem-Ligesom NSCLC Cells

Abstrakt

Lungekræft er blandt de mest dødelige maligniteter med høj metastase og tilbagefald sats, hvilket sandsynligvis skyldes eksistensen af ​​lungekræft stamceller (CSCS). CSCS i mange tumorer, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er blevet identificeret ved hjælp af vedhæftning molekylære CD44, enten individuelt eller i kombination med andre markør (er). MikroRNA’er (miRNA) regulere både normale stamceller og CSCS og dysregulering af miRNA er blevet impliceret i tumorigenese. For nylig blev MIR-34a viser sig at være nedreguleret i NSCLC-celler, men de biologiske funktioner af MIR-34a i reguleringen NSCLC celle opførsel er ikke blevet grundigt undersøgt. Her viser vi, at transfektion af syntetisk MIR-34a, men ikke den negative kontrol (NC) miRNA oligonukleotider (oligoer) i tre NSCLC cellelinjer, dvs. A549, H460, og H1299, inhiberede deres holoclone dannelse, klonogene ekspansion, og tumor regenerering in vivo. Endvidere lentivirusvektoren-medieret overekspression af MIR-34a i oprenset CD44

hi H460 celler inhiberede også tumorudvækst. I modsætning hertil ekspression af MIR-34a antagomirs (dvs. antisense oligoer) i CD44

lo H460 celler fremmes tumorudvikling. Vores undersøgelse viser, at miR-34a er en negativ regulator af de tumorgene egenskaber NSCLC celler og CD44

hi lunge CSCS, og etablerer et stærkt rationale for at udvikle miR-34a som en ny terapeutisk middel mod NSCLC.

Henvisning: Shi Y, Liu C, Liu X, Tang GD, Wang J (2014) den microRNA miR-34a Hæmmer ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) vækst og CD44

hi Stem-Like NSCLC Cells. PLoS ONE 9 (3): e90022. doi: 10,1371 /journal.pone.0090022

Redaktør: Gokul M. Das, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: November 29, 2013; Accepteret: 24 Jan 2014; Udgivet: 4 marts 2014

Copyright: © 2014 Shi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.141.096 og Grant nr 81.372.512) og Key Projektpuljen af ​​Shanghai Videnskab og Teknologi forening, Kina (Grant nr 05.119.554) til J. Wang, og NIH (R01- CA155693), Department of Defense (PC120817), CPRIT (RP120380), og MDACC center for Cancer Epigenetik og RNA center-Laura John Arnold Foundation giver til GD. Tang. C. Liu blev støttet, delvist af en DOD ph.d.-stipendium (PC121553). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion Salg

Kræft stamceller (CSC), dvs. kræftceller med visse stamceller egenskaber, er blevet rapporteret i mange humane tumorer og menes at være ansvarlig for tumor initiering, terapi modstand, progression, tilbagefald, og metastase [ ,,,0],1] – [3]. MikroRNA’er (miRNA), små ikke-kodende RNA, regulerer omkring 20% ​​-30% af generne i det humane genom, og har været impliceret i reguleringen af ​​proliferation, differentiering, migration, og apoptose gennem hæmme protein oversættelse og /eller inducere messenger nedbrydning ved binding til de komplementære sekvenser af 3′-utranslaterede region (3′-UTR) i deres mål mRNA’er [4], [5]. miRNA kan fungere som både onkogener og tumorsuppressorgener [6], [7], og er dukket op som vigtige regulatorer af CSCS samt.

microRNA-34a (miR-34a) fungerer som en tumor suppressor [ ,,,0],8] og nedreguleres i nogle humane cancere, herunder brystcancer [9], prostatacancer [10], osteosarkom [11], og lungecancer [12], [13]. Lungekræft er den mest dødbringende malignitet på verdensplan. Arbejde i de sidste mange år viser, at både småcellet (SCLC) og ikke-småcellet (NSCLC) lungekræft indeholder CSCS [14], [15]. Som i de fleste andre tumorer, har potentielle lunge CSCS blevet beriget og oprenset under anvendelse af funktionelle assays [16] – [18] samt celleoverflademarkører såsom CD133, CD34, CD90, og CD44 [3]. CD44 er et membranbundet glycoprotein, der medierer en kompleks række funktioner. Nogle undersøgelser har vist, at CD44

+ -celler er beriget til tumor-formeringsmateriale kapacitet, og at CD44 er en potentiel CSC markør i NSCLC [19]. Liu

et al

har vist, at MIR-34a kan inhibere prostata CSCS og metastase ved direkte undertrykke CD44 [20]. Identifikation af CD44 som en direkte og funktionelt relevante miR-34a target afslører en tidligere unappreciated signalvej [20].

