PLoS ONE: fibroblastvækstfaktorreceptor 3 interagerer med og aktiverer TGFp-aktiveret kinase 1-tyrosinphosphorylering og NFKB signalering i myelomatose og blærekræft

Abstrakt

Kræft er et stort problem for folkesundheden i hele verden. I USA alene, 1 i 4 dødsfald skyldes kræft og for 2013 forventes i alt 1,660,290 nye kræfttilfælde og 580,350 kræft dødsfald. Omfattende profilering af flere kræft genomer har afsløret en meget kompleks genetisk landskab, hvor et stort antal ændrede gener, varierende fra tumor til tumor, påvirke centrale biologiske veje og processer. Dette har betydning for terapeutisk målretning af signalering netværk i udviklingen af ​​behandlinger for specifikke kræftformer. NFKB transskriptionsfaktoren er konstitutivt aktiv i en række hæmatologiske og faste tumorer, og mange signalveje impliceret i cancer er sandsynligvis forbundet til NFKB-aktivering. En kritisk mediator af NFKB-aktivitet er TGFp-aktiveret kinase 1 (TAK1). Her identificerer vi TAK1 som en ny interagerende protein og mål for fibroblastvækstfaktorreceptor 3 (FGFR3) tyrosinkinaseaktivitet. Vi demonstrerer endvidere, at aktiverende mutationer i FGFR3 forbundet med både myelomatose og blærekræft kan modulere ekspression af gener, der regulerer NFKB signalering, og fremme både NFKB transkriptionel aktivitet og celleadhæsion på en måde, afhængig af TAK1 ekspression i begge cancer celletyper. Vores resultater tyder TAK1 som et potentielt terapeutisk mål for FGFR3-associerede kræftformer og andre maligniteter, hvor TAK1 bidrager til konstitutiv NFKB aktivering

Henvisning:. Salazar L, Kashiwada T, Krejci P, Meyer AN, Casale M, Hallowell M, et al. (2014) fibroblast vækstfaktor receptor 3 interagerer med og aktiverer TGFp-aktiveret kinase 1-tyrosinphosphorylering og NFKB signalering i myelomatose og blærekræft. PLoS ONE 9 (1): e86470. doi: 10,1371 /journal.pone.0086470

Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, USA

Modtaget: August 19, 2013; Accepteret: 9. december 2013; Udgivet: 23 januar 2014

Copyright: © 2014 Salazar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af myelomatose Research Foundation, Chao Family Comprehensive Cancer center på UCI, Elsa U. Pardee Foundation, Ministeriet for uddannelse, ungdom og sport, den Tjekkiske Republik (KONTAKT LH12004), tjekkisk Science Foundation (P305 /11/0752). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en kompleks sygdom som følge af overtagelsen af ​​somatiske mutationer, dysregulate signalveje centrale for celledeling og overlevelse, angiogenese, og metastase. Dysregulering af FGFR3 signalering har været impliceret i flere kræfttyper, især urotelial cellecarcinom (UC) og multipel myelom (MM). Urothelial celle karcinomer tegner sig for mere end 90% af blære kræft, som har en verdensomspændende forekomst af mere end 350.000 nye årlige diagnoser og rang som den tredje mest almindelige malignitet hos mænd og den tiende mest almindelig hos kvinder i USA [1]. Overekspression eller aktiverende mutation af FGFR3 er den hyppigste genetisk ændring i UC (gennemgået i [2]). Myelomatose, kræft i terminalt differentierede B-celler, er den anden mest almindelige hæmatologisk kræft med en American Cancer Society skøn på 22.350 nye tilfælde i 2013. Blandt de tilfælde af MM med den dårligste prognose er dem 15% med t (4; 14) translokation, der er rettet mod både FGFR3 og MMSET (Anmeldt i [3] – [5]). Nylige undersøgelser viser, at denne translokation kan være den største klon på diagnosetidspunktet eller omvendt kun observeret på tidspunktet for tilbagefald [6]. Men mekanismen bag aggressivitet t (4; 14) myelom fortsat uklar og det relative bidrag af FGFR3 og MMSET som formodede onkogener er kontroversiel, som 25% af t (4; 14) tumorer mangler FGFR3 ekspression. Købet af FGFR3-aktiverende mutationer (5-10% af t (4; 14) tilfælde) med sygdomsprogression indikerer en rolle for FGFR3 i MM patogenese, og tidlige undersøgelser demonstrere onkogent potentiale af aktiveret mutant FGFR3 [4]. Det blev også mere nylig vist, at vildtype FGFR3, som er udtrykt i de fleste FGFR3-positive t (4; 14) tumorer, kan bidrage til B-celle onkogenese [7]. Desuden et væld af prækliniske data viser effektiviteten af ​​receptor tyrosinkinaseinhibitorer og neutraliserende antistof mod MM-celler, der udtrykker FGFR3-aktiverende mutationer og vildtype-receptoren (gennemgået i [3] – [5]). Tilsvarende kan inhibering af FGFR3 inducerer cellecyklusstandsning og /eller apoptose i UC [8], [9] både

