PLoS ONE: MicroRNA 135a blænder lymfeknudemetastase gennem nedregulering af rock1 i Early Gastric Cancer

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) spiller en afgørende rolle i mavekræft progression og metastase. Dette studie undersøgte rolle miRNA-135a i begyndelsen gastrisk cancer (EGC), herunder lymfeknude (LN) metastaser. Vi undersøgte sammenhængen mellem miRNA-135a udtryk og kliniske resultater i 59 patienter, som gennemgik kirurgi for EGC. Brug af gastriske cancercellelinier, udførte vi funktionelle og målgen analyser. miRNA-135a-ekspression blev nedreguleret i 33,9% af patienterne. Disse patienter viste en signifikant mere fremskredent stadium (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045) og højere LN metastaser (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014) end dem med opregulering af miRNA-135a udtryk. I en multivariat analyse, nedregulering af miRNA-135a var en uafhængig risikofaktor for LN metastaser (justerede odds ratio, 8,04; 95% konfidensinterval, 1,08-59,81; p = 0,042). Funktionelle analyser anvender mavekræft cellelinjer viste, at miRNA-135a undertrykt cellelevedygtighed, epitelial-mesenkymal overgang, celle invasion, og migration. Rock1 var et mål af miRNA-135a og dens udtryk var omvendt korreleret med den for miRNA-135a. Rock1 udtryk blev øget betydeligt i EGC patienter med LN metastaser end i dem uden LN metastaser. Vores resultater bekræfter tumor-undertrykkende rolle af miRNA-135a, og vise sin rolle i LN metastaser i EGC. miRNA-135a og sit mål gen

rock1

kan være nye terapeutiske og prognostiske mål for EGC

Henvisning:. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) MicroRNA 135a blænder lymfeknudemetastase gennem nedregulering af rock1 i Early Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10,1371 /journal.pone.0085205

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: 28 oktober, 2013; Accepteret: November 23, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af tilskud fra 1.110.532 til 3 fra National Cancer center, Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. HA er en PLoS ONE redaktionelle bestyrelsesmedlem og det ændrer ikke forfatternes overholdelse til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

mavekræft er stadig den næsthyppigste dødsårsag kræft på verdensplan, på trods af faldende forekomst og dødelighed i de udviklede lande [1 ].

I områder, herunder Korea og Japan, hvor screening for mavekræft udføres bredt, tidlig påvisning er ofte muligt. Fordi en øget hyppighed af tidlig påvisning af mavekræft kan føre til en forbedret prognose, har interesser i at forbedre patienternes livskvalitet og udnytte minimalt invasive behandlinger steget. Hos patienter med gastrisk cancer, lymfeknude (LN) metastase er en af ​​de vigtigste prognostiske faktorer, og den samlede forekomst af en LN metastase i begyndelsen gastrisk cancer (EGC) varierer fra 5 til 20% [2] – [4].

gastrektomi med LN dissektion betragtes som den standard behandling for mavekræft; imidlertid har 80 til 95% af patienter med EGC ikke kræve en LN dissektion hvis mavekræft er fuldstændig udskåret ved mindre invasive behandlinger, såsom endoskopisk resektion [5] – [7] eller minimalt invasiv kirurgi (

f.eks

, enkel kile resektion eller sentinel LN navigation kirurgi) [8] – [10]. Selvom undersøgelser af biologiske prognostiske og prædiktive markører for LN metastaser i EGC er blevet udført, findes der ingen prædiktive værktøjer til nodal metastase af EGC faktisk.

Flere undersøgelser har rapporteret, at dybden af ​​invasion, tumorstørrelse, og lymfe invasion er forbundet med LN metastaser i EGC [4], [11]. er blevet bestemt Men de fleste af disse faktorer efter endelig patologisk undersøgelse af resekterede væv, hvilket ikke er nyttig til at bestemme behandlingsstrategi.

