PLoS ONE: Dereguleret HOXB7 Expression Forudsiger dårlig prognose for patienter med esophageal pladecellecarcinom og Regulerer Cancer Cell Proliferation in vitro og in Vivo

Abstrakt

Baggrund

Vi observerede unormale HOXB7 udtryk i esophageal pladecellecarcinom (ESCC) tidligere. Denne undersøgelse var at vurdere den prognostiske betydning af HOXB7 og afslører den potentielle mekanisme.

Metoder

Immunhistokemi blev anvendt til at bekræfte den unormale udtryk for HOXB7 i ESCC. Den prognostiske betydning af HOXB7 udtryk blev analyseret i to uafhængige kohorter. RNAi blev anvendt til at etablere to stabile HOXB7-knockdown cellestammer. CCK8 assay cellevækst kurve assay kolonidannelse assayet, flow cyklus analyse og tumorigenicitet assay i nøgne mus blev anvendt til at undersøge effekten af ​​HOXB7 på proliferation in vitro og in vivo.

Resultater Salg

immunhistokemi bekræftede den abnorme ekspression af HOXB7 i ESCC forhold til paracancerous mucosa (18/23 vs. 9/23, p = 0,039). HOXB7 ekspression blev positivt korreleret med T stadium lymfeknudemetastase og TNM stadie. Medianoverlevelsen af ​​patienter med høj HOXB7 ekspression var betydeligt kortere end med lav ekspression (45 måneder mod 137 måneder, p = 0,007 for kohorte 1; 19 måneder vs. 34 måneder, p = 0,001 for kohorte 2). Multivariat overlevelse analyse viste, at HOXB7 udtryk var en anden uafhængig prognostisk faktor (HR [95% CI] = 0,573 [0,341-0,963], p = 0,036 for kohorte 1, HR [95% CI] = 0,543 [0,350-0,844], p = 0,024 for kohorte 2). Forsøg in vitro og in vivo viste, at efter knockdown af HOXB7, spredning faldt, vækstrate nedstammer, koloni-dannelse evne reduceres, G1-fasen indtruffet, og til tumorigenicitet reduceres bemærkelsesværdigt.

Konklusioner

HOXB7 kunne fremme kræft celledeling og kan være en uafhængig prognostisk faktor for patienter med ESCC

Henvisning:. Li H, Shen LY, Yan WP, Dong B, Kang XZ, Dai L, et al. (2015) Dereguleret HOXB7 Expression Forudsiger dårlig prognose for patienter med esophageal pladecellecarcinom og Regulerer Cancer Cell Proliferation in vitro og in vivo. PLoS ONE 10 (6): e0130551. doi: 10,1371 /journal.pone.0130551

Academic Redaktør: Nikki Pui Yue Lee, The University of Hong Kong, HONG KONG

Modtaget: 27. januar 2015; Accepteret: 21. maj 2015; Udgivet 15. juni, 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i øjeblikket kræft i spiserøret er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme på verdensplan, og esophageal pladecellekræft (ESCC) er den mest almindelige patologiske form i den kinesiske befolkning [1, 2]. Selvom operationen-dominerede tværfaglig behandling betydeligt har avancerede i de seneste to årtier med hensyn til diagnose og behandling af ESCC, og resultatet af behandlingen er blevet forbedret, den langsigtede overlevelse er stadig utilfredsstillende [3]. En af de effektive foranstaltninger til forbedring samlet overlevelse omfatter identifikation af kliniske biomarkører med prognostisk betydning at vejlede behandling. HOX-gener er en gruppe af gener, der regulerer embryonisk udvikling. Familien, med 39 medlemmer, er opdelt i fire klynger, nemlig A, B, C og D, som er placeret på fire forskellige kromosomer [4, 5]. HOX koder en familie af transkriptionsfaktorer, og deres abnorme udtryk er ofte forbundet med sygdomme, dermed tiltrække stigende opmærksomhed i kræftforskningen [6, 7]. Tidligere undersøgelser i udviklingsmæssige biologi har vist, at HOXB7 normalt udtrykkes i udviklingen af ​​det menneskelige spiserøret [8]. Blandt de 39 HOX-gener undersøgt i vores tidligere undersøgelse blev otte kun udtrykkes i det maligne væv fra ESCC patienter, men ikke i de parrede tilgrænsende normale væv, herunder HOXB7 med 58,3% positivt udtryk rate [9]. Derfor vi hypotese, at HOXB7 spillet en særlig rolle i forekomsten og udviklingen af ​​ESCC og kan være et nyttigt molekylær markør til at forudsige prognosen og endda vejlede behandling. Så vidt vi ved, er der sjældne undersøgelser af HOXB7 udtryk og prognose i ESCC indebærer et stort stikprøvestørrelse, og ingen in vivo og in vitro-studier diskuterer den underliggende mekanisme. Derfor er den nuværende undersøgelse havde til formål at undersøge den prognostiske betydning og funktionel mekanisme HOXB7 i ESCC væv.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle forskning med mennesket deltagere blev godkendt af de etiske komitéer i Beijing Cancer Hospital, Kina, og udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. er opnået skriftlige informerede samtykke fra alle deltagere.