in vitro

in vivo

, tilvejebringelse validering at FGFR3 og nedstrøms signalveje repræsenterer potentielt relevante terapeutiske mål til behandling af FGFR3-associerede cancere.

FGFR3 er en af ​​fire tyrosinkinasereceptorer som medierer virkningerne af FGF’er på diverse cellulære processer, herunder proliferation, differentiering og migration. Receptoraktivering udløser signaltransduktionsveje impliceret i onkogenese, herunder Ras /ERK /MAPK, PLCγ /PKC, PI3K, og STAT pathways [10]. Nyere data viser, at FGF-receptor signalering også kan aktivere NFKB [11], [12], den afvigende aktivering af som ofte observeres i human cancer [13], [14] og tæt korrelerer med kræft kendetegnende [15]. Et nøglemellemprodukt NFKB-signalering, TGFp-aktiveret kinase 1 (TAK1), funktioner nedstrøms for multiple signalveje, der regulerer celleoverlevelse, differentiering og inflammatoriske reaktioner [16], og står som et centralt IKK-kinase af den kanoniske NFKB pathway [ ,,,0],17]. Kemisk og genetisk hæmning af TAK1 fremmer apoptose i hudtumorer [18] og en delmængde af tyktarmskræft [19], samt faldende kemoresistens i bryst og tyktarm cancerceller [20] og kemoresistens og NFicB aktivitet i bugspytkirtelkræftceller i kultur [ ,,,0],21]. Endvidere undertrykkelse af TAK1 signalering reducerer NFKB-aktivering i menneskelige hoved og hals pladecellecarcinom cellelinier [22], ovariekarcinomceller [23], og brystcancercellelinier [24], og blokerer brystcancer celleadhæsion, invasion og metastase in vitro [25]. TAK1 er ikke blevet undersøgt i forbindelse med MM eller blærekræft; men det er nedstrømsmål, NFKB, har vist sig som en af ​​de mest potente førere af tumorigenese i MM, med så mange som 82% af MM prøver udtrykker aktivering signatur molekyler [26], [27]. I overensstemmelse med denne nøgle oncogen rolle, flere lægemidler, som er effektive mod MM, herunder bortezomib, thalidomid, og lenalidomid, blok aktivering af NFKB (revideret i [28]). I UC, undertrykkelse af NFKB-aktivitet potenserer de apoptotiske virkninger af kemoterapeutiske midler og cytokiner [29], [30].

Ved hjælp af en kombination af gær-to-hybrid- og mikroarray genetisk screening kombineret med systemer pathway analyse identificerer vi TAK1 som en ny interactor og mål for FGFR3 tyrosinkinaseaktivitet. Vi demonstrerer endvidere en rolle for TAK1 som en positiv regulator af NFicB aktivitet neden for FGFR3 i både myelomatose og urotelial celle karcinom, to kræftformer med demonstreret FGFR3 involvering [10], [31], med modulerende effekter på celleadhæsion.