Selv om der er tegn på, at miR-34a reduceres i NSCLC, de biologiske funktioner af denne miRNA i NSCLC forblive nødtørftigt undersøgt. I denne undersøgelse under anvendelse af en række biologiske assays kombineret med omfattende xenograft tumor eksperimenter, rapporterer vi, at MIR-34a negativt regulerer CSC-associerede egenskaber samt tumorfremkaldende kapacitet på tre NSCLC celler.

Materialer og Metoder

Dyr og dyreforsøg

immun-mangelfuld NOD-SCID (ikke-overvægtige diabetiske alvorlige kombineret immun mangelfuld) mus blev produceret det meste fra vores egen ynglekolonier og vedligeholdes i standardbetingelser i henhold til institutionelle retningslinier. Alle dyrerelaterede undersøgelser i dette projekt er blevet godkendt af M.D. Anderson Cancer Center IACUC (Institutional Animal Care og brug Udvalg ACUF # 08-05-08132). Den aktuelle forskning indebærer ikke mennesker (dvs. levende enkeltpersoner eller identificerbar private oplysninger). Alle andre undersøgelser præsenteret heri var den investigator-initieret og ikke kræver godkendelse fra andre tilsynsmyndigheder.

Celler og grundlæggende eksperimentelle procedurer

De tre humane NSCLC cellelinjer (A549, H460, og H1299 ) blev opnået fra ATCC. Alle celler blev holdt i medier anbefalet af ATCC tilsat 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen-Life Technologies). Celler blev inkuberet i en fugtig inkubator ved 37 ° C forsynet med 5% CO

2. Celler blev rutinemæssigt opretholdt i 75 cm

2 vævskulturkolber (Corning Incorporated, USA) og høstet ved anvendelse af 0,05% trypsin. Mest grundlæggende eksperimentelle procedurer er beskrevet i vores tidligere publikationer [20], [21].

Transient transfektion med syntetiske oligonukleotider (oligoer)

Vi transficerede bulk-celler eller oprenset CD44

+ NSCLC celler med 33 nM miR-34a eller ikke-targeting negative kontrol miRNA (miR-NC) oligoer (Ambion, Austin, TX) ved hjælp af lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen). Alternativt transficerede vi de oprensede CD44

– NSCLC celler med 33 nM anti-MIR-34a (anti-34a) eller anti-MIR-NC (anti-NC) oligoer (Ambion). Vi generelt høstet de transficerede celler til in vitro eller in vivo-undersøgelser efter dyrkning i 48 timer.

Lentiviral-medieret overekspression af MIR-34a

A lentiviral vektor, der koder præ-MIR-34a (Lenti -34a) og kontrolvektoren (Lenti-CTL) blev opnået fra Systems Biosciences (SBI) [20]. Lentivirus blev produceret i 293FT pakkende celler og titere bestemt for GFP ved hjælp HT1080 celler. NSCLC-celler blev inficeret ved en MOI på 25 i nærvær af 8 ug /ml polybren og høstet 48-72 timer efter infektion.

Kvantitativ RT-PCR Salg

Ældre miRNA og CD44-mRNA-niveauer blev kvantificeret under anvendelse af TaqMan miRNA tests (Applied Biosystems) [20]. Kort beskrevet blev totalt RNA isoleret ved anvendelse af Mirvana PARIS miRNA Isolation Kit (Ambion). Kvantitative miRNA udtryk data blev normaliseret til interne “husholdning” miRNA, dvs. miR-24 og miR-103. Kvantitative mRNA udtryk data blev normaliseret til interne “husholdning” mRNA, dvs. GAPDH. Forskelle mellem de positive og tilsvarende negative populationer, dvs ddCt værdier, for hver af de miRNA eller mRNA blev konverteret til en procentdel af udtryk ved hjælp af formlen 2

-ddCt [20].