Patienter og vævsprøver

For at validere høj ekspression af HOXB7 i ESCC væv rapporteret i vores tidligere undersøgelser [9], blev 23 ESCC patienter rekrutteret og paraffin-embedded tumor og parret noncancerous vævssnit blev hentet

at undersøge sammenslutningen af ​​HOXB7 protein udtryk med prognosen for patienter med ESCC blev to uafhængige studier kohorter inkluderet:.

den kohorte I.

Vores forskning nedsat en potentiel database for kræft i spiserøret, da Jan. 2000 og 1249 sager med esophagectomy udført af en enkelt kirurg team (Dr. KN Chen) er blevet fortløbende indsamlet. I denne undersøgelse var inklusionskriterierne som følger: de patienter, der var patologisk diagnosticeret med ESCC og undergik radikale esophagectomy uden induktionsbehandling før operation mellem januar 2000 og december 2011. I alt 177 sager opfylder kriterierne (tabel 1). Den 7. udgave af TNM (AJCC og UICC, 2009) blev anvendt til at klassificere patienter.

Den kohorte II.

kohorte II omfattede 103 patienter, der var patologisk diagnosticeret med ESCC og undergik radikale esophagectomy af flere kirurger uden induktionsbehandling før vores kommende database etableret 1996-2002 (tabel 1). Data blev efterfølgende indsamlet i henhold til patientens journaler uden prospektive data. Det TNM af UICC 1987 blev brugt til at evaluere patienter.

Opfølgende metoder

De opfølgende data for kohorte blev jeg indsamlet fra vores kommende database. Efter operationen blev ambulant opfølgende besøg gennemført én gang i hver 3 måned i de første 2 år, én gang i hver 6. måned fra 2 til 5 år, og en gang i hvert år efter 5 år. Den samlede overlevelse blev defineret som tiden fra datoen for kirurgi til døden eller den sidste opfølgning. Den sidste opfølgning checkpoint var august 2013. Den samlede opfølgning sats for vores database var 96,1%: 80,2% ambulante besøg og 15,9% telefon eller brev opfølgning. Telefonen eller brev opfølgning primært involveret de patienter uden at besøge til ambulant klinik på tidsplanen. Ambulant opfølgning involveret registrering af symptomer og flere undersøgelser, herunder CT, øvre gastrointestinal billeddannelse, abdominal og bilateral supraclavicular ultralyd, og gastroskopi om nødvendigt. Efter 2010, nogle patienter gennemgik positronemissionstomografi CT (PET-CT) undersøgelser.

De opfølgende data kohorte 2 blev indsamlet fra gennemgangen af ​​patientens journal. Den sidste follow-up tid var feb 2008 og opfølgning sats var 80%.

Cellekulturer

De humane ESCC cellelinier EC109 og KYSE150 blev indhentet fra Cell Bank of Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina. EC109 blev dyrket i DMEM-medium (Gibco) suppleret med 10% FBS (Gbico) ved 37 ° C i en 5% CO2 luftatmosfære. KYSE150 blev dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco) med 10% FBS (Gbico) ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære af luft.