MikroRNA’er (miRNA) er små ikke-protein-kodende RNA’er. Undersøgelser har vist, at ændringer i ekspression af miRNA bidrager til patogenesen af ​​cancere herunder gastrointestinal oprindelse [12] – [15].

miRNA har også vist sig at være anvendelige til at differentiere cancerceller og normale væv [ ,,,0],16], [17]. Desuden er miRNA udtrykkes forskelligt i hvert stadium af mavekræft carcinogenese [18]. miRNA-27 [19] og ZEB1-regulerede miRNA-200 familien [20] har vist at være relateret til fase af epitelial-mesenkymale overgang (EMT) i mavekræft. Derfor kan miRNA være forbundet med fremgangsmåden ifølge LN metastase i EGC. Blandt miRNA har miRNA-135a vist sig at være en tumor-undertrykkende miRNA, og dets ekspression nedreguleres i flere kræftformer herunder renalcellecarcinom [21] og lymfom [22]. Til gengæld, overekspression eller genskabelse af miRNA-135a fremmer apoptose og undertrykker proliferation af tumorceller gennem sine målgener c-myc [21] og JAK2 [22], hhv. I en

in vitro

studie, miRNA-135a undertrykt vandrende og invasive aktiviteter af gastriske kræftceller [23]. Men tumor undertrykkende rolle miRNA-135a i mavekræft er uklar.

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge sammenhængen mellem miRNA-135a udtryk og kliniske resultater i EGC patienter, herunder LN metastaser.

Materialer og metoder

Menneskelige vævsprøver og kliniske data

Fifty-ni voksne patienter diagnosticeret med EGC på National Cancer center, Korea, fra januar 2011 og til april 2013, var prospektivt inkluderet i denne undersøgelse. Disse patienter blev behandlet med en åben eller laparoskopi-assisteret gastrektomi med D1 + eller flere LN dissektion. Omfanget af LN dissektion fulgt anbefalingerne fra den japanske mavekræft Association [24]. Scenen efter operationen blev vurderet efter 7

th udgave af amerikansk fælles udvalg om kræft TNM [25]. Humane væv, herunder både gastrisk cancer og matchede normale væv fra hver patient blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Fra gennemgang af medicinske diagrammer, clinicopathologic karakteristika, herunder alder, køn,

Helicobacter pylori

status, tumor egenskaber, scene, og status for LN metastaser blev opnået og analyseret. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board of National Cancer Center, Korea (NCCNCS-11-445).

Cell kultur og transfektion

humant normalt gastrisk epitel celle linje HFE145 [26], [27] var en gave fra Dr. Hassan Ashktorab og Duane T. Smoot (Howard University, Washington, USA) og kommercielt tilgængelige gastrisk cancer cellelinjer AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668, og SNU719 blev opnået fra Korea cellelinje Bank (KCLB, Seoul, Korea). Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640-medier indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Blandt de gastrisk cancer cellelinjer, blev MKN28 og SNU668 cellelinjer valgt, fordi de sjældent udtrykker miRNA-135a, og YCC og KATOIII cellelinjer blev valgt, fordi de har en betydelig baseline udtryk for miRNA-135a (figur 1A). Transfektioner med miRNA-135a efterligner (Mirvana ™ miRNA efterligner, Ambion, Austin, TX, USA), en miRNA-135a-hæmmer (Mirvana ™ miRNA-hæmmer, Ambion, Austin, TX, USA), og rock1 siRNA (5′-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 ‘; UGBioneer, Seoul, Korea) i SNU668, YCC2, MKN28, og KATOIII cellelinjer blev udført under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX og Lipofectamine 2000 reagenser (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. MKN28, SNU668, YCC2, og KATOIII cellelinjer blev høstet to dage efter transfektion, og forskellige analyser blev udført.

(A) miRNA-135a udtryk, undersøgt ved real-time PCR-analyse, nedreguleres i gastrisk cancerceller sammenlignet med normale gastriske mucosa celler (HFE 145 celler). (B) Relativ miRNA-135a udtryk for tumorvæv i forhold til normale modstykker ved real-time PCR-analyse i henhold til patientens stadie.

