PLoS ONE: MicroRNA Kontrolleret Adenovirus medierer Anti-Cancer Effekt uden at påvirke Endogen MicroRNA Activity

Abstrakt

MikroRNA’er er små ikke-kodende RNA-molekyler, der regulerer mRNA oversættelse og stabilitet ved at binde til komplementære sekvenser normalt inden for 3 ‘un-oversat region (UTR). Vi har tidligere vist, at levertoksicitet forårsaget af vildtype adenovirus 5 (Ad5WT) hos mus kan forhindres ved at inkorporere 4 bindingssteder for leveren-specifikke microRNA, mir122, ind i 3’UTR af E1A-mRNA. Denne virus, betegnet Ad5mir122, er en lovende virotherapy kandidat og forårsager ingen indlysende leverpatologi. Heri viser vi, at Ad5mir122 opretholder vildtype lytisk aktivitet i kræftcellerne ikke udtrykke mir122 og vurdere eventuelle virkninger af mulige mir122 udtømning i værtsceller. Gentag administration på 2 × 10

10 virale partikler af Admir122 til HepG2 tumor bærende mus viste signifikant anti-cancer effekt. RT-QPCR viste, at E1A-mRNA blev nedreguleret 29 gange i leveren sammenlignet med Ad5WT. Western blot for E1A bekræftet, at alle protein varianter blev slået ned. RT-QPCR til moden mir122 i inficerede lever viste, at mængden af ​​mir122 forblev upåvirket. Genom bred mRNA microarray profilering af inficerede lever viste, at selv om udskrift niveau 3900 forskellige mRNA ændret mere end 2 gange efter Ad5WT infektion, mindre end 600 blev ændret ved Ad5mir122. Disse blev derefter filtreret for at vælge mRNA’er, der kun blev ændret ved Ad5mir122 og de resterende 21 mRNA’er blev sammenlignet med forudsagte mir122 mål. Ingen mir122 target mRNA blev ramt af Ad5 mir122. Disse resultater viser, at udnyttelsen af ​​microRNA regulering for at kontrollere virusreplikation ikke nødvendigvis påvirke niveauet af microRNA eller de endogene mRNA mål

Henvisning:. Cawood R, Wong SL, Di Y, Baban DF, Seymour LW (2011) MicroRNA Kontrolleret Adenovirus medierer Anti-Cancer Effekt uden at påvirke Endogen MicroRNA aktivitet. PLoS ONE 6 (1): e16152. doi: 10,1371 /journal.pone.0016152

Redaktør: Sebastien Pfeffer, IBMC-CNRS, Frankrig

Modtaget: August 13, 2010; Accepteret: December 13, 2010; Udgivet: 10. januar, 2011

Copyright: © 2011 Cawood et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. RC og YD understøttes af Cancer Research UK (https://www.cancer.org.uk/), SLW er finansieret af et forskningsprojekt studentship fra Medical Research Council (www.mrc.ac.uk). Den microarray core anlægget er finansieret af Wellcome Trust. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Genetisk regulering af virusreplikation og udtryk er et kraftfuldt strategi for udviklingen af ​​sikrere virale lægemidler til vaccination, genterapi og virotherapy. DNA-vira er ofte lavet væv eller cancer selektiv ved udskiftningen af ​​stærke virale promotorer med svagere humane endogene promotorer. I modsætning hertil har mekanismer til kontrol af RNA-virus-replikation primært er rettet mod ingeniør eller udnytte interferon følsomhed [1], [2] eller ved anvendelse af svækkede vaccinestammer [3]. Ingen universel mekanisme af kontrol for alle vira eller virale transgener er lykkedes. Imidlertid har opdagelsen af ​​microRNA tilsynsnetværk tillod konstruktion af virale vektorer, hvori væsentlige mRNA’er selektivt nedbrydes i væv, der udtrykker et specifikt microRNA, hvilket gav mulighed for kontrol gennem væv-selektiv inaktivering af essentielle virale funktioner.