Vektorer konstruktion og lentiviral infektion

I nedregulering af HOXB7, fire korte hårnål (shRNA) sekvenser (GCCGAGTTCCTTCAACATGCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/CGAGAGTAACTTCCGGATCTA/GCCTCACGGAAAGACAGATCA/ACCTGTTCTGTAGCTTTCTGG) blev klonet ind pGLV-H1-GFP-puro. Scrambled sekvens (ACTACCGTTGTTATAGGTG) blev anvendt som kontroller. Lentivirale vektor konstruktion og emballage blev udført af GenePharma Company (Shanghai, Kina). Celler blev inficeret med 50 pi filtreret lentivirus supernatant (1 × 10

9 TU /ml) i hver brønd af 24-brønds plade med tilstedeværelsen af ​​8 ug /ml polybren (Millipore). Stabile transfekterede celle stammer, der udtrykker shHOXB7 blev selekteret med 2 ug /ml puromycin.

RNA-ekstraktion, RT-PCR og real-time PCR

Totalt RNA af celler blev ekstraheret ved TRIzol (Invitrogen, Carlsbad , California). RNA blev revers transskriberet til cDNA ved RT-PCR (Fermentas Life Science). Kvantitativ Realtime PCR blev udført ved anvendelse af SYBR Green Realtime PCR Maser Mix (Applied Biosystems) for at detektere mRNA ekspressionsniveauer af målgener. GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphat) blev anvendt som endogent kontrol. Sekvensen af ​​de anvendte primere er som følger: for HOXB7, fremadrettet 5′-TATGGGCTCGAGCCGAGTT- 3 ‘, reverse 5′-GGCCTCGTTTGCGGTCAGT -3′; for GAPDH, fremadrettet 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC -3 “, omvendt 5’GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3”. Alle assays blev udført in triplo under 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems) og gentaget tre gange i henhold til fabrikantens protokol. Evaluering af relativ ekspression blev beregnet ved komparativ CT (tærskelcyklus) metode. 2

-ΔΔCt henvist til folden af ​​mRNA ekspressionen af ​​målgenet i forhold til GAPDH udtryk i den samme prøve.

Western blotting

I alt celleekstrakter udarbejdet i 1 × SDS påsætningsbuffer, adskilt ved SDS-PAGE, blottet ind PVDF-membraner, så immunreagerer med monoklonalt muse-anti-HOXB7 antistof (Abnova) som primært antistof. Gede-anti-muse peberrodsperoxidase-konjugeret IgG blev anvendt som et sekundært antistof. Immunoreaktivitet blev fundet med en forøget kemiluminescens reaktion kit (GE Healthcare). Som ladningskontrol, glyceraldehyde- 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev detekteret ved anvendelse af et monoklonalt muse-antistof (Abcam).

Immunhistokemi

Efter rutinemæssig afparaffinering og hydratisering, vævssnit blev behandlet med 3 % hydrogenperoxid og derefter opvarmet i citratopløsning (pH = 6,0) for antigen hentning. Den HOXB7 antigen-antistof-reaktion fandt sted natten over ved 4 ° C efter gedeserum blokering. Det monoklonale muse-anti-HOXB7 antistof (Abnova) blev anvendt ved 1 ug /ml (1: 1000), og gede-anti-muse biotinkonjugeret IgG blev anvendt som sekundært antistof. De immunohistokemiske signaler blev scoret af to uafhængige observatører. Scorerne blev beregnet som antallet af farvede celler divideret med det samlede antal af cancerceller. Fem repræsentative høj effekt felter (X400) pr dias blev beregnet, og resultaterne blev i gennemsnit. Utvetydig farvning af kernen i 25% af kræftceller blev anset høj ekspression

CCK8 assay og cellevækst kurve

celledeling blev bestemt ved Cell Counting Kit-8-farvning (Dojinodo. , Shanghai, Kina) ifølge producentens instruktioner. Celler blev podet på plader med 96 brønde ved initial densitet på 5 × 10

3 celler /brønd. På hvert tidspunkt blev cellerne farvet med 10 pi CCK8 farvestof i 90 pi kulturmedium i 2 timer ved 37 ° C. Absorbansen blev målt ved 450 nm, med 650 nm som referencebølgelængde. Resultaterne bekræftes af manuelle celletal. Celler blev podet på 24-brønds plader med initial densitet på 5 × 10

3 celler /brønd og opsamlet på forskellige tidspunkter og talt under anvendelse af en hematocytometer. Alle eksperimenter blev udført i triplikater.