* Patienter med mere fremskreden cancer (stadium IB eller større) viser signifikant nedreguleret miRNA- 135a ekspressionsniveauerne i tumorvæv sammenlignet med niveauer hos patienter med mindre fremskreden (stadie IA) kræft (gennemsnit 9,97 vs. 2,30, p = 0,009). (C) Relativ miRNA-135a ekspression af tumorvæv i forhold til normale modparter i realtids-PCR-analyse ifølge LN metastase status. Patienter med LN metastase show betydeligt nedreguleret miRNA-135a ekspressionsniveauer i tumorvæv (sammenlignet med tilsvarende normale væv) end patienter uden LN metastase (middelværdi 9,63 vs. 0,61, p = 0,002). * 7

th amerikanske fælles udvalg om kræft TNM mellemstationer.

RNA ekstraktion og miRNA kvantificering

Total RNA blev isoleret fra 13 cellelinjer og 59 gastriske kræftpatienters væv, henholdsvis ved anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til fabrikantens protokol. TaqMan universal PCR Master mix reagenser kit (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) blev anvendt. Amplifikation og detektion blev udført under anvendelse af en 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) med 40 cykler denaturering ved 95 ° C (15 sekunder) og annealing /forlængelse ved 60 ° C (60 sekunder). Dette blev efterfulgt af revers transkription ved 50 ° C i 30 minutter og denaturering ved 95 ° C i 10 minutter. For at kvantificere modne miRNA blev TaqMan miRNA tests kits (Applied Biosystems, Tokyo, Japan), der anvendes til påvisning af miRNA-135a og en kontrolgruppe miRNA (RNU6B).

Western blot-analyse

Protein var ekstraheret fra 13 cellelinjer og 59 EGC patienternes vævsprøver ved hjælp RIPA-buffer (Biosesang, Seoul, Korea), herunder en proteasehæmmer cocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA) ifølge producentens protokol. Dernæst blev Western blotting udført under anvendelse af anti-rock1 og anti-β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) antistoffer. Signaler blev detekteret med et ECL prime kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) i henhold til fabrikantens anvisninger.

celleproliferation assays

Celleproliferation blev målt ved anvendelse af en MTT assay. Celler blev udpladet i 96-brønds dyrkningsplader (3 × 10

3 celler per brønd) og transficeret med miRNA-135a efterligner efter to dages inkubation. Efterfølgende 200 pi MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) blev tilsat til hver brønd. Efter fire timers ekstra inkubation blev MTT opløsninger kasseres, 200 pi DMSO (Amresco, Solon, OH, USA) blev tilsat til hver brønd, og pladen blev rystet forsigtigt. Absorbans blev målt på en ELISA-læser (Moecular Devices, Sunnyvale CA, USA) ved en test bølgelængde på 570 nm. Salg

Cellecyklusanalyse

Celler blev udpladet i 60π dyrkningsplader og transficeret med miRNA -135a efterligner eller en miRNA efterligner negativ kontrol (efterligner-NC). Disse celler blev høstet ved trypsinisering og fikseret i 70% ethanol i mindst to timer ved -20 ° C. Cellepellets blev vasket med koldt phosphatbufret saltvand og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur i PI /RNase Staining Buffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Efter farvning blev prøver analyseret med et FACScan flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og 10.000 hændelser blev indsamlet per prøve. Data fra flowcytometri blev analyseret ved hjælp af Cell Quest software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Analyser

Trans-filter migration og invasion

Cellerne blev transficeret med miRNA-135a efterligner , miRNA-135a inhibitorer, rock1 siRNA, og rock1 siRNA negativ kontrol (scRNA) i en dag og derefter overført til det øvre kammer i transwell plade overtrukket med 0,5 mg /ml collagen type i (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) og en 1:15 fortynding af Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, USA). RPMI 1640 med 10% FBS og 1% antibiotika (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) blev tilsat til det nederste kammer, og pladen blev inkubation i 20 timer. Migrering og invaderende celler blev kvantificeret ved hjælp af hæmatoxylin og eosin farvning.