MikroRNA’er er ikke-kodende RNA-molekyler, der negativt regulerer mRNA translation ved binding til sekvenser normalt findes inden for 3 ‘un-translaterede region (UTR) [4]. Niveauet af komplementaritet mellem microRNA og målet påvirkninger hvorvidt mRNA nedbrydes (perfekt komplementaritet) eller danner et stabilt translationelt inaktivt kompleks. Inklusionen af ​​microRNA bindingssteder i 3’UTR af mRNA’er der koder essentielle virale proteiner tillader selektiv destruktion af mRNA og forebygger proteintranslation. Den forudsætning af alle vira for at udnytte mRNA translation for at kopiere betyder, at denne metode til kontrol kan universelt anvendes på enhver virus inficerer en eukaryot celle.

eksempler, hvor teknikken har været anvendt med succes er i kontrol den replikere af polio virus [5], herpesvirus [6], vesikulær stomatitis-virus [7], [8], Influenzavirus [9] og adenovirus type 5 (Ad5) [10], [11]. Virale vektorer, hvori denne teknik er med succes blevet anvendt til at styre transgen ekspression omfatter denguevirus replikoner [12], alphaviral replikoner [13], Lentivirusvektorer [14] og Adenovirusvektorer [15]. Baseret på nuværende litteratur, er det klart, at virus type, microRNA af valg og vævet af patologi er alle vigtige ved fastlæggelse af niveauet, hvortil en virus er med held kontrolleres.

Ad5 er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med virotherapy og vildtypestammen (Ad5WT) har vist sig at have kraftig anticanceraktivitet [16]. Men efter intravenøs administration til mus, Ad5WT årsager, akut hepatisk toksicitet, som, ved doser over 1×10

9 pfu, er ensartet fatal [17]. Denne toksicitet menes at afspejle høje niveauer af ekspression af E1A-proteinet i hepatocytter [18], [19]. Dette udtryk efterfølges af nedstrøms viral genekspression og hepatocyt celledød.

For at ophæve denne toksicitet, uden at det påvirker viral replikation i kræftceller, vi indsat fire perfekt komplementære bindingssteder for hepatocyt-specifikke microRNA mir122 ind i 3’UTR af E1A transkriptionskassetten (en virus betegnet Ad5mir122). Den perfekte komplementaritet mellem de mir122 bindingssteder vi har indsat og microRNA mir122 bør resultere i betydelige E1A mRNA spaltning gennem en mekanisme svarende til RNAi. Vi har tidligere vist, at dette kan reducere hepatisk viral replikation, ALT frigivelse og leverpatologi [10].

Der vides kun lidt om de potentielle uønskede cellulære konsekvenser af kontrol af virus ved hjælp af microRNA bindingssteder. Mængden af ​​cellulært microRNA kunne reduceres ved tilsætning af virale target mRNA’er eller de virale mRNA’er kunne mætte aktiviteten af ​​microRNA og tillade ændringer i niveauerne af endogene mRNA-mål. Tidligere undersøgelser under anvendelse af microRNA regulerede lentivirale vektorer er vist, at dette kan forekomme, når cellerne udsættes for en høj infektionsmultiplicitet. Dette tyder på, at de lovgivningsmæssige effekt af microRNA er mættes ved høje doser [20]. Under denne tærskel rapporteres de microRNA endogene mRNA mål for at være uændret [21]. I denne undersøgelse, vi satte sig for at afgøre, om dosis af Ad5mir122 stand til at vise intravenøs effekt i behandling af kræft i væsentlig grad vil påvirke hepatiske niveauer af mir122 eller dets mRNA-mål.

Materialer og Metoder

Adenovirus præparater

Adenovirus kloning er blevet beskrevet tidligere [10]. Alle adenovirus blev dyrket i A549 celler og oprenses ved dobbelt banding i CsCI-gradienter med Benzonase behandling efter første banding. Viruspartikel (vp) blev bestemt ved at måle DNA-indhold under anvendelse af en modificeret version af PicoGreen assay (Invitrogen, Paisley, UK) [22]. TCID

50 beregnet med Karber statistiske metode [23] blev anvendt til at estimere adenovirus titer (TCID

50 enheder /ml) og korrigeret for at bestemme plakdannende enheder /ml (pfu /ml). Adenovirus forberedelse egenskaber er som følger: Ad5WT: 1,13 × 10

12 vp /ml, 1,98 × 10

11 pfu /ml og partikel: infektivitet (P: I) forhold på 5,6; Ad5mir122: 1,29 × 10

12 vp /ml, 2,01 × 10

11 pfu /ml og partikel: infektivitet (P: I) ratio på 6,4

Vedligeholdelse af cellelinier

HT29-Luc og Lovo-Luc kolorektal cellelinier blev opnået fra Caliper Life Sciences (Runcorn, UK). Humant hepatocellulært carcinom HepG2 og Hep3B cellelinjer og A549 lungecarcinomceller blev opnået fra European Collection of Cell Cultures (Porton Down, UK), og opretholdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA Laboratories, Yeovil, UK) herunder penicillin (25 U /ml) og streptomycin (10 mg /ml).