Kolonidannelse assay

Celler blev trypsinbehandlet og udpladet i 6-brønds plader (300-500 celler /brønd) og dyrket i 3 uger. Kolonierne blev farvet med Giemsa farve i 30 minutter efter fiksering med 4% paraformaldehyd i 15 minutter. blev udført tre uafhængige forsøg.

Cell cyklus analyse

fordeling Cell cyklus blev undersøgt ved flowcytometri. 1×10

6 celler blev opsamlet og fikseret med 70% kold ethanol. Efter fiksering blev PI-farvning løsning med RNase A (BD Biosciences) tilsat. Efter 30 minutters inkubation, blev farvet prøver kørt på FACScan cytometri (BD Biosciences), og data blev analyseret under anvendelse FlowJo software (Tree stjerne).

tumorigenese i nøgne mus Salg

Dyreforsøg var godkendt af etiske komitéer i Beijing Cancer Hospital, Kina, og udføres i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Musene blev opretholdt under pleje af Laboratoriet Animal Enhed for Beijing Cancer Hospital, Kina. Stabile shRNA transficerede celler (1 x 10

6) i 100 pi serumfrit DMEM /RPMI 1640 blev injiceret s.c. i den højre flanke af 4 til 6 uger gamle BALB /c athymiske nøgne mus. Alle mus blev huset og holdt under specifikke patogenfrie betingelser. Xenotransplantattumorer blev genereret og musene blev aflivet ved cervikal dislokation inden for 4 uger. Tumorer blev udskåret, målt med en skydelære og vægtet med en elektronisk analysevægt. Tumorvolumener blev beregnet ved hjælp af følgende formel:. Tumor volumen = [(længde) × (bredde) × (bredde)] /2. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle standard retningslinjer for Peking University School of Oncology for dyreforsøg

statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 19.0 statistisk programpakke. Alle in vitro-eksperimenter blev udført mindst tre gange in triplo. Sammenligninger mellem grupper for statistisk signifikans blev udført med en 2-halet uparret Students t-test. Barer og fejllinjer på grafer samt data i teksten repræsenterer middelværdien ± SD. Sammenligninger mellem cancer og parrede normale væv blev testet under anvendelse Wilcoxon signed rank test. Forholdet mellem HOXB7 udtryk og clinicopathologic egenskaber blev testet ved hjælp af Chi-square test. Overlevelseskurver blev afbildet af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved hjælp af log rank test. Cox proportional hazard model med en trinvis procedure blev anvendt for multivariat analyse. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Udtrykket af HOXB7 blev opreguleret i ESCC sammenlignet med parrede noncancerous væv

Vi havde tidligere rapporteret 8 af 39 HOX gener, herunder HOXB7 , unormalt udtrykt i ESCC væv, men ikke i noncancerous væv under anvendelse af revers transkription-PCR [9]. For yderligere at belyse udtryk for HOXB7 protein i ESCC blev immunhistokemisk (IHC) plet udført i tumorer og parret noncancerous væv fra ESCC patienter. Det blev bemærket, at HOXB7 protein hovedsageligt blev lokaliseret i kernen af ​​de normale esophageal epitelceller i de basale og suprabasallagene, mens der i de tumorer, HOXB7-positive celler distribueres bredt. Sammenlignende analyse viste, at HOXB7 var signifikant opreguleret i 23 undersøgte tumor prøver (18/23) sammenlignet med tilstødende noncancerous væv (9/23) (Fig 1A, P = 0,039).

(A) repræsentativt udsnit af parret normale væv (a, b) og ESCC (c, d). I den normale esophageal epitel, HOXB7 udtryk var primært begrænset til kernen af ​​de epitelceller placeret i de basale og suprabasallagene, mens det i ESCC blev HOXB7-positive celler i store træk observeret i tumor (Sag nr. 53865). (B) Figur a og b, negativ kontrol, med primært antistof erstattet af PBS (sag nr. 40146). Figur c og d, lav udtryk for HOXB7 i ESCC (sag nr. 42.873). Figur e og f, høj ekspression af HOXB7 i ESCC (sag nr. 36840). (C) Kaplan-Meier overlevelse kurven for 177 patienter i kohorten I. Den mediane overlevelse var 45 måneder for høje udtryk patienter, hvilket var betydeligt kortere end de 137 måneder for lavt udtryk patienter (p = 0,007). (D) Kaplan-Meier overlevelse kurve for 103 patienter i kohorten II. Den mediane overlevelse var 19 måneder for høj udtryk patienter, som var betydeligt kortere end de 34 måneder for lav udtryk patienter (p = 0,001).