Klonal og klonogene assays

i holoclone assays [22], vi udpladet NSCLC-celler ved en klonal densitet (dvs. 50 celler /brønd) i en 6-brønds skål, tælles antallet af holoclones flere dage senere, og fremlagt procentdelen af celler, der er etableret en holoclone som kloning effektivitet. For klonogene assays [20], for det første, blandede vi methylcellulose (MC) med serumfrit medium suppleret med 5 pg ml-1 insulin, 20 ng ml-1 EGF og 10 ng ml-1 bFGF (Sigma). Derefter udpladet vi celler generelt ved 1000 celler /brønd i MC blanding ved 1:10 i 24-brønds ultralav binding (ULA) plader og opregnede kolonier 2-3 uger efter udpladning. For alle ovennævnte eksperimenter, vi løber et minimum af tre brønde for hver betingelse og forsøgene gentages vidt muligt.

Flowcytometrianalyse og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)

Ekspression af CSC markører blev bedømt ved flowcytometri. Celler blev farvet levende i farvningsopløsning indeholdende BSA og FITC-konjugeret monoklonalt anti-CD44 (klon # G44-26, BD Bioscience) eller PE-konjugeret monoklonalt anti-CD133 (klon # AC133; Miltenyi Biotech) ved koncentrationen anbefalet af producenter. Tilsvarende isotype-matchede museimmunoglobuliner blev anvendt som negative kontroller (BD Bioscience). Mindst 10.000 celler blev analyseret. For cellesortering blev mærkning af celleoverflademarkører udført under steriliserede betingelser, og cellerne blev sorteret efter BD FACSVantage cellesorterer (BD Bioscience). Den øverste 10% mest lyst farves, og de nederste 10% mest svagt farvede celler blev udvalgt som de positive og negative populationer, hhv. Sortering renhed på over 90% blev sikret til yderligere in vitro- og in vivo forsøg. Alle data blev analyseret af Flowjo software (version 7.6.1).

Aldefluor assay

Aldefluor Assay Kit (Aldagen, Inc. Durham, NC) blev anvendt til at profilere aldehyddehydrogenase ( ALDH) aktivitet i NSCLC celler [23]. Celler blev inkuberet i Aldefluor assaybuffer indeholdende ALDH proteinsubstrat BODIPY-aminoacetaldehyd (Baaa) i 40 minutter ved 37 ° C. Celler, som kunne katalysere Baaa til dens fluorescerende produkt BODIPY-aminoacetat (BAA) blev anset ALDH

+. Sortering porte til FACS blev trukket i forhold til cellernes basisliniefluorescensen, som blev bestemt ved tilsætning af ALDH specifik inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB) under inkubationen og DEAB-behandlede prøver tjente som negative kontroller. Ikke-levedygtige celler blev identificeret ved propidiumiodid (PI) positivitet. Celler blev sorteret af BD FACSVantage Cell sorteringsanlæg.

Tumor transplantation eksperimenter

Celler blev injiceret i 60 pi medium:Matrigel blanding (01:01) subkutant (sc) i NOD /SCID-mus ( 6-8 uger gamle). Vi transficerede bulk-H460, A549, eller H1299 celler med MIR-34a eller MIR-NC oligoer (33 Nm). 48 timer senere, tre forskellige celledoser på 500.000, 50.000, eller 5.000 blev implanteret. For H460 celler, yderligere 2 millioner celler hver (n = 7) blev implanteret. Foruden oligo transfektion, vi inficerede også nogle celler med Lenti-34a eller Lenti-CTL-vektorer (MOI 25) [20], og, 48 timer senere, tre celledoser på 500.000, 50.000, 5.000 blev implanteret. Endelig har vi transficeret oprensede CD44

lo H460 celler med anti-34 eller anti-NC oligoer (33 nM) og også inficeret renset CD44

hi H460 celler med Lenti-34a eller Lenti-CTL-vektorer (MOI 25). 48 timer senere blev celler i forskellige doser implanteret. Tumorvækst blev overvåget på ugebasis og individuelle tumorvolumener blev målt ved anvendelse af en digital skydelære og tilnærmes efter formlen V = 1 /2ab

2 (a er den lange diameter og b den korte diameter af tumoren). I slutningen af ​​forsøgene blev musene aflivet, og tumorerne blev høstet, målt, og fotograferet.