De plasmidkonstruktioner luciferase reporter

vildtype 3’UTR af rock1 indeholder bindingssteder for miRNA-135a blev opformeret ved hjælp gDNA fra SNU668 celler som en skabelon. De korrelerede mutant konstruktioner blev skabt ved at mutere frø regioner i miRNA-135 bindingssteder. Både vildtype og mutant 3’UTR blev klonet i nedstrøms for luciferasegenet i en pGL3 kontrolvektor. Konstruktionerne blev verificeret ved sekventering.

Luciferaseassayreagens

luciferaseassays blev udført i SNU668 og YCC2 celler. SNU668 og YCC2 celler blev transficeret med hver af plasmiderne (tom vektor [MOCK], rock1 3’UTR vildtype [WT], og rock1 3’UTR mutant [MUT], som miRNA-135a-bindingssted) sammen med miRNA- 135a efterligner, miRNA-135a inhibitorer og negativ kontrol RNA i 24-brønds plader. To dage efter transfektion blev cellerne høstet og lyseret. Luciferaseassays blev udført på lysaterne ved hjælp af en luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA). Luciferaseaktivitet blev normaliseret til p-galactosidase.

immunhistokemisk farvning

immunhistokemisk (IHC) farvning blev udført for repræsentative 20 tilfælde fra rock1 lav og høj udtryk grupper. Antigen genfinding blev udført med varmebehandling i 30 minutter i pH 8,0 Tris-EDTA-buffer (CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) ved 95 ° C. Væv objektglas blev inkuberet ved 42 ° C i 30 minutter med anti-rock1 mAb (ab134181, klon EPR638Y, kanin monoklonale, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, USA). Negative kontroller blev brugt på samme måde med ikke-immuniseret kanin IgG. Resultaterne blev fortolket af en erfaren patolog (MC Kook).

Statistisk analyse

Skaler data er givet som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Chi-offentlig Fishers eksakte test og Mann-Whitney U test blev anvendt til sammenligning kategoriske variabler og kontinuerlige variabler hhv. The Pearson korrelationskoefficienten blev anvendt til sammenligning af genekspressionen mønster mellem miRNA-135a og rock1. En multivariat logistisk regressionsmodel blev anvendt til bestemmelse uafhængige faktorer forbundet med LN metastase. Kovariater, der var betydelig hjælp chi-square eller Fishers eksakte test (

P

0,05), blev indgået den logistiske regressionsmodel. Alle data blev analyseret ved hjælp af STATA 12.1 (Stata Corp, College Station, TX, USA). En

P

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

miRNA-135a ekspressionsniveauerne er forbundet med progression og LN metastaser i EGC

En tidligere undersøgelse viste, at miRNA-135a udtryk er nedreguleret i gastrisk cancer cellelinjer [23]. Ved at bruge QRT-PCR, vi fandt også, at miRNA-135a ekspression nedreguleres i forskellige gastriske cancercellelinier sammenlignes med den i en normal gastrisk epitelcellelinie (figur 1A).

Korrelationen mellem miRNA-135a udtryk og kliniske resultater i mavekræft er ikke undersøgt. Derfor har vi målte miRNA-135a ekspressionsniveauerne i primær gastrisk kræft og deres tilsvarende niveauer i normale væv fra 59 patienter med EGC. Ned- og opregulering af gener i tumorvæv i forhold til normale væv blev defineret som forholdet mellem tumor og normalt væv genekspressionsniveauer af 1,0 og . 1.0, henholdsvis

