PLoS ONE: Overekspression af PIN1 Forbedrer Cancer Vækst og aggressivitet med cyclin D1 Induktion i EBV-associerede nasopharyngeal Carcinoma

Abstrakt

Baggrund

nasofaryngealt karcinom (NPC) er en ejendommelig Epstein Barr virus ( EBV) associeret malignitet, der er fremherskende i Sydøstasien. Peptidyl-prolyl

cis-trans

isomerase NIMA-interagerende 1 (PIN1) isomeriserer specifikke phosphorylerede aminosyrerester, hvilket gør det en vigtig regulator i celle overlevelse og apoptose. I denne undersøgelse undersøgte vi det bidrag, som PIN1 i NPC tumorigenese og PIN1 potentielle rolle som et terapeutisk mål.

Metoder

udtryk for PIN1 blev undersøgt i et panel af NPC-cellelinjer, xenografter og primære tumorer. De funktionelle roller PIN1 i NPC celler blev belyst af knockdown og overekspression af PIN1 i

in vitro

in vivo

nøgne mus modeller af siRNA og Lenti-viral transfektion, hhv. De antitumor virkninger af PIN1 hæmmeren Juglone i NPC celler blev også evalueret.

Resultater

Vi afslørede konsekvent overekspression af PIN1 i næsten alle EBV-associerede NPC cellelinjer, xenografter og primære tumorer. PIN1 suppression var stand til at inhibere cyclin D1-ekspression og aktivering af caspase-3 i NPC-celler. Det positivt reguleret NPC celleproliferation, kolonidannelse og forankringsuafhængig vækst. Hæmningen af ​​PIN1 undertrykte tumorvækst

in vitro

in vivo

.

Konklusioner

Denne undersøgelse viser onkogene rolle PIN1 i NPC tumorigenese, og viser, at dets overekspression kan forbedre tumorcellevækst via opregulering af cyclinD1. Vores resultater præge udviklingen af ​​nye behandlinger rettet mod PIN1 for NPC patienter

Henvisning:. Xu M, Cheung CC-M, Chow C, Lun SW-M, Cheung ST, Lo KW (2016) Overekspression af PIN1 Forhøjer Kræft vækst og aggressivitet med cyclin D1 Induktion i EBV-associerede nasofaryngealt karcinom. PLoS ONE 11 (6): e0156833. doi: 10,1371 /journal.pone.0156833

Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, FRANCE

Modtaget: 8. oktober, 2015; Accepteret: 21. maj 2016 Udgivet: 3 juni 2016

Copyright: © 2016 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra det kinesiske University of Hong Kong (Focus Investigation Scheme-A), og Hong Kong Research Grants Council – GRF ( 470.413, 470.312, 471.211), CRF (CUHK8 /CRF /11R), AOE NPC (AOE /M-06/08), Tema-Based Research Scheme (T12-403 /11 og T12-401 /13-R).

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

nasofaryngealt karcinom (NPC) er en karakteristisk form for hoved og hals karcinom, der opstår fra epitel celler, der dækker overfladen og foring af næsesvælget. Denne malignitet udviser en klar etnisk og geografisk fordeling, og er især udbredt i det sydlige Kina, hvor næsten alle tilfælde er nonkeratinizing carcinomer forbundet med EBV infektion [1, 2]. Denne forening med EBV, foruden eksistensen af ​​multiple genetiske afvigelser [3], forøger kompleksiteten af ​​NPC forskning. De dårlige resultater ved konventionel kemo-strålebehandling til patienter med fremskredne loco-regional sygdomme og fjernmetastaser udgør en terapeutisk udfordring [4]. I betragtning af den høje tilbagefald og metastase satser, er det af yderste vigtighed, at der søges alternative terapeutiske metoder ud og udvikles.

Kræft udvikling indebærer en kompleks række af afvigende signalveje, der fundamentalt resulterer i en ukontrolleret celledeling styret af prolin- rettet phosphorylering [5]. PIN1 er en særdeles konserveret enzym, der binder til og isomeriserer specifik phosphoryleret serin- eller threoninrester foregående prolin (Ser /Thr-Pro) bindinger. Det inducerer konformationelle ændringer i visse proteiner, hurtige ændringer i deres egenskaber, herunder katalytiske aktiviteter, subcellulær lokalisering, protein-protein interaktioner og omsætningshastighed [5, 6]. Således er PIN1 betragtes som en vigtig regulator i cellulære processer, såsom cellecyklus regulering, cellesignalering, transskription og splejsning, DNA-skader responser, celle overlevelse og resistens [5, 7, 8].