Metoder

Cell Kultur og transfektion

FGFR3-negative (RPMI-8226) og vildtype (LP1) humant MM-cellelinjer blev opnået fra den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer [DSMZ; Braunschweig, Tyskland]; FGFR3 mutant MM celler (KMS-11; Y373C) stammer fra en MM patient og fastlagt på Kawasaki Medical School [32], blev generøst tilvejebragt af Dr. P Leif Bergsagel. Mutant FGFR3 blærekræft cellelinje, MGHU3 (Y375C), en slags gave fra Dr. Margaret Knowles (University of Leeds, Leeds, UK), blev afledt fra en klasse 1 tumor [33]. MM og UC-celler blev opretholdt i RPMI 1640 (Hyclone, Thermo Scientific, Rockford, IL) og HeLa og HEK293-celler (ATCC) i DMEM (Hyclone), begge medier suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). Transient transfektion af HeLa og HEK293-celler blev opnået ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Life Technologies; Grand Island, NY) ifølge fabrikantens protokol og MM og UC transficerede linjer ved hjælp Neon systemet (Life Technologies). Følge fabrikantens procedure 1 x 10

6 UC eller 2 × 10

6 mm celler blev suspenderet i 100 pi suspension indeholdende 5 ug siRNA (Dharmacon) eller plasmid og pulset under programmet 3 for UC og programmet 15 ( KMS-11) eller 20 (RPMI-8226) for mm celler.

antistoffer og reagenser

FGFR3-antistof (B-9, C-15) og FGFR1 /2/4-antistoffer var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Antistoffer mod TAK1, ERK, phospho-ERK, phospho-tyrosin (4G10), p65 og p84 var fra Millipore (Billerica, MA), som var normalt kanin IgG. Rekombinant human FGF1 blev opnået fra R Abnova, Taipei City, Taiwan) som substrat. Det rekombinante aktiv FGFR3 intracellulære domæne (397-End, SignalChem, Richmond, CA) blev anvendt ved 300 ng pr reaktion

Microarray Procedurer og Analyse

Celler blev transficeret med 5 ug ikke-målretning. eller TAK1-specifik siRNA og fik lov at komme sig natten over. Den næste dag, celler forblev ubehandlet eller modtaget 100 nM PD173074 i 48 timer før RNA-isolering. Hver behandling blev fremstillet som tredobbelte prøver. Totalt RNA blev forarbejdet som anbefalet af Affymetrix, Inc. Kort fortalt RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol (Life Technologies) og ledes gennem RNeasy spin-søjler (Qiagen, Valencia, CA) for yderligere rydde op. UCI mikromatrice Core Facility kvantificeres derefter total RNA ved NanoDrop (Thermo Scientific) og testet for renhed ved hjælp af Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Ambion WT ekspression kit (Life Technologies) blev anvendt til fremstilling RNA-prøver for hele transkriptom microarray analyse. To ug af det mærkede, blev fragmenteret enkeltstrenget cDNA hybridiseres derefter til probe sæt på en human AffymetrixGeneChip 1.0ST array. Arrays blev scannet ved hjælp af GeneChip Scanner 3000 7 G og kommandokonsollen Software v. 3.2.3. Resultaterne er tilgængelige via genekspression Omnibus (GEO) repository (tiltrædelse nummer GSE52452)

Data blev importeret til Partek Genomics Suite Version 6.6 software med følgende operationer bliver gjort for at forberede data til statistisk analyse:. 1) RMA Baggrund Korrektion, 2) Kvantil Normalisering, 3) Log bund 2 transformation, og 4) Sammendrag af probesæt hjælp middelværdi. Statistisk analyse bestod af en-vejs ANOVA med en enkelt kategorisk variabel, og gen-lister blev genereret for disse gener med fold-change størrelsesorden 2 og p-værdi med en falsk opdagelse sats (FDR). 0,05

Gene lister blev derefter importeret til Ingenuity Systems Pathway Analysis (IPA) software, som har funktioner til at generere gen-netværk, sortering gener i forskellige funktionelle og andre kategorier, og for overlejring gener på kendte signalveje, farvelægning af fold ændring eller nogle anden værdi.

Kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra MGHU3 og KMS-11-celler under anvendelse af TRlzol (Life Technologies) og ledes gennem RNeasy spin-søjler (Qiagen) for yderligere rydde op. Vilkårligt primet cDNA-syntese blev udført på 1 ug totalt RNA ved anvendelse af Superscript III RT Kit (Life Technologies). Alle primerpar intron-spændende og en ingen RT-kontrol var inkluderet. Primerpar var som følger: Actin vende AGGTGTGGTGCCAGATTTTC og videresende GGCATGGGTCAGAAGGATT, GAPDH omvendt GCCAGTGGACTCCACGAC og frem CAACTACATGGTTTACATG, DFNA5

vende

CAGGTTCAGCTTGACCTTCC og

frem

ACCAATTTCCGAGTCCAGTG, GSTA1 vende CCGTGCATTGAAGTAGTGGA og frem ACGGTGACAGCGTTTAACAA, PSCA vende GTTCTTCTTGCCCACGTAGT og frem CAGGTGAGCAACGAGGAC, BAMBI vende GAAGTCAGCTCCTGCACCTT og videresende TGCACGATGTTCTCTCTCCT, TNFAIP3 vende CGCTGTTTTCCTGCCATTTC og videresende GATAGAAATCCCCGTCCAAGG, SGK1 omvendt TGTCAGCAGTCTGGAAAGAGAAGT og videresende CGGAATGTTCTGTTGAAGAATGTG.

NFKB Luciferase Assay

Celler blev transficeret med 5 ug ikke-targeting eller TAK1 -specifikke siRNA’er. Fireogtyve timer senere blev cellerne transficeret med NF-KB-Luc og pRL-TK kontrol

Renilla

i et forhold på 03:01 og fik lov til at komme sig i 24 timer. Hvor det er angivet, blev celler samtidig transficeret med de angivne FGFR3 plasmider. Celler blev derefter serum sultet natten over, efterfulgt af en 8 timers behandling med 40 ng /ml FGF1. Luciferaseaktivitet blev detekteret under anvendelse af en dual-luciferase reporter assay (Promega: Madison, WI). Forskelle i NFKB-aktivitet efter TAK1 dæmpende under hver behandling betingelse blev statistisk analyseret under anvendelse af en uparret to-halet t-test.

Cell Fraktionering

MGHU3 celler blev transficeret med 5 ug ikke-målretning eller TAK1 -specifikke siRNA’er. Otteogfyrre timer senere blev cellerne serumudsultet natten over, derefter behandlet med 40 ng /ml FGF1 i 0, 5 eller 60 minutter. Celler blev opsamlet derpå fraktioneret ved anvendelse af en protokol tilpasset fra [41].

celleadhæsionsassay

celler blev transficeret med 5 ug ikke-målretning eller TAK1-specifik siRNA og fik lov at komme sig natten over. Den næste dag, celler forblev ubehandlet eller modtaget 50 nM PD173074 i 48 timer før udpladning af adhæsionsassayet. Celler behandlet med FGF1 var serum-udsultet natten over og behandlet med ligand 1 time før udpladning og under hele assayet. Adhæsionsassays blev udført 72 timer efter transfektion. Kort fortalt blev seksoghalvfems brønde coatet natten over ved 4 ° C med 1 ug /ml collagen IV, blokeret med 1% BSA i 1 time ved 37 ° C, og vasket to gange med PBS og en gang med serumfrit medium. Celler blev opsamlet og podet ved 5 x 10