luciferaseassays

celler blev udsået in triplo i plader med 48 brønde ved 2,5 x 10

4 celler /godt. Virusinfektioner blev udført ved 10 vp /celle. 24 timer efter infektion blev mediet fjernet, og 150 pi reporter celle lysis buffer (Promega) blev tilsat. Celler blev frosset ved -80 ° C i 1 time før optøning. Luciferin (25 ul) (Promega, Southampton, UK) blev tilsat til 25 pi cellelysat og relativ luminescens blev målt ved luminometri (Lumat LB 9507, Berthold Technologies, Redbourn, UK).

MTS Assays

Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af CellTiter 96 Aqueuos One Solution celleproliferationsassay (Promega). Celler blev podet ved 1 x 10

4 /brønd i plader med 96 brønde i 100 pi medier. Efter 24 timer blev virus tilsat ved 10 og 100 vp /celle i 100 pi medier. Celler blev efterladt for enten 3 eller 6 dage. På hvert tidspunkt blev mediet fjernet, og 20 pi MTS-reagens i 180 pi medium blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i 30 minutter. Pladerne blev aflæst ved 490 nm i 0,1 sekunder. Blanke brønde indeholdende MTS-reagens og medier, men ingen celler tjente som baggrund og ikke-inficerede celler repræsenterer 100% overlevelse i hver celletype. N = 5 for hver analyse.

Primær Hepatocyt kultur

Frosne humane primære hepatocytter (NHeps, CC-2591), hepatocyt Basal medium HBM

TM (CC-3199), kosttilskud og vækstfaktorer HCM

TM SingleQuots (CC-4182) blev købt fra Lonza. Celler blev podet og manipuleres ifølge Lonza protokol. En plade med 96 brønde blev coatet med rotte hale collagen type 1 (Sigma, C3867) ved 60 pg /cm

2. Celler blev optøet ved 37 ° C i et vandbad, centrifugeret ved 4 ° C i 3 minutter ved 50 g og derefter vasket i koldt kulturmedium. Celler blev resuspenderet og antallet og levedygtighed blev bekræftet ved anvendelse af trypanblåt ekskluderingsmetode. Den opnåede levedygtighed var 60% ved podning. Celler blev podet ved 5 x 10

4 /brønd med 120 pi medium hver brønd. Mediet blev skiftet efter 3 timer efter podning. Virusinfektioner blev udført 24 timer efter podning i 100 pi frisk medium ved 1 vp /celle, blev yderligere 100 pi medium tilsat ved 2 timer efter infektion. 100 pi medium blev udvekslet hver dag og indtil eksperimentet er afsluttet (72 timer). Supernatanten blev fjernet ved aspiration, og cellerne blev lyseret i 100 pi Promega reporter lysis buffer (E397A) og frosset ved -80 ° C før luciferase kvantificering.

Western blots

Protein blev ekstraheret fra murine leveren ved homogenisering i Promega lysis opløsning ved 80 mg /ml våd vægt. Prøverne blev span ved 2000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for at fjerne cellerester. 30 ug af liver protein blev sat på en 10% polyacrylamidgel efter kvantificering under anvendelse af en QuantiPro BCA assay (Sigma Aldrich, kat: QPBCA-1KT). Gelen blev kørt ved 160V i 1 time og derefter protein blev blottet til en nitrocellulosemembran natten over ved 4 ° C ved 30V. Nitrocellulosemembran blev farvet med Ponceau-opløsning for at bekræfte lig belastning (data ikke vist) og derefter blokeret med 5% mælkepulver (Fluka, Sigma-Aldrich) i 2 timer (E1A) eller natten over (aldolase A). Membranen blev vasket to gange med PBS 0,1% Tween 20 og derefter en gang med PBS. For E1A western blot, primære antistof, der genkender E1A (Abcam, Cambridge, UK, kat nummer: Ab33183) blev tilsat ved 1:500 fortynding i 2,5% mælkepulver i PBS i 1 time. Membranen blev vasket som ovenfor. Sekundært anti-kanin-HRP-mærket antistof blev tilsat ved 1:1000 fortynding i 2,5% mælkepulver i 1 time. På aldolase A western blot, primære antistof, der genkender aldolase A (Sigma-Aldrich, kat nummer: AV48130) blev tilsat ved 1:1000 fortynding i 2,5% mælkepulver i PBS i 1 time. Membranen blev vasket som ovenfor. Sekundært antistof var den samme som anvendt for Adenovirus E1A western blot men anvendt ved en 1:4000 fortynding i 1 time. Membranerne blev vasket som ovenfor og derefter badet i ECL western blotting påvisningsreagens (Amersham, GE Healthcare) på 0,125 ml /cm