Statistisk analyse

Vi brugte uparret tosidet Students

t

-test til sammenligne forskelle i celleantal, klondannelseseffektiviteten tumorvægte, og andre relaterede parametre. Vi anvendte Chi-square test til sammenligning forekomsten og latenstid. Vi brugte ANOVA (F-test) til at sammenligne forskelle i flere grupper. I alle disse analyser, en

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater og Diskussion

miR-34a hæmmer NSCLC celle holoclone dannelse og klonogent kapacitet

.

mIR-34a har vist sig at besidde tumor-undertrykkende funktioner [8], [20], [21], [24] – [33] og for at være under-udtrykt i nogle tumorer samt visse tumorigene subpopulationer [ ,,,0],10] såsom CD44

+ prostata CSCS [20]. MIR-34a er en direkte p53 target [32] og dets promotor er stumme i nogle cancerceller [30]. Der har været nogle eksperimentelle beviser for, at miR-34a nedreguleres i NSCLC celler [12], [13]. For at belyse den potentielle biologiske konsekvens af tab af miR34a udtryk i NSCLC celler, vi først transficerede tre NSCLC celler, A549 (p53 vildtype), H460 (p53 vildtype), og H1299 (p53 mutant), med syntetisk moden miR- 34a eller mIR-NC oligoer (33 nM) [20] i 48 timer, og derefter udpladet cellerne i tre eksemplarer ved klonal densitet (dvs. 50 celler /brønd) i plader med 6 brønde. Vi vurderede dernæst dannelsen af ​​holoclones, som har vist sig at huse selvfornyende CSCS der kan langsigtet udbreder tumorer [22], 12 dage (d) efter udpladning. Som vist i figur 1 (A-C), MIR-34a overekspression signifikant inhiberede holoclone etablering i alle tre NSCLC modeller. Af betydning, selv om miR-NC transficerede NSCLC celler dannede store og tætpakkede holoclones, MIR-34a transficeret NSCLC celler grundlagt meget mindre og /eller løst pakket paraclones (se figur 1B for eksempler). Efterfølgende udførte vi strengere, forankringsuafhængige, klonogene assays i methylcellulose (MC), som er blevet meget udbredt at måle celle-autonome aktivitet af potentielle CSCS [3]. Som i klonale assays, MIR-34a overekspression stærkt inhiberede kugle-dannende evne af bulk A549, H460 og H1299 celler (Figur 1D-E). Salg

(A-C) Klonale assays. Celler transficeret med MIR-34a eller MIR-NC oligoer (33 nM) blev udpladet i tredobbeltbestemmelse ved 50 celler /brønd i plader med 6 brønde. Eksperimentet blev afsluttet ved 12 d og brønde var Giemsa-farvede (A). Vist i B er repræsentative billeder. Resultaterne vist i A og B var repræsentative for to uafhængige forsøg. (C) Kvantitativ præsentation af resultater i A. Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± S.D. (D-E) klonogene assays i MC. I alt 1000 celler pr brønd blev udpladet for klongenicitetsassayet. Billeder blev taget på d 15 efter plating og vist i D er repræsentative felter. (E) Kvantitativ præsentation af resultater i D. Bars repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse

De ovennævnte eksperimentelle resultater dokumenterer, at restaurering af miR-34a udtryk i NSCLC celler hæmmer både klonale og klonogene egenskaber. Da de 3 NSCLC celler besidder forskellige p53 status, resultaterne antyder også, at de inhiberende virkninger af MIR-34a er p53-uafhængig. Som forventet celler transficeret med de MIR-34a oligoer viste dramatisk forøget MIR-34a-niveauer som vurderet ved qPCR analyse af modent MIR-34a (figur 2A). Interessant, men de 3 NSCLC celletyper viste en stor variation i de øgede miR-34a niveauer, med H1299 celler bevarer det højeste beløb af eksogen miR-34a 48 timer efter transfektion (figur 2A). Som diskuteret tidligere, MIR-34a er en direkte transkriptionel mål af p53 [32] og H1299 celler har mutant p53. En mulighed er, at både p53 og miR-34a niveauer i lunge kræftceller skal meget tæt kontrolleret. Følgelig i A549 og H460 celler, der har vildtype p53, selv eksogent introduceret p53 bliver nedbrudt hurtigt henviser i p53-mutant H1299 celler, de transficerede modne MIR-34a oligoer overleve meget længere (figur 2A).