Omvendt til resultatet af

in vitro

eksperiment, kun 20 (33,9%) af 59 patienter med EGC udstillet nedregulering af miRNA-135a udtryk. Men disse patienter viste signifikant en mere fremskreden (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045; rå odds ratio [OR], 2,11; 95% konfidensinterval [CI], 1,08-4,10) og en højere LN metastaser (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014, rå OR, 2,73; 95% CI, 1,50-4,98) end dem med opregulering af miRNA-135a udtryk (tabel S1). Følsomhed og specificitet af miRNA-135a udtryk status for forudsigelse af LN metastaser var 75,0% og 72,5%, hhv. Desuden patienter med mere fremskreden (figur 1B) eller LN metastaser (figur 1C) viste en signifikant lavere andel af tumor til normale miRNA-135a ekspressionsniveauerne end dem med stadium IA eller uden LN metastaser. En multivariat logistisk regressionsanalyse viste også, at miRNA-135a nedregulering blev uafhængigt associeret med LN metastaser (justeret OR, 8,04; 95% CI, 1,08-59,81; p = 0,042; tabel 1). Kollektivt, disse resultater tyder på, at nedregulering af miRNA-135a udtryk kan være forbundet med mavekræft progression herunder LN metastaser.

miRNA-135a undertrykker mavekræft cellelevedygtighed, EMT, migration og invasion

for yderligere at undersøge sammenhængen mellem miRNA-135a og kliniske resultater, vi udførte funktionelle assays for cellelevedygtighed, cellecyklus, EMT, migration og invasion i gastrisk cancer cellelinjer. Overekspression af miRNA-135a af miRNA-135a efterligner undertrykte signifikant cellelevedygtigheden (figur 2A) og øgede subdiploid del af SNU668 celler, en cellelinie, som sjældent udtrykker miRNA-135a (figur 2B), hvilket antyder den forøgede apoptose af gastriske cancerceller. Men undertrykkelse af miRNA-135a af miRNA-135a inhibitorer inducerede hverken en forøgelse af cellernes levedygtighed eller en subdiploid fraktion fald i YCC2 celler, en cellelinie, der udtrykker betydelig miRNA-135a (figur 2A og 2B). Vi undersøgte også sammenhængen mellem miRNA-135a udtryk og EMT i gastriske kræftceller, fordi miRNA-135a nedregulering var en uafhængig risikofaktor for LN metastaser i EGC patienter (tabel 1). Forøget ekspression af miRNA-135a var forbundet med suppression af EMT og viste en stigning i ekspressionen af ​​E-cadherin og undertrykkelsen af ​​både N-cadherin og Slug i SNU688 celler. I modsætning hertil hæmning af miRNA-135a-ekspression resulterede i aktivering af EMT herunder suppression af E-cadherin ekspression og opregulering af både N-cadherin og Slug ekspression i YCC2 celler (figur 2C). I vurderingen for funktionelle konsekvenser, overekspression af miRNA-135a af miRNA-135a efterligner betydeligt undertrykt migrationen og invasion evner SNU668 gastriske kræftceller (Figur 2D). Omvendt blokade af miRNA-135a af miRNA-135a hæmmere signifikant øget migration og invasion af YCC2 mavekræft celler (Figur 2E). Samlet set vores resultater antydede, at miRNA-135a er en tumor undertrykkende regulator for mavekræft spredning og metastaser.

(A) opregulering af miRNA-135a induceret af miRNA-135a efterligner undertrykker mavekræft cellelevedygtighed i SNU668 cellelinie, en cellelinie, som sjældent udtrykker miRNA-135a (p = 0,012), hvorimod miRNA-135a inhibitorer sjældent påvirke cellernes levedygtighed i YCC2 cellelinje, en cellelinie, som i det væsentlige udtrykker miRNA-135a. (B) opregulering af miRNA-135a af miRNA-135a efterligner øger subdiploid brøkdel af DNA, som bestemt ved flowcytometri analyse, hvilket tyder på øget apoptose i SNU668 celler. (C) Ved tilstedeværelse af miRNA-135a efterligner, RT-PCR-analyse viser, at SNU668 celler har øget mRNA ekspressionen af ​​E-cadherin og undertrykke mRNA ekspressionen af ​​både N-cadherin og Slug. Omvendt i nærvær af miRNA-135a inhibitorer, Vis YCC2 celler faldt mRNA ekspression af E-cadherin og forøget mRNA-ekspression af både N-cadherin og Slug i RT-PCR-analyse. (D) Overekspression af miRNA-135a hjælp miRNA-135a efterligner undertrykker migration og invasion af SNU668 celler betydeligt. (E) Hæmning af miRNA-135a hjælp miRNA-135a-hæmmere øger vandrende og invasive celler i YCC2 celler. De viste resultater er gennemsnit ± SD af mindst tre eksperimenter. NC, negativ kontrol.