2 i 1 minut. Blot blev visualiseret i en Alpha Innotech gel dokumentationssystem for 1, 5 og 10 minutter ved hjælp af kemi-luminescens afsløring.

RNA ekstraktion og Reverse-transskription kvantitativ PCR for E1A mRNA

Total RNA fra murine lever blev ekstraheret under anvendelse Mirvana miRNA isolation kit (Ambion) uden miRNA berigelsestrin. Reaktioner blev udført ved anvendelse af TaqMan RNA-til-C

T 1-trins kit (Applied Biosystems) efter producentens protokol. PCR-cykler var som følger: 95 ° C 10 minutter, derefter 40 cykler ved 95 ° C 15 sekunder, 60 ° C 1 minut. Primer sekvenser for at målrette E1A 13S var: Fwd – ATG TTT GTC TAC AGT FTT GTG TCT GAA, Rev – GAT AGC AGG CGC CAT TTT AGG og sonde – CCA GAA CCG GAG FTT GCA AGA FTT AC (Sigma-Aldrich), dual mærkes på 5′-enden med 6-carboxyfluorescein og 3′-enden med 6-carboxytetramethylrhodamin. Resultaterne blev analyseret med StepOne Plus Real-Time PCR Systems software (Applied Biosystems). Standard kurver blev foretaget af serielle fortyndinger af kendte mængder af E1A DNA ved hjælp af en Ad5 E1A kodning plasmid og antager 100% Centrifugeringsevne.

dyremodeller

Nu /nu CD1 hunmus blev opnået fra Charles Floder Laboratorier på 4-6 uger gamle. 5 × 10

6 HepG2-celler blev injiceret subkutant. Mus blev randomiseret inden behandling. Indledende tumor størrelser var typisk 10-20 mm

3. Alle blev forbehandlet med bisphosphonat liposomer (100 ìl /mus, opnået fra Dr. Nico van Rouijen) 24 timer før den første dosis af virus. I undersøgelsen af ​​intravenøse effekt mus modtaget bisfosfonat liposomer to gange på dag -1 og 18. Alle kontroldyr modtaget denne behandling. 10 Dyrene blev anvendt i hver gruppe.

Tumor dimensionering og Kaplan Meier analyse

Tumor volumen blev målt ved hjælp af håndholdte skydelærer og er defineret som størrelsen af ​​den største tumor i hver mus. Tumor volumen beregnes som en ellipsoide [24]. Kaplan Meier analyse blev udført under anvendelse af Prism software og er vist som overlevelsen procentvise gruppe på hvert tidspunkt.

Imaging

In vivo

virus-aktivitet blev vurderet ved ikke-invasiv luciferase billeddannelse under anvendelse af et IVIS 100-system (Xenogen, MA). D-Luciferin (kaliumsalt) (Gold Biotechnology Inc) blev fremstillet i PBS ved 15,8 mg /ml. 100 pi Luciferin blev administreret via intra-peritoneal injektion og mus blev afbildet 4 minutter senere.

Måling af serum alaninaminotransferase (ALAT)

50 pi blod blev taget fra mus ved halen bløder og tilladt at størkne (15 min, stuetemperatur) og centrifugeret ved 1200 g i 10 min. Serum blev isoleret og straks frosset ved -20 ° C. Prøver af optøet serum (5 pi) blev tilsat til ALT reagens (995 pi, Microgenics) i en 1 ml kvartscuvette, inkuberet ved 37 ° C, og ændringen i absorbans (340 nm) pr minut, blev målt. Enheder af ALT per liter blev beregnet i overensstemmelse med producentens anvisninger ved hjælp af følgende ligning:. Aktiviteten i enheder /liter = Ä absorbansændring pr minut x faktor (faktor = samlet reaktion volumen × 1000 /6,3 × prøvevolumen × vejlængde)

