PLoS ONE: MIR-26a Fremmer kræft i æggestokkene spredning og tumorigenese

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) vigtigt for posttranskriptionel genekspression er involveret i initiering og progression af kræft hos mennesker. I denne undersøgelse, rapporterede vi, at

miR-26a

var overudtrykt i humane EOC prøver og ekspressionsniveauet af ekstracellulær

miR-26a

i plasma kan skelne patienter fra raske kontroller EOC. Ektopisk udtryk for

miR-26a

i kræft i æggestokkene (OC) celler øget celledeling og klonal formation. Denne vækstfremmende effekt af OC cellevæksten blev medieret af

MIR-26a

inhibering af posttranscription af ER-α. Endvidere inhibering af

MIR-26a

undertrykte tumordannelse genereret ved injektion af OC celler i nøgne mus. Vores resultater antyder, at udtrykkes afvigende

MIR-26a

kan bidrage til OC udvikling

Henvisning:. Shen W, Song M, Liu J, Qiu G, Li T, Hu Y, et al. (2014)

MIR-26a

Fremmer kræft i æggestokkene spredning og tumorigenese. PLoS ONE 9 (1): e86871. doi: 10,1371 /journal.pone.0086871

Redaktør: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Juni 17, 2013; Accepteret: 16. december 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev sponsoreret af tilskud fra projekt nr 30571836 fra NNSF (National Natural Science Foundation) i Kina. Hertil kommer, at arbejdet præsenteret en del af projekter med Project No.L2010681 økonomisk støttet af Science Foundation for Education Department of Liaoning-provinsen i Kina, og Project No.201202259 støttet af Science Foundation for Videnskab og Teknologi Bureau of Liaoning-provinsen i Kina . Forfatter Min Song bidrog til eksperimentel undfange og design, vejledning og diskussion af projektet, så hun er co-korrespondance forfatter dette papir. Alle de andre finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

OC er den femte mest almindelige kræftform hos kvinder, og den hyppigste årsag til kræftdødsfald fra gynækologisk malignitet i de vestlige lande [1]. I 2012 er der 22,280 nye tilfælde og 15.500 dødsfald fra OC i USA i henhold til de nationale statistikker kræft. EOC udgør 85% -90% af ovariecancer. Desværre er den samlede prognose er fattige og de molekylære begivenheder, der fører til udviklingen af ​​denne sygdom er stadig lidet kendte.

miRNA udgør en stor familie af endogene ikke-kodende RNA’er og posttranscriptionally regulere genekspression [2]. Nylige undersøgelser har afsløret kritiske funktioner af miRNA i væsentlige processer, herunder proliferation, differentiering og celledød [3]. Ændret ekspression eller mutation af miRNA er blevet rapporteret i cancer, såsom lungecancer, brystcancer, leukæmi og andre carcinomer [4]. I lunge kræftceller, overekspression af

Lad-7

hæmmet deres vækst ved at målrette Ras [5], [6]. Desuden

miR-21

direkte rettet mod tumor suppressor PTEN i leverkræft [7]. Desuden viste flere undersøgelser, at miRNA kan fungere enten som tumorsuppressorer (som det er tilfældet for

MIR-15a-MIR-16-1

klynge [8]) eller onkogener (som det er tilfældet for

miR-21

[

9

]).

genom-dækkende miRNA udtryk profilering viste

miR-26a

dysregulation i forskellige kræftformer [10]. I denne undersøgelse fandt vi, at

miR-26a

er overudtrykt i human EOC. Vi viser, at inhibering af

MIR-26a

nedsat proliferation af humane EOC celler, og undertrykt vækst af EOC-celler i nøgne mus. Desuden blev ERa nedreguleres af

MIR-26a

i EOC-celler. Desuden fandt vi, at ekstracellulære

miR-26a

niveauer i plasma kan skelne patienter fra raske kontroller i EOC. Vores undersøgelse tyder på, at afvigende ekspression af

miR-26a

er afgørende for udviklingen af ​​menneskelig EOC og måling af cirkulerende

miR-26a

kan være en god tilgang til EOC diagnose.