Ud fra betydningen af ​​PIN1 ved modulering af aktivering af forskellige signalmolekyler, har det også vist sig at stabilisere virale oncoproteiner såsom den humane T-celle-leukæmivirus type i Tax protein [9]. Desuden har PIN1 blevet rapporteret at være involveret i driften af ​​flere vira, herunder Kaposis sarkom-associeret herpesvirus [10], human immundefekt virus type I [11, 12] og hepatitis C-virus [13]. Interessant nok er det også blevet påvist at vekselvirke med EBV-encode protein [14], selv om information om dets rolle i EBV-associeret malignitet har vist knappe.

Denne undersøgelse har til formål at belyse den rolle PIN1 i udviklingen af NPC, der konsekvent er forbundet med EBV infektion. Ved at undersøge effekten af ​​PIN1 udtryk på EBV-associeret NPC, afslørede vi dens bidrag til tumorcellevækst og tumorigenese.

Materialer og metoder

cellelinjer, xenografter og primære tumorer

Tre NPC cellelinjer C666-1 (et naturligt EBV-associeret, udifferentieret type NPC) [15], HK1 (en EBV-negativ, veldifferentieret type NPC) [16], HK1-EBV (HK1 inficeret med EBV) [17], udødeliggjort normale nasofarynx epiteliale cellelinier (NP69 og NP460) [18], der er etableret i vores laboratorier blev anvendt i denne undersøgelse. Den cervikale cancercellelinie HeLa blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). To EBV-positive NPC xenografter-xeno-666 [15], xenotransplantation-2117 [19], C15 og C17 [20] var også inkluderet. Xen-666 og xeno-2117 blev oprettet af vores NPC gruppe som tidligere [15, 19] beskrevet. C15 og C17 blev opnået fra Prof. Pierre Busson som etablerede disse xenografter [20]. For immunhistokemiske (IHC) farvning undersøgelse blev 70 arkivers formalin-fikseret paraffin indlejrede (FFPE) primære NPC biopsier rekrutteret fra vævet bank Institut for Anatomisk og Cellulær patologi på Prince of Wales Hospital, Den kinesiske University of Hong Kong (CUHK ). Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Clinical Research etiske komité for CUHK. Alle prøver blev histologisk evalueret som udifferentierede eller dårligt differentierede carcinomer og bekræftet at være EBV-positive, som bestemt af EBER

in situ

hybridisering [21]. Patienternes egenskaber er vist i tabel 1.

transfektion og medicinsk behandling

HK1, HK1-EBV, C666-1 og HeLa-celler blev dyrket i RPMI1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% L-glutamin (Life Technologies). De NP69 celler blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium (KSFM) med bovine hypofyse ekstrakter og rekombinant epidermal vækstfaktor (Invitrogen). Alle cellerne blev inkuberet i en fugtig atmosfære med 5% CO

2 ved 37 ° C.

To Lyddæmper Vælg validerede siRNA’er rettet mod PIN1 (siPin1 544 og siPin1 545) og universel negativ kontrol siRNA (Life Technologies) blev transient transficeret ind C666-1 under anvendelse af lipofectamin

TM 2000 transfektionsreagens (Invitrogen) ifølge producentens protokoller. Celler blev opsamlet ved angivne tidspunkter til yderligere analyse. MG132 (Calbiochem) blev anvendt til HK1 og NP69 celler (på 10 og 15 uM og 5 og 10 uM, henholdsvis) at undersøge proteasomet nedbrydning af PIN1. Den PIN1 inhibitoren Juglone (Calbiochem) blev anvendt til at undersøge virkningen af ​​PIN1 inhibering på C666-1 celler (ved 2, 4, 6 og 8 uM). Behandlede celler blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. For at bestemme IC50 på Juglone blev cellerne podet i 96-brønds plader og behandlet med forskellige juglone doseringer (fra 0,03 til 20 uM) i 24 timer. Cellernes levedygtighed blev derefter bestemt ved en WST-1 analysen.

Etablering stabile pin1-overekspression cellelinjer

pCDH og pCDH-PIN1 plasmider var en gave, generøst tilvejebragt af Dr. Roberta Pang, Institut for Kirurgi, The University of Hong Kong. En lentiviral system blev anvendt til at etablere den stabile PIN1-overudtrykt NP69 cellelinje. Den pCDH lentiviral vektor blev pakket ved hjælp af den tredje generation lentivirus-system, i henhold til Lenti Startsæt producentens protokoller (System Biosciences). Viral supernatant (dyrkningsmedier) blev høstet fra 293TN producentceller 48 timer efter transfektion. Den virus (med en pCDH eller pCDH-PIN1 vektor og 10 ug pPACKH1-plasmid mix) blev opsamlet og transduceret med TransDuxand ind NP69 celler. PIN1 ekspression blev bekræftet ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) og Western blotting. Grøn fluorescensprotein (GFP) reporter-ekspression blev visualiseret under fluorescensmikroskop for at sikre tilstedeværelsen af ​​det transducerede DNA.