rock1 er et target-gen af ​​miRNA-135a i mavekræft

For at belyse de mekanismer, der ligger til grund virkningerne af miRNA-135a på de kliniske resultater, vi søgte formodede mål ved at bruge Targetscan 6.2 databasen. Af 718 bevarede mål, valgte vi mål med højeste score, hvis nedregulering kan resultere i øget cancer celleproliferation, migration og invasion. Vi fandt, at rock1 kan være et målgen af ​​miRNA-135a fordi inhibering eller undertrykkelse af rock1 er blevet rapporteret at fremme apoptose og til at undertrykke migration, invasion og proliferation af cancerceller herunder gastrisk cancer [28] – [30]. Targetscan analyse viste, at 3’UTR-sekvensen af ​​rock1 har én mulig bindingssted for miRNA-135a (figur 3A). For at bekræfte, om rock1 er et mål for miRNA-135a, blev en luciferaseanalyse udføres. Luciferase 3’UTR beskrevne konstruktioner i fremgangsmåder sektion blev co-transficeret ind SNU688 celler med miRNA-135a efterligner og ind YCC2 celler med miRNA-135a-inhibitorer. Vi konstruerede også rock1 3’UTR MUT ved punktmutation C → G i den mulige bindingssted (figur 3A). Den relative luciferase aktivitet rock1 3’UTR WT blev øget betydeligt i nærværelse af miRNA-135a-hæmmere (figur 3B). Omvendt blev denne aktivitet faldt betydeligt i tilstedeværelsen af ​​miRNA-135a efterligner (figur 3C). I gastrisk cancer cellelinjer, miRNA-135a og rock1 viste en modsat udtryk mønster. Western blot analyse viste, at rock1 ekspression blev nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​miRNA-135a efterligner, og opreguleret i nærvær af miRNA-135a-inhibitorer (figur 3D og 3E). Taget sammen indikerer disse resultater, at miRNA-135a undertrykker rock1 ekspression ved direkte målretning sin 3’UTR.

(A) 3’UTR-sekvensen af ​​rock1 har én mulig bindingssted for miRNA-135a, som bestemt ved Targetscan analyse. 3’UTR-konstruktioner for rock1 WT og MUT er vist. (B) Ved tilstedeværelse af miRNA-135a-hæmmere, relativ luciferaseaktivitet af rock1 3’UTR WT er væsentligt øget sammenlignet med rock1 3’UTR MUT i SNU668 celler (p = 0,035). (C) Tværtimod i overværelse af miRNA-135a efterligner den relative luciferase aktivitet rock1 3’UTR WT er væsentligt reduceret (p = 0,043), mens den relative luciferase aktivitet rock1 3’UTR MUT er ikke faldet i den YCC2 cellelinie. (D) Western blot analyse viser, at overekspression af miRNA-135a hjælp miRNA-135a efterligner undertrykker rock1 proteinekspression i MKN28 og SNU688 gastrisk kræftceller, som er cellelinjer, der sjældent udtrykker miRNA-135a. (E) Inhibering af miRNA-135a forbundet med forøget rock1 proteinekspression i YCC2 og KATO III gastrisk cancerceller, som er cellelinier, som i det væsentlige udtrykker miRNA-135a. De viste resultater er gennemsnit ± SD af mindst tre eksperimenter. WT, vildtype; MUT, mutant; NC, negativ kontrol.

Angivelse af rock1 er omvendt korreleret med den for miRNA-135a hos patienter med EGC

Analyse af 59 patienter med EGC viste, at ekspressionsniveauer af rock1 havde en signifikant negativ korrelation med de miRNA-135a (r = -0,697, p 0,001; figur 4A). Desuden patienter med opregulering af miRNA-135a udtryk, havde signifikant lavere niveauer af rock1 proteinekspression end dem med nedregulering af miRNA-135a (gennemsnitlig tumor til normal ratio, 0,81 vs. 1,55, p 0,001; figur 4B) .