Materialer og metoder

patienter

Kliniske prøver (herunder vævs- og plasmaprøver) blev indsamlet fra patienter, der er registreret på The First Affiliated Hospital i Kina Medical University (Shenyang, Kina). Patienterne oplysninger er sammenfattet i tabel 1, tabel S1 og tabel S2.

Materialer

Antistof mod ERa var fra Santa Cruz (Santa Cruz, Californien, USA), antistof mod α tubulin fra Sigma (St Louis, MO, USA). Alle andre reagenser var fra Sigma. Anti-miR-26a og vrøvl af anti-miR var fra GenePharma (Shanghai, Folkerepublikken Kina). Cel-miR-39 efterligner var fra IBS (Shanghai, Folkerepublikken Kina).

kvantitativ RT-PCR

(QRT-PCR, Quantitative revers transkriptase-polymerasekædereaktion)

Total RNA isoleret fra kliniske prøver eller celler under anvendelse af Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev revers-transkriberet til cDNA ifølge den foregående rapport [11]. Isolering af RNA fra plasma og kvantificering af miRNA blev udført som beskrevet i [12]. Kort fortalt blev 25 fmol af Cel-MIR-39 efterligner tilsat til 400 ul plasma. Real-time PCR blev udført ved anvendelse af SYBR green PCR Master Mix (Takara, Otus, Shiga, Japan). Amplifikation og detektion blev udført under anvendelse ABI Prism 7700-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Cel-miR-39 blev taget som reference gen for plasmaprøver. Primere anvendte anført i tabel S3.

Cell Kultur

menneskelige OC cellelinjer, SKOV-3, ES2 (Cellbank, Shanghai, PR China) blev opretholdt i McCoys 5a suppleret med 10% (vol /vol) føtalt kalveserum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Disse celler blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2.

Vektorkonstruktion

Fuld-længde human

MIR-26a

blev amplificeret fra human genomisk DNA og klonet ind i pcDNA3.1 på Kpnl- og Xhol sites i henhold til den tidligere rapport [13] og [14]. Den humane vildtype ERa blev frembragt ved PCR fra cDNA og PCR-produkterne blev indsat i pcDNA3.1 som beskrevet i [15].

Cell Growth Assay

Cellevækst blev estimeret ved bestemmelse af celletallet og kolonidannelse. Cellerne blev transficeret med

MIR-26a

eller anti-miR-

26a

hjælp FuGene HD (Roche, Indianapolis, IN) ifølge producentens protokol. Efter dyrkning i 24 timer blev cellerne podet med en initial densitet på 1 x 10

5 pr 35 mm-skål. Cellerne blev derefter høstet på de angivne tidspunkter, og tallene blev talt under anvendelse af COULTERTM (Beckman, Fullerton, CA, USA).

Celler transficeret med

MIR-26a

blev podet i 96-brønds plader ved en koncentration på 2,5 x 10

3 celler, og måles efter 48 timer ved anvendelse af en WST-1 assay (Boster, Wuhan, PR China), udført ifølge producentens protokol.

i alt 500 celler transficeret med

miR-26a

eller tom vektor (Ctrl) blev udsået i 35 mm skåle hver for sig i tre eksemplarer. Tre uger senere blev kolonierne fikseret med 4% paraformaldehyd, gennemtrængt med 20% methanol og farvet med krystalviolet. De farvede celler blev elueret med 10% iseddikesyre og OD595-værdier blev målt ved spektrofotometer som indikator for celleantal.

Luciferase Reporter Assay

1,5 × 10

5 SKOV3 stabil celler i 35 mm skåle blev co-transficeret med pGL3-ERa-WT (1 ug) eller pGL3-ERa-Mut (1 ug) og pRL-TK (1 ug) ved anvendelse.