HOXB7 proteinekspression var forbundet med kliniske karakteristika og samlet overlevelse

i kohorte i blev høj ekspression af HOXB7 protein observeret i 124 af 177 (70,1%) tumor prøver (figur 1B). Chi-square test viste, at ekspressionsniveauerne af HOXB7 protein signifikant korreleret med TNM fase (P = 0,034), T etape (P = 0,036) og lymfeknudemetastaser (tabel 1, P = 0,042). Univariate analyse viste, at patienter, som havde lav HOXB7 ekspressionsniveauer levede meget længere (fig 1C, P = 0,007). Den mediane overlevelsestid var 45 måneder for patienter med høj ekspression, som var væsentligt kortere end de 137 måneder for patienter med lav ekspression (tabel 2). Multivariat overlevelse analyse bekræftede, at HOXB7 udtryk og TNM stadie var to uafhængige prognostiske faktorer for samlet overlevelse hos patienter med ESCC (tabel 3, HR [95% CI] = 0,573 [0,341-0,963], p = 0,036 for HOXB7 lav udtryk).

i kohorte II, blev høj ekspression af HOXB7 protein påvist i 61 af 103 (59,2%) tilfælde af tumor vævsprøver (figur 1B). Chi-square test viste, at ekspressionsniveauerne af HOXB7 protein signifikant korreleret med TNM fase (P = 0,001), T etape (P = 0,000) og lymfeknudemetastaser (tabel 1, P = 0,006). Univariate analyse under anvendelse af log rank test viste, at patienter med lav HOXB7 ekspressionsniveauer havde en længere gennemsnitlig overlevelsestid end med høj HOXB7 ekspression (34 mons vs. 19 mons, P = 0,001) (Fig 1D, tabel 2). Multivariat overlevelse analyse viste, at HOXB7 ekspressionsniveauet og TNM stadie var to uafhængige prognostiske faktorer for samlet overlevelse hos patienter med ESCC (tabel 3, HR [95% CI] = 0,543 [0,350-0,844], p = 0,024 for HOXB7 lav udtryk) .

Nedregulering af HOXB7 protein faldt celledeling in vitro

for at vurdere mulige rolle HOXB7 i udbredelsen af ​​humane ESCC celler, for det første opdaget vi udtryk for HOXB7 i flere ESCC celle linjer. Real-time PCR og western blotting-analyse viste, at EC109 og KYSE150 udviste relativ høj endogen ekspression af HOXB7. Derfor valgte vi EC109 og KYSE150 cellelinier til undersøgelse og slået ned HOXB7 udtryk ved hjælp af RNA-interferens. Af de fire lentivirus med kort hårnål RNA, blev den bedste udvalgt til at etablerede celle stamme med stabil knockdown af HOXB7 protein. I mellemtiden blev en lentivirus med scramble shRNA anvendt som en kontrol. Endelig blev EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 og KYSE150 /Scramble, KYSE150 /shHOXB7 etableret. Effekten af ​​knockdown blev undersøgt ved real-time PCR og Western blotting. HOXB7 mRNA og protein-ekspression blev reelt reduceret med 80% til 85% i EC109 og KYSE150 cellelinjer (Fig 2A). CCK8 assay viste, at HOXB7 knockdown reducerede proliferation af EC109 og KYSE150 sammenlignet med kontrolcellerne (figur 2B; P 0,05). Manuelle celletal på celler bekræftede fald i proliferation ses i CCK8 assay. (Fig 2C; P 0,05). Kolonidannelse assay viste, at EC109 /shHOXB7 og KYSE150 /shHOXB7 celler dannet langt mindre og mindre kolonier end kontrol-celler (Fig 2D; P 0,05).