MicroRNA Kvantificering

RNA blev ekstraheret fra murin lever som beskrevet ovenfor og blev fortyndet til 1 ng /pl i nuklease frit vand. Modne mir122 niveauer blev kvantificeret ved hjælp af en TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems) specifik for mir122 (del nummer: 4.427.975 Assay ID: 002.130). Kort fortalt, revers transkription (RT) reaktioner (15 pi) blev sat op ifølge producentens retningslinjer til hjælp Multiscribe revers transkriptase (50 U /reaktion), dNTP’er (1 mM slutkoncentration), 0,188 pi RNase-inhibitor, 1,5 pi 10X RT buffer, 3 pi 5X mir122 TaqMan MicroRNA RT primer og 5 pi RNA-prøven (1 ng /pl). Reaktionsbetingelserne var 30 minutter 16 ° C, 30 minutter 42 ° C, 5 minutter 4 ° C. cDNA (1,33 pi af RT-reaktionen) blev tilsat til 1 pi 20X Mir122 Taqman MicroRNA assay 10 pi TaqMan 2X Universal PCR Master mix og fyldt op til 20 pi hjælp nuklease frit vand. Real-time PCR-betingelserne var 10 minutter ved 95 ° C efterfulgt af 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C, derefter 1 minut ved 60 ° C. Prøver blev kørt på en Step One Plus realtids-PCR-system (Applied Biosystems). Den microRNA let7a blev anvendt som en intern standard under anvendelse af de ovenfor beskrevne betingelser og ved anvendelse af TaqMan MicroRNA assay (Applied Biosystems) bestemt til moden let7a RNA (Delnummer: 4.427.975 Assay ID: 000.377). Relative Standardkurver blev fremstillet ved ti-fold seriefortyndinger af lever-RNA ekstraheret fra en mus, der modtager PBS. Reaktionsbetingelser egenskaber var som følger; mir122 assay: hældning 3,28, 101,78%, effektivitet 2,02 og lad 7a assay hældning 3,268, 102,29%, effektivitet 2.01. Relative udtryk blev beregnet ved hjælp af den metode, udgivet af Pfaffl, M [25]. Prober blev mærket ved 5′-enden med 6-carboxyfluorescein og ved 3′-enden med en ikke-fluorescerende quencher koblet til en minor groove-binder (MGB).

mRNA microarray analyse

RNA blev ekstraheret fra murin lever som beskrevet ovenfor. Hver gruppe indeholder 3 mus og uafhængige chips blev anvendt for hver prøve. Whole-genomet genekspressionsanalyse blev udført ved anvendelse Illumina Single Colour Mouse WG-6_V2_0_R0_11278593_A BeadChip med direkte hybridiseringsassay (Illumina, Essex, UK) ifølge producentens anvisninger starter med 300 ng samlet RNA fra hver prøve. Biotinyleret cRNA blev fremstillet under anvendelse af Illumina TotalPrep-96 RNA Amplification Kit (# 4.393.543 Ambion, Inc., Austin, TX). Dette kort omfatter en første og anden streng revers transkription trin, efterfulgt af en enkelt

in vitro

transkription (IVT) amplifikation, der inkorporerer biotin-mærkede nukleotider. Efterfølgende trin omfatter vifte hybridisering, vask, blokering, og streptavidin-Cy3 farvning. Fluorescens emissionerne med Cy3 blev kvantitativt opdaget af BeadArray scanner til nedstrøms analyse. GenomeStudio Dataanalyse Software blev brugt til at visualisere og analysere data, der genereres. Denne software giver resultater i standard filformater, der let kan behandles med de fleste kommercielle udtryk-analyse softwareprogrammer. Dataene blev importeret til GeneSpring GX 11.0.2 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara CA) normaliseret med Shift til 75 percentilen og baseline transformeret til medianen af ​​alle prøver for detaljeret analyse for at identificere markant differentielt udtrykte gener. Dataene diskuteret i denne publikation er MIAME kompatibel og er blevet deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus [26] og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE23854 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc .cgi? acc = GSE23854).

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med betingelserne i UK hjemmekontor retningslinjer og de UKCCCR retningslinjer for dyrevelfærd i Experimental neoplasi. Projektet licensnummer hjemmekontoret hvorunder disse forsøg blev udført, er PPL 30/2333. Alle forsøg blev udført med godkendelse af Medical Sciences Animal Ethics Committee, University of Oxford.