(A) NSCLC celler frisk transficeret med miR-34a oligoer viste miR-34a niveauer adskillige størrelsesordener højere end de transficeret med miR-NC oligoer. De angivne NSCLC-celler blev transficeret med MIR-34a eller MIR-NC-oligoer, og 48 timer senere, blev høstet og anvendt i tumor forsøg (nedenfor) henviser et lille antal celler blev afsat og anvendt i QRT-PCR måling af miR- 34a mRNA-niveauer. Vist er de gennemsnitlige miR-34a niveauer (i log-skala, n = 2) i miR-34a transfekterede celler i forhold til dem i miR-NC transfekterede celler (faktiske middelværdier er angivet i søjlerne). (B-D) MIR-34a oligo transfektion inhiberes A549 tumorvækst. Indiceret er tumorincidens (tumorer udviklet /antal injektioner;%), høsttidspunkt (herunder faktiske injektion og opsigelse datoer), betyde tumor vægt (i gram), og

P

værdier for tumor vægte. Brutto tumor billeder er ikke i samme målestok. (E-G) MIR-34a oligo transfektion inhiberede H460 tumorvækst. (H-L) miR-34a oligo transfektion hæmmede H1299 tumorvækst.

Bevis for, at miR-34a overekspression hæmmer også tumor udvikling

Vi derefter vurderet de potentielle tumor-hæmmende virkninger af mIR-34a på de tre NSCLC celletyper in vivo (figur 2). Vi transficerede 33 nM MIR-34a eller MIR-NC oligoer i A549-celler i 48 timer og derefter implanteres 50.000 (50 K) celler subkutant (s.c.) i immun-deficiente NOD /SCID-mus. Som vist i figur 2B-D, MIR-34a transficerede celler udviklede tumorer, som kun var omkring halvdelen af ​​størrelser af miR-NC tumorer og den tidligere også voksede langsommere. Det skal bemærkes, at forskellen i tumorvægte ikke var statistisk signifikant på grund af de relativt små prøver. Tilsvarende MIR-34a overudtrykker H460-celler udvikles meget mindre og langsommere voksende tumorer sammenlignet med MIR-NC transficerede H460 celler (Figur 2E-G). H460-celler inficeret med et MIR-34a lentiviral vektor (dvs. Lenti-34a) regenereres også mindre og langsommere voksende tumorer end kontrolvektoren inficerede celler (Figur S1A-C). Vigtigere er det, miR-34a overekspression i H460 celler reduceret tumorincidens (75% i miR-NC vs. 50% i miR-34a,

P

0,01, figur 2E). Endelig har vi udført en begrænsende-fortynding tumoranalyse ved at implantere 5 k, 50 k, eller 500 k af MIR-NC eller MIR-34a transficerede H1299-celler i NOD /SCID-mus og på hver celle dosis vi observeret mindre og langsommere voksende tumorer afledt fra mIR-34a overudtrykker celler sammenlignet med tumorerne fra mIR-NC transficerede H1299-celler (Figur 2H-L). Igen, miR-34a overekspression reduceret tumorincidensen ved to celledoser implanteret (dvs. 5 k og 500 k,

P

0,01, figur 2I). Faktisk MIR-34a transficerede H1299-celler udviser signifikant lavere tumorfremkaldende frekvens (TIF) end tilsvarende MIR-NC kontroller (

P

= 4.64E-179) som bestemt ved hjælp af Limdil funktion Statmod pakke (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html). De relativt stærkere tumor-hæmmende virkninger af miR-34a på H1299 celler med hensyn til tumorincidensen er sandsynligvis relateret til langt højere niveauer af exogent miR-34a i transficerede H1299 celler (figur 2A).