Fugene® HD transfektionsreagens (Roche, Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) ved at følge fabrikantens protokol. Otteogfyrre timer efter transfektion blev luciferaseaktivitet målt ved anvendelse af en dobbelt luciferase reporter assaysystem (Promega) og normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet.

Western Blotting

Proteiner blev separeret på SDS-8% PAGE, overført til PVDF-membraner (Amersham, Buckinghamshire, UK) og probet med primære antistoffer og sekundære antistoffer konjugeret med peberrodsperoxidase. Proteinbåndene blev visualiseret ved Amersham ECL-systemet og scannes. Deres tætheder blev bestemt ved ImageQuant 5.2 software (Amersham).

In vivo tumorigenese

SKOV3 celler transficeret med

miR-26a

eller anti-miR-

26a

separat. Hver nøgen mus blev injiceret subkutant med 2 x 10

6 transficerede SKOV3-celler. Tredive eller femogtredive dage efter injektion blev musene aflivet, og tumorerne blev udtaget. Den længste og korteste diameter af tumoren blev bemærket som d1 og d2. Tumorvolumenet blev beregnet ved anvendelse af ligningen: V = d1 × d2 × d2 /2. Tumor vægt blev derefter målt.

Statistik

Flere sammenligninger blev vurderet af SPSS statistisk software til statistisk analyse. Wilcoxon Test og Krusikal Wallis H Test blev brugt i statistisk analyse af patientprøver. Andre sammenligninger mellem grupper for statistisk signifikans blev udført med Students t-test og variansanalyse (ANOVA). Resultaterne blev betragtet signifikant forskel ved * P 0,05; ** P. 0,01

Etik Statement

Forskningen opfylder alle krav til etik eksperiment. Kliniske prøver blev indsamlet med samtykke fra patienterne og raske frivillige og godkendelse af Medical Research Ethics Committee for First Affiliated Hospital i Kina Medical University. Alle deltagere har givet deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse. Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Kina Medical University.

Resultater

Øget ekspression af miR-26a i Prøver og Plasma i Human EOC

det er blevet observeret, at ekspressionsniveauet af

mIR-26a

blev reduceret eller forøget i humane maligniteter, såsom brystcarcinom [16], nasopharyngeal carcinom [17], [18], og glioblastom [19] , hvilket indikerer en kompliceret rolle

miR-26a

i progression af maligne sygdomme. For at undersøge den mulige rolle af

miR-26a

i EOC udvikling, vi først undersøgte udtryk for

miR-26a

i prøver og plasma i EOC ved SYBR-Green hårnåle-QRT-PCR [20]. Vi undersøgte udtryk for

miR-26a

i 26 tumorprøver og 19 normale æggestokke. Som vist i figur 1A, ekspressionsniveauerne af

MIR-26a

i tumorprøver var meget højere end i normalt ovarie prøver. Tilsvarende koncentrationerne af

MIR-26a

var højere i plasma fra EOC patienter (n = 17) end i den, fra raske kontroller (n = 13) (figur 1B). Tilsammen udgør disse resultater giver os indledende beviser for, at

miR-26a

kan spille en rolle i udviklingen af ​​den menneskelige EOC.

(A) Kvantitativ analyse af ekspressionsniveauerne af

miR- 26a

i EOC prøver normaliseret til dem af 18s rRNA ved QRT-PCR. Data for hver prik var middelværdi på en prøve gentages i tre uafhængige forsøg (normal, n = 19; tumor, n = 26). ** P 0,01 vs Normal. (B) Kvantitativ analyse af ekspressionsniveauerne af plasma

MIR-26a

efter QRT-PCR. Data for hver prik var middelværdi på en prøve gentages i tre uafhængige forsøg (normal, n = 13; tumor, n = 17).