Resultater

Ad5mir122 shows faldt E1A udtryk i primære humane hepatocytter

Vi har tidligere vist at inddragelsen af ​​microRNA bindingssteder i 3’UTR af adenovirus E1A mRNA fører til lavere E1A protein i både murine leveren

in vivo

i mir122 positive menneskelige hepatoma cellelinje Huh7

in vitro

. Imidlertid Huh7 celler udtrykker kun 8% af mir122 niveauer af primære humane hepatocytter [27]. Vi ønskede derfor at måle niveauet af kontrol af viral transgenekspression, der kunne opnås i primære humane hepatocytter som et surrogat for human lever. Primære humane hepatocytter (1 × 10

4 /brønd) blev inkuberet med enten Ad5WT kodende luciferase C-terminalt fusioneret til E1A protein (Ad5WTLuc) eller tilsvarende virus indeholdende fire mir122 bindingssteder i E1A-luciferase 3’UTR ( Ad5mir122luc). Efter 72 timer luciferase niveauer var 30 gange lavere i celler inficeret med Ad5mir122luc (9,5 × 10

2 RLU /mg) sammenlignet med Ad5WTluc (2,7 x 10

4 RLU /mg) (figur 1) . Dette er den første demonstration af kontrol af en microRNA reguleret virus i primære humane celler og understreger den potentielle kliniske anvendelighed af at udnytte microRNA regulering i terapeutiske virus.

Primære humane hepatocytter blev inficeret med enten Ad5mir122luc eller Ad5WTluc ved 1 vp /celle. Luciferase niveauer er vist 3 dage efter infektion (n = 3) som relative lysenheder pr mg totalt protein. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen.

Ad5mir122 dræber mir122 negative celler med Ad5WT potens

evne Ad5mir122 at dræbe tumorceller ikke udtrykker mir122 blev sammenlignet med Ad5WT. Flere cellelinier blev inkuberet ved 10 og blev bestemt 100 vp /celle og cellelevedygtigheden efter 3 eller 6 dage efter MTS assay. Lige celledrab blev observeret med begge vira ved begge MOI’er ved dag 3 (data ikke vist). Næsten fuldstændig celledrab i nogle cellelinjer blev observeret ved den højere MOI på dag 6 (figur 2). Interessant cellelinjen mest modtagelige for drab med begge vira blev HepG2 humane hepatocellulært carcinom som er rapporteret at være mir122 negative [27]. Da der falder i mir122 niveauer i primære hepatomer er en indikator for dårlig prognose [28], HepG2-celler repræsenterede en lovende tumor model, som bør maksimere det terapeutiske indeks opnås ved Ad5mir122 mellem tumorvæv og primær leveren.

Sammenligning af Ad5mir122 og Ad5WT i cancercellelinier inkuberet ved en infektionsmultiplicitet på 100 viruspartikler per celle. Den procentvise celleoverlevelse er vist 6 dage efter infektion (n = 5) under anvendelse af en MTS celleoverlevelse assay. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en envejs ANOVA. (* = P 0,05, NS = ikke signifikant)

farmakodynamik-ledede bestemmelse af optimale virus doser

De optimale doser af Ad5mir122 og Ad5WT blev bestemt for at definere en protokol, der ville tillade gentagelse levering i en cancer effekt model. Selvom vi tidligere har defineret enkelt injektion maksimalt tolererede dosis i normale mus af Admir122 (6 × 10

10 vp), behandling af xenograft bærende nøgne mus kan kræve en anden protokol, og derfor en farmakodynamik-ledede dosiseskalering undersøgelse blev udført .

Ad5WT og Ad5mir122 blev administreret intravenøst ​​til CD1 nøgne mus med HepG2 xenografter, med serum ALT målt efter hver dosis (figur 3a). Startdosis for begge vira var 6 × 10

9 vp /mus, svarende til 8,8 × 10

8 pfu for Ad5WT, lidt lavere end den offentliggjorte maksimalt tolererede dosis (MTD, 1 × 10

9 pfu ) [17]. For at muliggøre billeddannelse af virus aktivitet hver dosis indeholdt 10% Ad5mir122luc.