Som det er tilfældet af A549 celler, forskellene i tumor vægt i miR-34a vs. miR-NC transficerede H460 og H1299 celler nåede ikke statistisk signifikans, sandsynligvis på grund af relativt små stikprøvestørrelser (Figur 2E og 2I henholdsvis), som er en meget almindelig fænomen i sådanne xenograft tumor assays. En anden plausibel forklaring er, at de transficerede oligoer blev efterhånden nedbrudt in vivo, som vi gentagne gange har observeret i lignende tumor eksperimenter ved hjælp miR-34a [20], og lad-7 [21] oligoer. Til støtte, de resterende tumorer afledt af MIR-34a transficerede celler viste ingen stigning i MIR-34a (data ikke vist) i modsætning til frisk transficerede celler (figur 2A). En interessant observation var, at p53-mutant H1299 celler bevaret signifikant højere niveauer af exogent MIR-34a (figur 2A), som også syntes at manifestere de stærkeste tumor-inhiberende virkninger i denne cellelinie (sammenlign figur 2I vs figur 2B og 2E ).

miR-34a overekspression hæmmer CD44

hi H460 tumor regenerering mens anti-34a fremmer tumorvækst i renset CD44

lo H460 celler

der har været stærke eksperimentelle beviser for, at miR-34a kan manifestere tumor-hæmmende effekter ved målretning CSCS [10], [20], [21] og NSCLC cellekulturer har vist sig at havnen stamceller-lignende cancerceller [3], [14] – [19]. Derfor er vi spekulerer på, om de biologiske virkninger af miR-34a på de 3 NSCLC celler (Figur 1 og 2) kan være relateret til dens virkning på stamceller-lignende cancerceller. For at løse dette spørgsmål, vi først fastsatte den procentdel af cellerne positive for Aldefluor, CD44, og CD133, analyser eller markører ofte anvendes til at berige lunge CSCS. Vi observerede ~1-2% Aldefluor positiv H460 og H1299 celler, som i vid udstrækning blev “ablerede” i overværelse af ALDH inhibitor DEAB (figur 3). Af ukendte årsager, viste flere gentagne eksperimenter, 90% af A549-celler var Aldefluor-positive og denne procentdel blev ikke påvirket af DEAB (figur 3). Næsten 100% af A549, H460, og H1299-celler var CD44-positive (middelværdier er 97,2%, 99,3% og 99,2%, henholdsvis; n = 3) (figur 3). I modsætning hertil var der næsten ingen ekspression af CD133 i disse tre NSCLC cellelinier (figur 3C). Det er interessant, at disse assays kan identificere overlappende populationer af stamceller-lignende NSCLC celler som oprenset ALDH

hi H1299-celler udviste højere niveauer af CD44 mRNA (figur S1D). I indledende undersøgelser, vi implanteret 5 k eller 10 k oprensede ALDH

hi og den tilsvarende ALDH

lo H1299 celler i NOD /SCID-mus. Ved 5 k, den ALDH

hi og ALDH

lo celler udviklede 4/5 (1,22 g, 0,32 g, 0,24 g, og 0,12 g) og 1/7 (0,99 g) tumorer, hhv. Ved 10 k, den ALDH

høj og ALDH

lo celler udviklede 3/8 (0,36 g, 0,2 g, 0,1 g) og 1/8 (0,03 g) tumorer, hhv. Disse foreløbige resultater antyder, at ALDH

høj H1299 celler besidder højere tumor-regenererende kapacitet, en vigtig CSC træk.

(Top) The Aldefluor assayet i 3 NSCLC celler. DEAB-behandlede prøver tjente som negative kontroller. ~1-2% H460 og H1299 celler var Aldefluor-positive hvorimod 90% af A549 celler var Aldefluor-positive. (Mellemøsten) Repræsentant flowcytometri profil CD44 (FITC) udtryk i 3 NSCLC celler. Næsten 100% af A549, H460, og H1299-celler var CD44-positive (middelværdier er 97,2%, 99,3% og 99,2%, henholdsvis; n = 3). (Bottom) Flowcytometrianalyse af CD133 (PE) ekspression i 3NSCLC celler. Der var næsten ingen ekspression af CD133 i disse tre NSCLC cellelinier.