4 om de foreløbigt overtrukne plader i nærvær af behandlingen angivet. Cellerne fik lov at klæbe 3 timer ved 37 ° C blev brøndene vasket 3 gange med PBS for at fjerne ikke-adhærerende celler, og adhærens bestemmes følgende 4 timers inkubation med Calcein-AM (Life Technologies) ved måling fluorescensintensiteten ved Ex /Em 490 /520 nm. Statistisk analyse af forskelle i cellulær vedhæftning følgende TAK1 dæmpende under hver behandling tilstand blev udført ved hjælp af en uparret to-halet t-test.

Resultater

FGFR3 interagerer med TAK1

identificering af protein-interaktioner kan tilvejebringe vigtig information om specifikke signalveje og identificere nye potentielle terapeutiske mål. I MM, specifikke rolle ektopisk udtrykt FGFR3 i en delmængde af sager er fortsat kontroversiel, mens der i blærekræft, FGFR3 er for nylig blevet impliceret som en vigtig drivkraft for spredning [42]. Vi tog en systematisk tilgang til at få en bedre forståelse af FGFR3 signalering i associerede kræftformer gennem identifikation af nye FGFR3 protein interaktioner ved hjælp af en gær to-hybrid (Y2H) assay. Det cytoplasmatiske domæne af human FGFR3 (aminosyrer 399-806), der indeholder vildtype-sekvens eller den stærkt aktiverende K650E mutation, blev anvendt som madding til at screene et humant primær chondrocyt cDNA-bibliotek (fig. 1A) som beskrevet [37]. Dette bibliotek blev valgt som FGFR3 er højt udtrykt i chondrocyter, og den stærkt aktiverende K650E mutation, til stede i en undergruppe af både MM og UC [43], er til stede i det intracellulære tyrosinkinasedomæne. Potentielle interaktioner blev identificeret af filteret lift β-galactosidase assay, sekventeret, og re-testet for interaktion i gær. Blandt de identificerede interaktioner var signaltransduktionstrinene proteiner, herunder p85 regulatoriske underenhed af PI3-kinase [37], og TAK1. Gæren byttedyr plasmid bestod af de C-terminale 138 aminosyrer af TAK1 (aminosyrer 441-579), hvilket indikerer, at denne region af TAK1 er involveret i binding FGFR3. Vi yderligere bestemt ved Y2H hjælp FGFR3 domæne konstruktioner (fig. 1A), at regionen omfatter den anden halvdel af tyrosinkinasedomænet af FGFR3 indeholdende aktiveringssløjfen af ​​receptoren og C-terminale hale af FGFR3 (aminosyrerne 589-806) , tilstrækkelig til FGFR3-TAK1 interaktion. For at bekræfte FGFR3-TAK1 interaktion i pattedyrceller og navnlig FGFR3-associeret cancer cellelinjer, humane FGFR3 konstruktioner, herunder vildtype, kinase-døde og konstitutivt aktive (K650E) sekvenser, blev forbigående udtrykt i HeLa-celler. TAK1 co-immunpræcipiteret med alle testede FGFR3 sekvenser; hvilket viser, at FGFR3 og TAK1 interagere i mammale celler, og at receptoraktivering er ikke nødvendig (figur 1B). Endogen FGFR3 i to t (4; 14) MM-cellelinjer, LP-1 (wt) og KMS-11 (Y373C) [44], [45], også interagerede med TAK1 ved co-immunoudfældning (figur 1C). Som vi observerede FGFR3 niveauer var betydeligt lavere i MGHU3 end MM linjer, FGFR3