A) Serum alaninaminotransferase (ALAT) niveauer fra mus, der fik Ad5mir122, Ad5WT eller PBS. ALAT værdier for hver gruppe er vist på dag 2, 5 og 8 (n = 3) efter den første injektion. Dataene er angivet som ALT enheder pr liter hjælp af ligningen i de materialer og metoder. B) Luciferase billeddannelse 2 dage efter den første injektion af Ad5mir122 (venstre panel) eller Ad5WT (højre panel). C) Luciferase billeddannelse otte dage efter den første injektion. Mus, som modtog en enkelt injektion af Ad5WT er vist i højre panel og mus, der modtog tre injektioner af Ad5mir122 er vist i det venstre panel. Billeder er alle præsenteres på samme skala. D) Dosering og behandling tidsplan for Ad5mir122 og Ad5WT. Virale doser er indikeret over hver linje og omfatter 10% af en Luciferase reporter virus (Ad5mir122luc). Alle mus blev behandlet med bisphosphonat liposomer på dag -1

To dage efter administration af 6 × 10

9 vp Ad5WT viste mus dramatisk forhøjede ALAT. ( 1000 enheder /L) tyder signifikant hepatisk toksicitet (figur 3a). Billeddannelse viste høje niveauer af hepatisk luciferaseekspression, bekræfter virusaktivitet i leveren med lidt at ingen tumor signal (figur 3b). Selvom ALT værdier faldt støt gennem dagen 2-8 (figur 3a), flere dyr (6 ud af 10) viste signifikant vægttab ( 5%) og en blev sat ned (vægttab 15%). Derfor denne dosis Ad5WT blev taget som MTD, og ​​behandlingen blev ikke eskaleret.

I modsætning hertil to dage efter administration af den samme dosis (6 x 10

9 vp) af Ad5mir122 viste mus ALT aflæsninger ligner PBS kontroller (figur 3a). Billeddata bekræftede dette resultat uden påviselig hepatisk luciferase (figur 3b). Lidt til ingen tumor infektion blev observeret med denne dosis.

Dosis af Ad5mir122 blev derfor forøget med en halv log til 2 × 10

10 vp, tre dage efter den første injektion. Imaging på dag fem viste nogen luciferaseaktivitet (hvilket indikerer ekspression af E1A) i både tumor og lever, selvom absolutte værdier varierede mellem mus (data ikke vist). Gennemsnitlige ALAT værdier viste en stigning til 222 ALT enheder /L sammenlignet med 42 ALT enheder /L fra kontroller (figur 3a). På dag seks dosis blev yderligere forøget med en halv log til 6 × 10

10 vp. Imaging på dag otte viste signifikant luciferaseaktivitet i tumorerne, men dette blev koblet med målelig luciferaseaktivitet også i lever (figur 3c). ALT aflæsninger viste kun en lille stigning fra den tidligere dosis (figur 3a). Denne undersøgelse bekræftede, at 6 × 10

10 vp af Ad5mir122 var tæt på MTD for Admir122 efter aftale med vores tidligere data i normale mus.

Gentag administration af Adenovirus kan forårsage kumulativ toksicitet [10]. Til vurdering af effekt var det ønskeligt at administrere virus ved flere lejligheder, dermed for gentagne administrationer, vi valgte dosisniveauer, der var halvt en log lavere end de anslåede MTDs af Ad5mir122 (2 × 10

10 vp /mus) og Ad5WT (2 × 10

9 vp /mus).

Effekt af Ad5mir122 og Ad5WT i en hepatoma xenograftmodel

for at bestemme den anti-cancer aktivitet Ad5mir122, nøgne mus bærende etablerede HepG2 xenotransplantater var administreret 2 × 10

10 vp intravenøst ​​på dag 0, 3, 19 og 22, mens kontroldyr modtog enten 2 × 10

9 vp af Ad5WT eller PBS. Behandlingen begyndte med tumorer mellem 10-20 mm

3 i størrelse. Tumor vækst blev overvåget for effekt og en overlevelse endpoint (for Kaplan Meier graf) blev indført, da individuelle tumor volumen nåede 400 mm

3. Dyr med den hurtigste tumorvækst fik lov til at fortsætte ud over dette punkt (op til 1000 mm

3) for at tillade gruppen gennemsnitlige tumorstørrelse at nå 400 mm

3. Mus indgives Ad5mir122 viste signifikant reduceret tumorvolumen fra dag 20 sammenlignet med PBS-kontroller (figur 4a). Imidlertid mus, der modtog Ad5WT viste også signifikant anti-cancer virkning. Dette er måske overraskende, da Ad5WT har vist sig at have kraftig anticanceraktivitet [29]. Det er vigtigt at understrege, at doserne af Ad5mir122 og Ad5WT ikke var equitoxic. Efter 4 dage i behandling med Ad5WT en mus blev aflivet på grund af vægttab ( 15%) og hepatisk toksicitet (figur 4b). Ingen sådanne bivirkninger forekom i den gruppe, der modtager Ad5mir122 på en 10 gange højere dosis.