(A) Knockdown af endogen HOXB7 i specifikke shRNA -transduced stabil EC109 og KYSE150 celler, analyseres ved real time PCR og western blotting. (B) Knockdown af HOXB7 inhiberer cellevækst som bestemt ved CCK8 assay. (C) Knockdown af HOXB7 hæmmer cellevækst som bekræftet ved manuel celletælling. (D) Knockdown af HOXB7 inhiberer cellevækst som det fremgår af kolonidannelse assayet. Fejl- søjler repræsenterer middelværdi ± SD fra 3 uafhængige eksperimenter. *, P. 0,05

Nedregulering af HOXB7 protein faldt tumorvækst in vivo

For at bekræfte effekten af ​​HOXB7 på tumorigen aktivitet ESCC celler in vivo, vi udførte tumorigenese analyser i nøgne mus. Cell stammer med EC109 /Scramble, EC109 /shHOXB7 og KYSE150 /Scramble, KYSE150 /shHOXB7 celler blev injiceret i nøgne mus. De xenotransplantattumorer blev fjernet 4 uger efter injektion og blev målt og vejet. Som vist i fig 3A og 3B, dannet ved den EC109 /shHOXB7 og KYSE150 /shHOXB7 celler tumorer var signifikant mindre end dem, kontrol- celler dannede tumorer. Den gennemsnitlige vægt og volumen af ​​tumorer i EC109 /shHOXB7 gruppen var 869 ± 295 mg og 870 ± 370 mm

3, sammenlignet med 1292 ± 453 mg og 1416 ± 472 mm

3 i EC109 /Scramble gruppe (P 0,05). Den gennemsnitlige vægt og volumen af ​​tumorer i KYSE150 /shHOXB7 gruppen var 415 ± 254 mg og 603 ± 362 mm

3, sammenlignet med 697 ± 253 mg og 1069 ± 377 mm

3 i KYSE150 /Scramble gruppe (P 0,05).

(A) Tumorer genereres ved injektion af EC109 /KYSE150 med stabile knockdown HOXB7 protein og kontrol celler. (B) Den vægt og volumen af ​​tumorer fra HOXB7-knockdown celler var relativt lavere end fra kontrol celler. (C) Repræsentative histogrammer analyseret ved flowcytometri viste cellecyklus profiler af ESCC celler. I cellerne med stabil knockdown HOXB7 protein, faldt celleantallet i S og G2 faserne sammenlignet med kontrolceller. (D) andelen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklussen. Fejl- søjler repræsenterer middelværdi ± SD fra 3 uafhængige eksperimenter. *, P. 0,05

HOXB7 accelereret cellecyklusprogression

For at undersøge mulig mekanisme af HOXB7 at fremme ESCC celleproliferation, testede vi cellecyklusfordeling ved flowcytometri. Som vist i fig 3C, knockdown af HOXB7 protein resulterede i G1 arrest, med en stigning i G1 andel og et fald i S og G2 andel. Procentdelen af ​​celler i S og G2 faserne i EC109 /shHOXB7 gruppe var 30,18% ± 1,16% og 9,51% ± 0,23% henholdsvis, hvilket var lavere end i kontrolceller (31,75% ± 0,55% og 14,36% ± 0,94%, Fig 3D, P 0,05). Den gennemsnitlige procentdel af celler i S og G2 faser i KYSE150 /shHOXB7 gruppen var 37,31% ± 1,09% og 28,70% ± 1,22% sammenlignet med 41,00% ± 1,32% og 30,92% ± 2,21% i KYSE150 /Scramble gruppe (Fig 3D, P 0,05). Disse resultater viste, at HOXB7 kunne accelerere G1 til S-faseovergangen i ESCC cellelinjer, som bidrager til ESCC celleproliferation.