Over-udtrykkende miR-26a Fremmes EOC cellevækst og hæmmende miR-26a Undertrykt EOC Cell Proliferation

Vi næste undersøgt, om

miR-26a

påvirker EOC cellevækst ved hjælp SKOV3 og ES2 celler som modeller. Som vist i figur 2A, blev væksten evne SKOV3 og ES2 celler steget med overekspression af

miR-26a

. Tværtimod blev proliferationen af ​​celler transficeret med anti-MIR-26a markant nedsat sammenlignet med cellerne transficeret med nonsens (figur 2B). WST-1 assay viste lignende resultater i celleproliferation (figur 2C). Disse resultater antyder, at

MIR-26a

faktisk påvirket EOC cellevækst.

Vækstkurver for SKOV3 (A) eller ES2 (B) celler transficeret med

MIR-26a

( venstre panel) eller anti-mIR-26a (højre panel). Celleantal blev normaliseret til dem i 0 timer. Data var gennemsnit ± S.E. af tre uafhængige forsøg i triplikat. * P 0,05, ** p 0,01 vs tom vektor (Ctrl) eller negativ kontrol (NC). (C) Celleproliferation transficeret med

MIR-26a

blev målt ved en WST-1 assay. Data var gennemsnit ± S.E. af tre uafhængige forsøg i triplikat. ** P 0,01 vs tom vektor (Ctrl) (D) Kvantificering af kolonierne dannet af Ctrl eller

miR-26a

transfekterede celler. Data var gennemsnit ± S.E. af tre uafhængige forsøg. ** P. 0,01 vs Ctrl

Begrebet blev yderligere testet i klonal dannelse analysen. Antallet og størrelsen af ​​de dannede kolonier blev markant forøget i

MIR-26a Salg transficerede celler (figur 2D). Sammen disse resultater tyder på, at

miR-26a

var faktisk involveret i reguleringen af ​​EOC cellevækst.

ERa var en Target Gene af miR-26a i EOC Celler

Vi undersøgte derefter de mekanismer, som

miR-26a

fremme EOC celleproliferation. Hos patienter med hepatocellulært carcinom, udtryk for

miR-26a

var højere hos kvinder end hos mænd [21]. Desuden

miR-26a

reguleret liver tumorcellevækst ved at målrette ERa [22]. Som vist i figur 3A, luciferaseaktiviteten af ​​pGL3-ERa-WT i SKOV3-stable1 celler (S1) var meget lavere end i kontrolceller. Luciferaseaktiviteten af ​​pGL3-ERa-Mut blev reddet i Stable1 celler. Vi næste undersøgt, om

miR-26a

kunne regulere endogen ERa udtryk i EOC-celler. Sammenlignet med kontrol, endogene ERa mRNA-niveauer (figur 3B) og protein niveauer (Figur 3C) var nedreguleret, når celler blev transficeret med

miR-26a

.

(A) Stabil 1 celler (S1) blev transficeret med pGL3-ERa-WT (WT) reporter vektor eller pGL3-ERa-Mut (MUT). Data var gennemsnit ± S.E. af tre uafhængige forsøg. ** P 0,01 vs kontrol celler (Ctrl). (B) Kvantitativ analyse af ekspressionsniveauerne af ERa i Stable1 (S1), Stable2 (S2) og kontrol (CTRL) celler blev bestemt og normaliseret til GAPDH mRNA-niveauer. * P 0,05, ** P 0,01 vs Ctrl. (C) Western-blot-analyse af totale cellelysater ekstraheret fra angivne stabile celler ved anvendelse de angivne antistoffer. Data, var repræsentativ for tre uafhængige forsøg og kvantificering normaliseret med Ctrl. Tubulin tjente som en belastning kontrol. (D) De vækstkurver S1, S2 og Ctrl celler. Data var gennemsnit ± S.E. af tre uafhængige forsøg i triplikat. * P 0,05, ** P 0,01 vs Ctrl. (E) Over-ekspression af ERa faldt væksten af ​​S1-celler efter transfektion. Cell-numre blev normaliseret til Ctrl celler. Data var gennemsnit ± S.E. af tre uafhængige forsøg i tre eksemplarer.