(A) miRNA-135a udtryk blev målt ved real-time PCR-analyse. Den rock1 proteinniveauet blev vurderet ved anvendelse western blot analyse og kvantificeret under anvendelse af densitometrisk metode. I 59 patienter med tidlig mavekræft, udtryk for rock1 viser en signifikant negativ korrelation med den for miRNA-135a (r = -0,697, p 0,001). (B) Western blot analyse viser, at patienter med nedreguleret miRNA-135a udtryk har signifikant højere rock1 protein-ekspression i tumorvæv sammenlignet med udtryk i tilsvarende normale væv (p 0,001).

rock1 er forbundet med LN metastaser i EGC og er involveret i mavekræft celle migration og invasion undertrykt af miRNA-135a

for yderligere at vurdere sammenhængen mellem rock1 udtryk og kliniske resultater i EGC, vi analyserede mønstre af rock1 udtryk i henvisning til LN metastase status inkluderede patienter. Patienter med LN metastase havde en signifikant højere ekspression af rock1 protein end dem uden LN metastase (gennemsnitlig tumor til normale forhold, 1,86 vs. 0,93, p = 0,007, figur 5A). Endvidere niveauer af rock1 IHC-farvning svarede til dem af rock1 ekspression i Western blot-analyse (

dvs.

, patienter uden LN metastase havde svage ICH farvede mønstre [Figur 5B], men dem med LN metastase havde stærkt positive IHC-farvning [Figur 5C]).

(A) Western blot-analyse af 59 tidlige mavecancerpatienter viser, at patienter med LN metastase har signifikant højere rock1 proteinekspression end patienter uden LN metastase (p = 0,007). Repræsentative mikroskopiske billeder af tumor sektioner med immunhistokemisk farvning (original forstørrelse × 100) viser, at (B) tidlige gastrisk kræftpatienter uden LN metastaser har ingen rock1 udtryk i tumorvæv, men (C) dem med LN metastaser har stærke rock1 udtryk inden for den nukleare membran og cytoplasma tumorvæv. (D) rock1 siRNA undertrykker migration (p 0,001) signifikant og invasion (p = 0,002) i SNU668 gastriske cancerceller. (E) rock1 proteinekspression forøges ved behandling med miRNA-135a-inhibitorer og faldt ved behandling med rock1 siRNA, og er forbundet med en øget miRNA-135a niveau i YCC2 gastrisk cancerceller, hvilket antyder, at rock1 protein ekspressionsmønstre er omvendt korreleret med de af miRNA-135a udtryk. (F) Når YCC2 celler behandles med miRNA-135a inhibitorer, celle invasion og migration er ens eller endog øget i forhold til kontroller. Rock1 siRNA eller kombineret rock1 siRNA og miRNA-135a inhibitorer falde cellevandring (p = 0,003) og invasion (p = 0,017). Disse tyder på, at rock1 udligner de undertrykkende effekter af både migration og invasion, der er fremkaldt af miRNA-135a. De viste resultater er gennemsnit ± SD af mindst tre eksperimenter. LN, lymfekirtel; NC, negativ kontrol.

Endelig, for at undersøge, om de undertrykte migrations- og invasion evner knyttet til miRNA-135a opregulering observeret i gastrisk cancer cellelinjer var resultatet af rock1 opregulering, vi udførte migration og invasion assays under anvendelse af gastrisk kræft cellelinjer transficeret med specifikke rock1 siRNA. Rock1 siRNA undertrykt vandrende og invasive aktiviteter i SNU668 celler (Figur 5D). I YCC2 celler co-transficeret med miRNA-135a hæmmere og rock1 siRNA (figur 5E), viste migration og invasion analyser, hæmning af rock1 af siRNA markant svækkede de forbedrer vandrende og invasive virkninger af miRNA-135a nedregulering af miRNA-135a-hæmmere (figur 5F).