revers transkription (RT) og kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR)

RNA-prøver fremstillet af TRIZOL og phenol-chloroformekstraktion blev underkastet revers-transkription under anvendelse MultiScribe revers transkriptase (Invitrogen). Det opnåede cDNA blev anvendt til real-time qPCR via SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) ifølge producentens protokoller. Primerne anvendt i denne undersøgelse er anført i tabel 2. PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems). Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer. Udtrykket af målgener blev normaliseret mod husholdning gen β-actin ved hjælp af 2

[- ΔΔCT]. Metode

Western blotting

De proteinprøver blev adskilt i henhold til deres størrelser efter elektroforese, og derefter elektro-overført til en nitrocellulosemembran under anvendelse af et Bio-Rad Trans-Blot-celle. Nitrocellulosemembranen blev inkuberet med primære antistoffer natten over i 5% fedtfri mælk eller 5% bovint serumalbumin. Membranen blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer. Målproteinerne blev påvist ved kemiluminescerende substrater (GE Life Science) og det emitterede signal blev detekteret på røntgenfilm (Kodak). Membranerne blev probet med antistoffer mod human PIN1 (Calbiochem), Actin (Santa Cruz), cyclin D1 (Lab Vision), β-catenin, c-Jun, c-jun (Ser73) og c-jun (Ser63) (cellesignalering ).

immunhistokemisk farvning

De FFPE prøver blev sektioneret (4 um), de-paraffinized og rehydreret til efterfølgende immunfarvning. Efter antigen-genvinding, var endogen biotin aktivitet blokeret af normalt bovint serum og sektionerne blev inkuberet i primære antistoffer (anti-PIN1, Calbiochem) i et fugtigt kammer. HRP-mærket sekundært antistof blev anvendt til afsnittene og endelig blev 3,3′-diamino-benzidin (DAB) substrat anvendt til farveudvikling. PIN1 ekspression og lokalisering blev visualiseret med rødt og nucleuses blev modfarvet med hematoxylin, som forekom blå. Objektglassene blev derefter dehydreret og monteret med Permount mounting medium (Fisher Scientific).

Caspase-3-aktivitet assay

Cellen apoptose af behandlede og ikke-behandlede celler blev påvist under anvendelse af CaspACEAssay

TM System ifølge fabrikantens protokoller (Promega). Brønde i dubletter indeholder blank (ingen celle ekstrakt), negativ kontrol (uddrag fra ubehandlede celler), induceret apoptose (uddrag fra pin1 inhibitor-behandlede celler) og celler behandlet med caspaseinhibitor (uddrag fra PIN1 inhibitor- og Z-VAD-FMK den caspaseinhibitor-behandlede celler) blev inkluderet i forsøgene. Forsøgene blev udført in triplo og absorbansen af ​​farverne udviklet blev målt ved en bølgelængde på 405 nm ved en Perkin Elmer 1420 Multilabel Counter Victor 3 (Perkin Elmer). Caspase-specifik aktivitet blev beregnet i overensstemmelse med producentens retningslinier.

WST-1 og BrdU-assays Salg

celleproliferation reagens WST-1 (Roche) blev anvendt til at bestemme hastigheden af ​​celleproliferation i treated- og ikke-behandlede celler. De behandlede celler blev podet i en 96-brønds plade med en tæthed på 3000-8000 celler pr. Cellelevedygtighed blev estimeret for hver 24 timer ved WST-1, kontinuerligt i 5 dage. Absorbansen i hver brønd blev målt ved en bølgelængde på 450 nm og normaliseret ved anvendelse af en bølgelængde på 690 nm, detekteres af Victor 3 (Perkin Elmer). Celleproliferation blev også målt ved DNA indarbejdelse inden prolifererende celler ved anvendelse af BrdU-assay (celleproliferation ELISA, BrdU kolorimetrisk Kit, Roche).

forankringsuafhængig vækst assay

behandlede og ikke -behandlede celler blev udpladet i blød agar (base agarose: 1,8% agarose i KSFM; top agarose: 0,9% agarose forblandes med celler; 2 mL overlejring KSFM medium) for at evaluere deres vækst i en forankringsuafhængig måde. Pladerne blev inkuberet ved 5% CO

2 ved 37 ° C i en måned. Kolonierne blev visualiseret under anvendelse af 0,1% p-iodonitro tetrazolium violet (INT) farvning (Sigma-Aldrich), og derefter talt.