MIR-26a Kontrolleret spredning af EOC celler gennem ERa

I betragtning af, at

miR-26a

var involveret i proliferation af EOC-celler og ERa var et mål på

miR-26a

, vi næste testede, om overekspression af ERa kunne redde fremme af spredning af

miR-26a

i EOC-celler. Endvidere stabil ekspression af

MIR-26a

i to SKOV3 cellekloner (S1 eller S2) øgede væksten af ​​cellerne ca. 1,58 eller 1,37 gange, respektivt (figur 3D). QRT-PCR-analyse viste, at

MIR-26a

ekspressionsniveauet blev stærkt forøget i S1 og S2-celler (Figur S1). Som vist i figur 3E, mens væksten af ​​S1-celler transficeret med ERa, var ikke forskellig fra den af ​​kontrolceller. Disse resultater viser, at

miR-26a

kontrolleret spredning af EOC celler gennem regulering af ERa udtryk.

MIR-26a fremmet udviklingen af ​​Tumor i nøgne mus

For at yde direkte bevis for, at

mIR-26a

var ansvarlig for EOC udvikling, SKOV3-celler transficeret med enten

mIR-26a

eller anti-mIR-26a blev injiceret i flanken af ​​nøgne mus som beskrevet. En uge efter implantering kan xenotransplanterede tumorer ses. Efter tredive eller femogtredive dage blev alle nøgne mus aflivet, og tumorerne blev udtaget og vejet. På makroskopisk observation, blev forskellene i tumorstørrelse og volumen blandt de to angivne grupper. Tumoren volumen genereret fra tom vektor var 0,435 ± 0,042 (cm

3, P 0,01), at der i

miR-26a

gruppe var 0,829 ± 0,172 (cm

3, P 0,01) (figur 4A), som i negativ kontrolgruppe var 0,941 ± 0,163 (cm

3, P 0,01), og at der i anti-mIR-26a var 0,248 ± 0,05 (cm

3, P 0,01) ( Figur 4B). Den gennemsnitlige vægt af tumoren genereret fra tom vektor var 0,433 ± 0,07, mens den gennemsnitlige vægt af tumoren genereret fra

miR-26a

var 0,821 ± 0,02 (gram, P 0,01). Den gennemsnitlige vægt af tumoren genereret fra nonsens var 1,062 ± 0,169, mens den gennemsnitlige vægt af tumoren genereret fra anti-miR-26a var 0,473 ± 0,05 (gram, P 0,01), hhv. De ovennævnte resultater antyder, at

MIR-26a

var kritisk for udviklingen af ​​EOC

in vivo

.

Tumordannelse genereres af SKOV3-celler. (A) transficeret med

MIR-26a

eller anti-MIR-26a (B) Nøgne mus blev injiceret subkutant med 2 x 10

6 transficerede celler. Repræsentative billeder, måling af det endelige volumen og vægt af tumorerne dannede. Tumorstørrelserne blev målt og beregnet i Materialer og metoder. Data var gennemsnit ± standardafvigelse. af 4-6 mus. ** P. 0,01 vs tom vektor eller nonsens

Diskussion

I denne undersøgelse har vi vist, at ekspressionsniveauet af

miR-26a

blev stærkt forøget i humane EOC prøver og blod-baserede

miR-26a

niveau kan skelne patienter fra raske kontrolpersoner i EOC. Vores resultater viste også, at ekspressionsniveauet af

miR-26a

påvirket EOC cellevækst i kulturen. Desuden ERa var et mål for

miR-26a

i EOC-celler. Endvidere ekspressionsniveauet af

MIR-26a

påvirket tumordannelse i nøgne mus. Derfor er vores resultater er i overensstemmelse med en idé, som

miR-26a

er afgørende for udviklingen af ​​den menneskelige EOC.