WT blev overudtrykt tilstrækkelig påvisning af en TAK1-FGFR3 interaktion i MGHU3 (Figur 1D). Bemærk, at MGHU3 UC celler bærer samme FGFR3 mutation som KMS-11 mm celler. En FGFR3-TAK1 interaktion blev også evalueret i RT-112 UC celler, som udtrykker en afkortet vildtype FGFR3 (aminosyrer 1-758) i fusion med at omdanne syre oprullet spole 3 (TACC3) sekvenser (rester 433-838) [46 ]. Vi kunne ikke overbevisende detektere interaktionen i denne linje, yderligere underbygger vigtigheden af ​​FGFR3 C-terminale sekvenser i interaktionen med TAK1 (data ikke vist). Endelig har vi også brugt massespektrometri til at karakterisere proteiner inddrevet i TAK1 immunpræcipitater. Efter ekspression af både aktiveret FGFR3-K650E og TAK1 i HEK293-celler, TAK1 immunopræcipitater blev analyseret ved immobiliseret metal-affinitetskromatografi /nano-væskekromatografi /elektrospray ionisering massespektrometri (IMAC /nano-LC /ESI-MS) [38], [39 ]. I tre uafhængige prøver, foruden betydelig dækning for Taki som forventet, FGFR3-afledte peptider, der repræsenterer 48% dækning samlet blev utvetydigt identificeret, som vist i tabel 1. Kollektivt giver disse resultater bevis for en hidtil ukendt interaktion mellem FGFR3 og TAK1 der gør ikke kræver aktivering af receptoren. Der er præcedens for dette med FRS2 adapter, som interagerer med FGF-receptorer konstitutivt, men kun aktiverer nedstrøms signalering (ERK /MAPK) ved receptoraktivering [47]. Vi viser, at FGFR1, 2 og 4 forbigående udtrykt i HEK293-celler yderligere, også interagere med TAK1 (figur 1E), hvilket antyder, at interaktionen er bredt relevant for FGF-receptor signalering.

FGFR3 kan Tyrosin phosphorylere TAK1

in vitro

TAK1 aktivering kræver Ser /Thr fosforylering på flere rester i aktivering løkke (revideret i [48], [49]). Selv tyrosinphosphorylering af TAK1 ikke tidligere er blevet rapporteret, FGFR3 fungerer som en tyrosinkinase; derfor evalueret vi muligheden for, at FGFR3 kan tyrosin phosphorylere TAK1. , Fandt vi faktisk, at TAK1 blev tyrosin phosphoryleret i HEK293-celler transient udtrykkende konstitutivt aktiv FGFR3 (K650E), men ikke den kinase-døde receptor (K508M), hvilket indikerer, at aktiveret FGFR3 kan enten direkte eller indirekte tyrosin phosphorylere TAK1 (figur 2A). TAK1 tyrosinphosphorylering blev yderligere observeret i et cellefrit kinaseassay anvendelse af rekombinant TAK1 og kinasen-aktive intracellulære domæne af FGFR3, hvilket indikerer, at TAK1 kan være et direkte mål for FGFR3-tyrosinkinaseaktivitet (figur 2B).

(A) HEK293 celler transficeret med FGFR3

K508M eller FGFR3

K650E. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne lyseret, og TAK1 immunopræcipiteret fra 1 mg total lysat. Immunpræcipitater blev opløst ved SDS-PAGE, blottet og testet med 4G10-antistof. Pil angiver TAK1. Repræsenterer seks eksperimenter. (B) En cellefri kinaseassay blev udført under anvendelse af rekombinant human TAK1 har et substrat for rekombinant human FGFR3 (tyrosinkinasedomæne). Tyrosinphosphorylering blev visualiseret ved immunoblotting med 4G10-antistof. Repræsentant for fire eksperimenter.