I PC3 prostatacancerceller, næsten 100% celler er positive for CD44 [34]. Der er imidlertid PC3 celler, som udtrykker meget høje niveauer af celleoverfladen CD44 (dvs. CD44

hi) og de lave niveauer af CD44 (dvs. CD44

lo). Af betydning, CD44

hi PC3 celler viste signifikant højere klonale og klonogene potentialer end de isogene CD44

lo PC3 celler [34]. Tegning på denne analogi, vi renset ud CD44

hi (dvs. top 10%) og CD44

lo (dvs. nederste 10%) H460 celler (figur 4A). Som forventet, CD44

hi H460 celler udtrykte højere niveauer af CD44 mRNA end CD44

lo H460 celler (

P

= 0,0009) (figur 4B). Bemærkelsesværdigt, lentiviral-medieret MIR-34a overekspression i CD44

hi H460 celler signifikant inhiberede tumorvækst (figur 4C, E og F). Mere imponerende, anti-miR-34a antagomirs [20] dramatisk fremmet tumoren regenerering og tumorvækst på CD44

lo H460 celler på alle tre celle doser (100 k, 10 k, og 1 k) testet (figur 4D , G-J).

(A-B) CD44 ekspressionsniveau. (A) Repræsentative diagrammer af flowcytometri analyse af CD44 (FITC) ekspression i H460 celler. (B) CD44 mRNA-niveauer i oprensede CD44

hi og CD44

lo H460 celler vurderet ved QRT-PCR. (C, E, F) miR-34a overekspression i renset CD44

hi H460 celler ved lentiviral infektion hæmmede tumor regenerering. (C) anført er tumorincidensen (tumorer udviklet /antal injektioner;%), høsttidspunkt (herunder faktiske injektion og opsigelse datoer), betyde tumor vægt (i gram, F), og

P

værdier for tumorvægte. Brutto tumor billeder er ikke i samme målestok. (E) Kurven tumorvækst. (D, G-J) Anti-miR-34a fremmet tumorvækst af renset CD44

lo H460 celler. (D) viste er tumorincidensen (tumorer udviklet /antal injektioner;%), høsttidspunkt (herunder faktiske injektion og opsigelse datoer), betyde tumor vægt (i gram, G), og

P

værdier for tumorvægte. Brutto tumor billeder er ikke i samme målestok. (H-J) Tumoren vækstkurve ved tre forskellige celledoser.

Sammenfattende har vi vist, at MIR-34a overekspression hæmmer NSCLC celle holoclone dannelse og klonogenisk ekspansion in vitro og, vigtigere, tumor regeneration in vivo. Disse hæmmende virkninger af miR-34a kan skyldes dens virkninger på stamceller-lignende NSCLC celler. Til støtte for denne mulighed, tvungen udtryk for miR-34a specifikt i CD44

hi H460 celler i høj grad hæmmet deres tumor-regenererende aktivitet mens antagonister af miR-34a dramatisk fremmet tumor regenerering i CD44

lo H460 celler. Disse observationer er konsistente med CD44 er en direkte og funktionel mål for MIR-34a i prostata [20], og nogle andre cancer [31] -celler og foreslå, at MIR-34a negativt regulerer tumorfremkaldende kapacitet NSCLC CSCS. Det fremtidige arbejde vil sigte mod at belyse de underliggende mekanismer og interaktioner mellem miR-34a og CD44-ekspression i NSCLC celler.

Støtte oplysninger

figur S1.

miR-34a hæmmer H460 tumorvækst og ALDH

hi H1299 celler udtrykker højere CD44 mRNA-niveauer. (A-C) Lentiviral-medieret MIR-34a overekspression i H460 celler inhiberede tumorvækst. (A) De endpoint tumor vægte. (B og C) Tumor vækstkurver ved to forskellige celledoser. (D) De CD44 mRNA-niveauer i oprenset ALDH

hi og tilsvarende ALDH

lo H1299 celler vurderet ved QRT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0090022.s001

(TIF)

tak

Vi takker T. Davis for bistand i alle tumor eksperimenter og P. Whitney for FACS. Vi takker også andre medlemmer af Tang laboratorium for nyttige diskussioner og støtte.