Kollektivt antyder disse resultater, at rock1 er forbundet med LN metastase i EGC patienter, og at dette skyldes forøget rock1 ekspression i forbindelse med miRNA-135a nedregulering. Derfor kan rock1 være involveret i miRNA-135a-undertrykt mavekræft metastaser.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at miRNA-135a havde tumor undertrykkende roller i mavekræft. Hos patienter med EGC, nedregulering af miRNA-135a var en uafhængig risikofaktor for LN metastaser. I gastrisk kræftceller, opreguleret miRNA-135a undertrykt gastrisk carcinogenese ved at undertrykke celleproliferation, EMT, og metastase. Desuden er vi også identificeret et nyt mål gen af ​​miRNA-135a, rock1, der var forbundet med LN metastase i mavekræft.

Hos patienter med EGC, evaluering af LN metastaser før behandling er et vigtigt skridt i fastlæggelsen af behandlingsstrategier. Mindre invasive behandlinger, såsom endoskopisk resektion [5] – [7] eller sentinel LN navigation kirurgi [9], [10] kan være muligt i EGC patienter uden LN metastase. Disse behandlingsmetoder har forbedret patienternes livskvalitet i forhold til senkomplikationer forbundet med standard kirurgiske behandlinger, herunder dumping syndrom, vægttab, og reflux symptomer [31]. Derfor er mere specifikke og følsomme biomarkører forpligtet til at forudsige status LN metastaser hos patienter med EGC. I den foreliggende undersøgelse miRNA-135a nedregulering var en uafhængig faktor for LN metastase, og forudsigelse værdi af miRNA-135a ekspressionsstatus var relativt høj med en følsomhed på 75% og en specificitet 73%. Selv er behov for yderligere valideringsstudier viste disse resultater, at måling af miRNA-135a niveauer forud for fastlæggelsen af ​​planen for EGC patienter behandling kunne være en nyttig test til at forudsige LN status.

Interessant miRNA-135a er blevet rapporteret at være tumor undertrykkende og oncogen. Overekspression af miRNA-135a er blevet associeret med undertrykkelse af tumor spredning og vækst i renalcellecarcinom [21] og med øget apoptose og bedre sygdomsfri overlevelse i lymfom [22]. I modsætning hertil blev miRNA-135a involveret i kolorektal cancer progression [32] og i øget bryst celle migration og invasion [33]. I nærværende undersøgelse blev miRNA-135a vist sig at være en tumor undertrykkende miRNA, hvilket er i overensstemmelse med resultatet af en tidligere undersøgelse [23]. Specielt, jo højere ekspressionen af ​​miRNA-135a undertrykt flere trin af gastrisk carcinogenese herunder proliferation, migration og invasion. Derudover fandt vi også, at miRNA-135a kan undertrykke EMT, der har rapporteret at være forbundet med indledningen af ​​flertrins proces med carcinogenese og fremme af metastaser [34], [35]. Forud for den foreliggende undersøgelse har foreningen mellem miRNA-135a og EMT ikke undersøgt, om end tidligere undersøgelser har vist, at miRNA såsom miRNA-27 [19], miRNA-200 familie [20], miRNA-7 [36] , og miRNA-1228 [37] undertrykke EMT gennem deres egne målgener i mavekræft. Tilsammen miRNA-135a er en tumor undertrykkende miRNA i mavekræft.

En tidligere undersøgelse analyserer 353 humane mavekræft væv viste, at ekspressionsmønstre af miRNA er mangfoldige, og at nogle miRNA var forbundet med progression og prognose i gastrisk kræft [14]. I undersøgelsen blev miRNA-135a er klassificeret som en onkogene miRNA i gastrisk kræft baseret på resultaterne af DNA-microarray-analyser. Men i en nylig [23] og vores undersøgelse, miRNA-135a fungerede som en tumorsuppressor trods den høje frekvens af patienter med miRNA-135a opregulering.