Diskussion

Ideel tumor biomarkører har god prognostisk værdi og kan guide den kliniske praksis, og derfor har søgningen efter en værdifuld prognostisk biomarkør vundet primære fokus i onkologi forskning. Blandt disse har abnorm ekspression af embryogenese-relaterede gener i malignitet altid fået betydelig opmærksomhed [10]. For eksempel er forholdet mellem carcinoembryonisk antigen (CEA) og kolorektal cancer, og at mellem alpha-fetoprotein (AFP) og leverkræft, som er blevet anvendt med succes i kliniske omgivelser. Men indtil nu, gode tumormarkører for ESCC er ikke blevet identificeret til anvendelse i klinisk praksis. Vores tidligere undersøgelser har afsløret abnorm ekspression af 39 medlemmer af HOX-gener på mRNA-niveauet i malignt esophagus væv. Blandt dem, blev otte kun udtrykkes i det maligne væv fra ESCC patienter, men ikke i de parrede tilgrænsende normale væv, herunder HOXB7 [9]. Andre undersøgelse viste også, at HOXB7 ikke udtrykkes i normal esophagus, men udtrykkes ved højere niveauer på mRNA niveau i ESCC [11]. Nærværende undersøgelse bekræftede disse foreløbige resultater. Det blev vist, at ekspressionen af ​​HOXB7 var signifikant højere i 23 prøver af malignt esophageal væv end i den parrede tilstødende normale slimhinde, som tilbyder en god basis for at overveje HOXB7 som en potentiel molekylær markør for ESCC. Siden januar 2000 har vi været oprettelse af et fælles-kirurg (Dr. Chen) potentielle kræft i spiserøret database og konsekutivt rekrutteret 1.249 patienter med kræft i spiserøret, der gennemgik kirurgisk resektion. Opfølgende besøg var planlagt for alle patienter, der indgår i databasen til deres død. HOXB7 udtryk i de udtrukne 177 sager, der opfyldte kriterierne blev undersøgt, og dets forhold til prognosen blev analyseret. Resultaterne viste, at HOXB7 ekspression var positivt korreleret med TNM fase (P = 0,034), T etape (P = 0,036), lymfeknudemetastase (P = 0,042). Den mediane overlevelsestid for patienter med høj HOXB7 ekspression var signifikant kortere end for patienter med lav HOXB7 ekspression (45 måneder vs. 137 måneder, p = 0,007). For yderligere at bekræfte dette resultat, vi foretaget en retrospektiv undersøgelse på en anden tidligere kohorte af patienter uden prospektive data. En lignende tendens blev bemærket i vores resultater: HOXB7 udtryk i denne kohorte viste også en positiv korrelation med TNM stadie (P = 0,001), T fase (P = 0,000) og lymfeknude metastaser (P = 0,006). Den mediane overlevelsestid for patienter med høj HOXB7 ekspression var signifikant kortere end for patienter med lav HOXB7 ekspression (19 måneder vs. 34 måneder, p = 0,001). Desuden multivariat analyse med variabler, herunder alder, køn, tumor placering, TNM stadie, T scenen, N scenen, og HOXB7 udtryk viste, at HOXB7 udtryk og TNM stadie var uafhængige prognostiske faktorer i 177 patienter rekrutteret i den kommende database (HR [95% CI] = 0,573, [0.341-0.963], p = 0,036) og 103 patienter rekrutteret i en anden kohorte uden prospektive data (HR [95% CI] = 0,543 [0,350-0,844], p = 0,024), hvilket indikerer, at HOXB7 havde prognostiske værdi for patienter med ESCC.

for yderligere at udforske den funktionelle mekanisme HOXB7 i forekomsten og udviklingen af ​​ESCC, vi undersøgte HOXB7 udtryk i flere ESCC cellelinjer og som skal udvælges to cellelinjer, der viser høj ekspression af HOXB7 (EC109 og KYSE150) for in vitro og in vivo undersøgelser.

først RNA-interferens teknik blev anvendt til at etablere stabile HOXB7-knockdown cellestammer, som derefter blev anvendt til at udføre CCK8 assay kolonidannende rate assay og cellecyklus analyse ved flowcytometri at observere effekten af ​​HOXB7 på celleproliferation i ESCC. Vores resultater viste, at hastigheden af ​​celleproliferation var langsommere i HOXB7-knockdown cellestammer, kolonidannelse blev reduceret, G1-fasen anholdelse fandt sted i de maligne celler, og andelen af ​​celler i G1 faser steget markant. For yderligere at verificere virkningen af ​​HOXB7 på in vivo-celleproliferation, vi brugte Knockdown cellestammer at etablere tumorgenicitet i en nøgen mus model og fandt, at tumorigen kapacitet Knockdown cellestammer var signifikant lavere end for kontrol celler.