Gene Expression Analysis Identificerer NFKB som Signaling Hub for FGFR3 og TAK1 Integration

TAK1 er en vigtig formidler af signalering kaskader fører til aktivering af NFKB og AP -1 transkriptionsfaktorer, som hver modulerer ekspression af gener involveret i onkogenese og apoptose (gennemgået i [16], [50]). Til at begynde at undersøge integration af TAK1 og FGFR3 signalering i cancerceller, udførte vi en sammenlignende microarray analyse af genekspression i MGHU3 blærekræft cellelinje, som udtrykker FGFR3 Y375C aktiverende mutation og udviser kraftige reaktioner på FGF-receptor-specifikke PD173074 inhibitor som vurderet af ERK-phosphorylering [9]. For at identificere gener, der er afhængige af både FGFR3 og TAK1 signaler blev MGHU3 celler transficeret med ikke-målretning eller TAK1-specifik siRNA, og hver delmængde yderligere behandles med PD173074 eller vehikelkontrol. Envejs-ANOVA med fold-change størrelsesorden 2 og p-værdi med FDR .05 blev anvendt til at generere gen lister. TAK1 siRNA versus ikke-målrettet siRNA prøver gav 39 gen ændringer, der afspejler TAK1 specifikke gener i overværelse af FGFR3 signalering. TAK1 siRNA plus PD173074 versus ikke-målrettet siRNA plus PD173074 prøver gav 105 gen ændringer, der afspejler TAK1 specifikke gener i fravær af FGFR3 signalering. At skelne ændringer, der er afhængige af både FGFR3 og TAK1, gener, der viser statistisk signifikante gen ændringer som følge af TAK1 knockdown kun i nærværelse af FGFR3 signalering, men ikke i dens fravær, blev udvalgt. Overlappende gener fra sættet af 105 TAK1 gen ændringer i fravær af FGFR3-signalering blev fjernet fra de 39 TAK1 gen ændringer i nærvær af FGFR3-aktivitet. De 13 unikke gener, der forblev ændret så markant i disse forhold repræsenterer gener, der afspejler både TAK1 og FGFR3 signalering (tabel 2).

Vi valgte 6 gener fra listen over 13 til validering baseret på deres relevans ved cancer, og fandt, at de observerede ændringer var reproducerbare ved qPCR, både i MGHU3 og KMS-11 MM linje behandlet med TAK1 knockdown og /eller FGF-receptor-inhibering som beskrevet ovenfor for microarray analyse (tabel 2). Den eneste undtagelse er GSTA1, som har meget lave niveauer af udtryk i MM celler. Endelig input af listen over de 13 gener i Ingenuity Systems Pathway Analysis Tool (IPA) resulterede i et enkelt gen-netværk (netværkstjeneste score 40) med et vigtigt knudepunkt omkring NFKB (figur 3). Disse resultater antyder en kritisk skæringspunktet mellem FGFR3 og TAK1 signalering, der kan påvirke NFKB-aktivering og dermed kræft patogenese i FGFR3-associerede cancere. En andet nav fokuseret omkring PI3K er i overensstemmelse med vores tidligere resultater, som viser en interaktion mellem FGFR3 og p85 regulatoriske underenhed af PI3K [37].

13 unikke FGFR3 og TAK1 afhængige gener (tabel 1) blev evalueret ved Opfindsomhed pathway Analysis (IPA) software, der producerer et enkelt netværk (netværk score på 40), der indeholder store knudepunkter på NFKB og PI3K. IPA molekylære former inkluderer: kompleks /gruppe (NFKB, PI3K), cytokin /vækstfaktor (IKBKG, SGK1), enzym (ACSL1, GSTA1, MGAT4A, PDXP, TNFAIP3, UBC), ion-kanal (SCNNIG), transkriptionel regulator (TEAD1, VGLL1), transportør (SLC6A8, SLC15A1, SLC15A2, SLC38A3), og andre (ARRB1, BAMBI, DFNA5, FSH, GST klasse A, HDGFRP2, INS1, Insulin, MT2A, PKC (r), PSCA, RPAIN, TRIM31, ZFAND5) . IPA Relationships: optrukne linjer angiver direkte interaktion; stiplede linjer angiver indirekte interaktion; fyldte pile angiver “handlinger på”; åbne pile angiver “translokerer til”; –