Gentag administration af Ad5mir122 (n = 10 mus) ved dosis behandling bestemmes ud fra figur 2 (2 × 10

10vp ) på dag 0, 3, 19 og 22 ved intravenøs injektion. Kontroldyr fik gentagen indgivelse af 2 × 10

9 vp Ad5WT eller PBS ved intravenøs injektion (n = 10 mus). A) Tumor volumen af ​​mus, der fik PBS eller Ad5mir122 eller Ad5WT blev beregnet som mængden af ​​en ellipsoide [24]. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en ANOVA med en Bonferroni slutværdierne (ns = ikke signifikant, * = P 0,05, ** = P 0,01) ved hvert tidspunkt. Fejlsøjler er vist som standardfejl. B) Kaplan Meier overlevelse analyse viser forøget overlevelse af mus, der modtager Ad5mir122 og Ad5WT sammenlignet med kontrolmus, der fik PBS. Efter 4 dage i behandling med Ad5WT en mus blev aflivet på grund af toksicitet. Ingen behandlingsrelaterede toksiciteter blev observeret under Ad5mir122 behandling eller behandling med PBS. Dage der vises på begge de vandrette akse repræsenterer antallet dage siden den første virus injektion.

Kaplan Meier analyse af mus administreret Ad5mir122 viste øget overlevelse med alle mus overlever længere end alle kontroller (figur 4b). Disse data viser, at gentagen administration af Ad5mir122 ved doser over MTD Ad5WT kan have betydelig anti-cancer effekt uden toksicitet.

Vurdering af hepatisk intra-Ad5mir122 E1A aktivitet

For at kvantificere både den E1A-mRNA og protein produceret af Admir122 ved den optimale dosis behandling i forhold til Ad5WT blev Balb /C-mus injiceret med 2 x 10

10 vp og leverne blev høstet efter 48 timer. Som yderligere kontrol mus fik indgivet PBS eller en E1A deleteret ikke-replikerende adenovirus type 5, der koder luciferase (AdLuc) ved den samme dosis. RNA blev ekstraheret og de store E1A 13S transkriptet blev målt ved RT-QPCR. Ad5mir122 viste en 29-gange fald i niveauet af 13S E1A transkript kopier i sammenligning med Ad5WT. E1A mRNA kopier pr nanogram totalt RNA var 4,57 × 10

6 og 1,54 × 10

5 hhv. Dette bekræftede, at stabiliteten af ​​mRNA er selv direkte berørt af microRNA regulering, som man ville forvente (figur 5a).

A) RT QPCR for 13S E1A mRNA udskrift i lever fra mus 48 timer efter intravenøs injektion med 2 × 10

10 vp af Ad5mir122, Ad5WT, Ad5Luc eller PBS. Ad5mir122 viser signifikant reduceret E1A-mRNA under leveren infektion sammenlignet med Ad5WT (N = 3). Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af en to-halet Student t-test (* P = 0,05). B) Western blot for at bekræfte, at alle E1A-proteinerne varianter er slået ned. Hver bane repræsenterer protein ekstraheret fra en individuel mus. Kontrolbaner indhold af lever fra mus behandlet med enten en E1A udgår Ad5Luc vektor eller PBS viser ingen E1A signal. Ad5WT behandling viser 3 klart definerede bånd svarende til proteiner produceret fra 13S (36 kDa), 12S (26 kDa) og en mindre svagere bånd, som kan repræsentere de 11S eller 10S E1A transkript produkt. Behandling med Admir122 viser signifikant knockdown i E1A protein niveauer for alle splejsningsvarianter. Blottet blev eksponeret for 1, 5 og 10 minutter med 5 minutters eksponering præsenteres her. Molekylvægte blev beregnet mod en dobbelt farve molekylvægt stigen (Bio-Rad).

For at bekræfte, at den reducerede niveau af E1A mRNA resulterede i nedsat E1A protein produktion, og at bekræfte, at effekten ikke var E1A 13S specifik, lever proteinekstrakter blev analyseret ved western blot for E1A protein.