faktisk har den dysregulering af HOXB7 ekspression blevet rapporteret i en række tumorer, herunder brystcancer [12-14], ovariecancer [15], oral cancer [16], colorectal cancer [17], lungecancer [18] , melanom [19-21] og pancreascancer [22-24]. Overekspressionen af ​​HOXB7 var viste at være relateret til dårlig prognose ved brystcancer [14], oral cancer [16], colorectal cancer [17], lungecancer [18] og pancreas adenocarcinom [22, 23]. Men den kliniske betydning af HOXB7 i ESCC er sjældent rapporteret. Der var to artikler udforsker prognostisk betydning af HOXB7 udtryk på mRNA og protein niveau i ESCC nylig, men prøvestørrelserne var meget begrænset, og de bekræftede ikke deres resultater i en uafhængig kohorte [25, 26]. I forhold til disse undersøgelser, vi ikke kun bekræftet pålideligheden af ​​vores resultater i to uafhængige kohorter, herunder 280 tilfælde, men også undersøges nærmere at undersøge mulighederne for funktion af HOXB7 i ESCC. Det har vist sig, at HOXB7 kunne fremme tumorcelleproliferation i andre faste tumorer [13-19, 27]. Men indtil nu var der ingen undersøgelser, som mulige rolle HOXB7 og dets underliggende mekanismer i ESCC. Baseret på de ovenfor diskuterede foreløbige resultater, mener vi, at HOXB7 sandsynligvis vil blive identificeret som en prognostisk biomarkør for ESCC patienter, og unormal HOXB7 udtryk kan påvirke den proliferative kapacitet af celler.

I mellemtiden har vi noteret en positiv korrelation mellem højere HOXB7 proteinekspression og regional lymfeknude metastaser. Så vi gennemførte Transwell migration assay og Matrigel invasion assay, der indikerede, at HOXB7 knockdown hæmmede celle migration og invasion evne EC109 og KYSE150 (S1 Fig; P 0,05). Men funktionen af ​​HOXB7 i celle invasion og metastase i ESCC stadig brug for yderligere udforskning.

De mekanismer, der ligger bag rolle HOXB7 i ESCC er uklar. Udforskningen af ​​mekanismen kompliceres af sekvensen ligheden blandt HOX gener og funktionel redundans indregnet i HOX gen-systemet [7]. Som en transkriptionel faktor, HOXB7 medierer sine virkninger ved at regulere transkriptionen af ​​målgener. Selv om mange gener er blevet vist at være direkte eller indirekte reguleret af HOXB7 i andre cancerceller, har kun nogle få af dem er blevet identificeret som direkte mål, herunder bFGF [13, 22, 28]. HOXB7 kunne direkte aktivere ekspressionen af ​​basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og fremme væksten af ​​forskellige tumorer, såsom brystcancer og melanom [13, 19, 29]. Og bFGF havde været impliceret i forskellige biologiske processer, såsom proliferation, differentiering, overlevelse og migration [30]. HOXB7 udtryk kunne fremme cellevækst ved at udløse både intracrine og autocrine bFGF vækststimulerende veje i ovariecarcinomer [15]. Udtrykket af bFGF kunne aktivere Ras-RAF-MAPK vej gennem autokrine signalering kaskader i brystkræft [12]. Det blev vist, at PI3K /AKT og MAPK pathways blev aktiveret ved HOXB7 i colorektal cancer, hvilket kan forklare den accelererende G1-S overgangen induceret af HOXB7 [17]. Afslutningsvis disse resultater styrket vores resultater og tydeliggjort vigtigheden af ​​HOXB7 i tumorigenese. Yderligere undersøgelser for at identificere mekanismer om HOXB7 opstrøms aktivatorer, downstream mål og funktionelle partnere ville være umagen værd for bedre at forstå betydningen af ​​HOXB7 i ESCC

Denne undersøgelse har nogle begrænsninger:. De kliniske data blev indhentet fra den enkelt center, prøvens størrelse var ikke stor nok, og kliniske studier forskning var retrospektiv faktisk. Derfor, i fremtidige undersøgelser, stikprøvestørrelsen bør øges, og patienter fra flere center bør medtages for at afklare, om HOXB7 kan tjene som en specifik molekylær prognostisk markør i ESCC. Endvidere er en grundig undersøgelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund rolle HOXB7 at fremme udbredelsen af ​​ESCC celler berettiget.

Støtte Information

S1 Fig. HOXB7 fremmer human ESCC celle migration og invasion. Hotel (A) Knockdown af HOXB7 hæmmer cellemigration som bestemt ved Transwell migration assay. (B) Knockdown af HOXB7 inhiberer cellevækst som det fremgår af Matrigel invasion assay. Fejl- søjler repræsenterer middelværdi ± SD fra 3 uafhængige eksperimenter. *, P 0,05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0130551.s001

(TIF)

S1 File.