MikroRNA’er er kendt for at regulere ekspressionen af ​​gener involveret i flere biologiske processer såsom udvikling, proliferation, apoptose og stressrespons [23]. Nylige undersøgelser viste en direkte forbindelse mellem miRNA og menneskelige kræftformer [4], [24], [25], [26]. MiRNA kan være onkogene miRNA (oncomirs) eller tumor-suppressor relevant for cancer. Som tidligere vist, tab af onkogen

miR-21

, handler for at undertrykke RHOB udtryk, er forbundet med en højde på RHOB i levercellecancer og bryst kræftceller [13]. Betydningen af ​​andre miRNA, såsom

Lad-7

,

miR-16

,

miR-126

og

miR-125b

har også været demonstreret [27]. Nylige microarray profil data viser

miR-26a

dysregulation i forskellige kræft [4]. I leverkræft,

MIR-26a

beskytter normalt levervæv fra hepatocellulært carcinom-fremmende inflammation [21], og synes at antagonisere human brystcancer [16] og rhabdomyosarkom [28]. Tværtimod

MIR-26a

letter glioblastoma dannelse som et onkogen [19]. Vores resultater opnået fra gain-of-funktion og tab af funktion tilgange tilkendegivet, at

miR-26a

fremmet proliferation og hæmning af

miR-26a

undertrykte EOC celleproliferation.

I kræft i æggestokkene, ERa udtryk er blevet undersøgt for at korrelere til chlinico-patologiske parametre og prognose [29], [30]. Tidligere undersøgelse viste, at det ikke afslørede korrelationer med histologisk type tumorer og kræft i æggestokkene grading [30]. Univariate overlevelse analyse afslørede, at patienter med positiv-ERa status havde en signifikant bedre progressionsfri overlevelse sammenlignet med patienter uden ekspression [31]. I vores resultater, udtryk for

miR-26a

med eksemplarer og plasma i EOC var meget højere end i normale ovarie prøver, og

miR-26a

fremme EOC celledeling ved at målrette ERa. Det betyder, at

miR-26a

kan være en vigtig faktor i overlevelse for kræft i æggestokkene.

Cirkulerende biomarkører anvendes til diagnostisk sygdom, overvåge terapeutisk effekt og forudsige tilbagefald i kliniske anvendelser. Opdagelsen af ​​cirkulerende miRNA hos kræftpatienter angiver deres potentielle anvendelse som kraftige biomarkører i kræftdiagnostik [32]. Nylige undersøgelser viste, at kræftrelaterede miRNA stabilt detekteres i plasma og serum kunne der stammer fra cancervæv [4], [33]. Vores resultater undersøge muligheden for

miR-26a

anvendes som biomarkør i kliniske omgivelser ved at undersøge ekspression af

miR-26a

i plasma af EOC patienter.

Som konklusion inhibering af

mIR-26a

faldt EOC cellevækst i kultur og i nøgne mus.

MIR-26a

påvirket proliferation af EOC-celler ved at målrette ERa. En vigtig implikation af aktuelle undersøgelse er, at

miR-26a

kan være et potentielt mål for terapeutisk intervention for menneskers EOC.

Støtte oplysninger

figur S1.

MIR-26a

ekspressionsniveauet blev stærkt forøget i S1 og S2 celler. QRT-PCR bestemmes ekspressionsniveauerne for

MIR-26a

i S1 og S2-celler. Data blev middelværdi ± S.E. af tre uafhængige forsøg i triplikat. . ** P 0,01 vs Ctrl

doi: 10,1371 /journal.pone.0086871.s001

(DOC)

tabel S1. Salg clinicopathologic data og

miR-26a

udtryk kontrolniveau

doi:. 10,1371 /journal.pone.0086871.s002

(DOC)

tabel S2. Salg clinicopathologic data og

miR-26a

udtryk niveau af æggestokkene kræftpatienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0086871.s003

(DOC)

tabel S3.

Primere anvendt i kvantitativ RT-PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0086871.s004

(DOC)