Kolonidannelse assay

Den behandlede og ikke-behandlede celler blev podet på 8×10

3 celler per brønd (C666-1) eller 1X10

3 celler per brønd (NP69) i 6-brønds plader. Cellerne blev holdt ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO

2 for 21-28 dage. De dannede kolonier blev fikseret med methanol og visualiseret med blåt hjælp Giemsa (Sigma-Aldrich) farvning. Kolonierne indeholder mere end 50 celler blev talt.

In vivo

tumorgenicitet

For at belyse

in vivo

tumorigen effekt af PIN1, NP69 celler (behandlet med siRNA’er af PIN1 eller med vektorkontrol) blev subkutant inokuleret i flankerne af BALB /c nøgne mus (nu /nu) (4 mus pr gruppe). Alle mus blev bedøvet med 2,2,2-tribromethanol (Avertin) før inokulering. Matrigel (BD Bioscience) blev anvendt i inokulering fremgangsmåde til NP69. Musene blev inspiceret dagligt for tumordannelse og størrelserne af tumorerne dannede blev registreret. For at bestemme den anti-tumor effekt af PIN1 inhibitor

in vivo

, Juglone (0 mg /kg, 0,5 mg /kg, 1,5 mg /kg) blev injiceret intraperitonealt i nøgne mus implanteret med C666-1 luciferase celler, når tumorerne havde nået deres passende størrelser. Tumorstørrelse blev registreret dagligt, og luciferase salt blev injiceret i nøgne mus på dag 0, 6 og 8 til at overvåge ændringer i tumorstørrelse via en IVIS

TM 100 Imaging-system. Alle musene blev aflivet ved afslutningen af ​​forsøgene ved cervikal dislokation, og tumorerne blev bevaret til yderligere analyse. Ingen mus syg, døde eller påkrævet tidlig afslutning i løbet af denne undersøgelse. Etisk godkendelse blev opnået fra University dyreforsøg etiske komité (AEEC), CUHK, og dyret licensen blev godkendt af Hongkongs regering, Department of Health.

Luciferase reporter assay

C666 -1 celler ved 60% konfluens i pladen med 96 brønde blev co-transficeret med FR-TK-Luc plasmid, PIN1 siRNA og reporterplasmid. Efter 48 timers transfektion blev cellerne lyseret med en 1X passiv lysepuffer (Promega). Lysaterne blev derefter overført til en 96-brønds plade og luciferaseaktiviteter blev analyseret under anvendelse af Dual Luciferase Reporter Kit (Promega) ifølge fabrikantens protokoller. Luciferase-signalet blev målt ved Victor 3 (Perkin Elmer) med eller uden automatisk injektioner. Resultaterne blev udtrykt som forholdet mellem Firefly luciferaseaktivitet at Renilla luciferaseaktivitet.

signalvejen matrix

A Cancer 10-Pathway Reporter Luciferase Kit (SA Biosciences) blev anvendt til bestemmelse signalvej aberrationer i de behandlede celler. Kort fortalt blev reporterplasmider på Cignal Finder Array Plate resuspenderes og blandet med 0,8 pi Fugene HD-reagens (Roche) i 100 pi OPTI-MEM-medium (Invitrogen). Transfektionen komplekset fik lov at dannes ved stuetemperatur i 20 minutter. De behandlede celler blev derefter opsamlet og revers-transficeret med reporter plasmidet med en tæthed på 1,5×10

4 celler pr. Dual-luciferase reporter assay blev udført efter 24 timers inkubation.

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og resultaterne blev præsenteret som gennemsnit med standardfejl middelværdien (SEM) . Student t-test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans, med en

P

-værdi på mindre end 0,05 anses for væsentlig.

Resultater

Overekspression af PIN1 i NPC primære tumorer og tumor linjer

Brug immunhistokemisk farvning, vi opdaget overekspression af PIN1 i 70/70 (100%) NPC primære tumorer, sammenlignet med den tilstødende normale nasopharyngeal epitel (fig 1A). PIN1 overekspression blev også demonstreret i et panel af EBV-positive NPC cellelinie (C666-1) og xenotransplantater (C15, C17, xenotransplantation-2117 og xeno-666) ved Western blotting, mens kun svag PIN-ekspression blev detekteret i den immortaliserede normal nasopharyngeale epiteliale cellelinjer (NP460 og NP69) (fig 1B). På trods af den dramatiske reduktion i PIN1 protein udtryk i immortaliserede normale NPC celler, ingen tydelige forskelle i

PIN1

mRNA transskriptioner blev observeret mellem de normale NP cellelinjer og NPC tumorer. Dette fund tyder på en post-translationel regulering af PIN1 i normale nasopharyngeale celler.

(A) IHC-farvning blev anvendt til at illustrere overekspression af PIN1 i repræsentative NPC primære tumorer (NPC1-NPC4). Alle tilfældene var EBV-positive udifferentierede karcinomer. NPC1, NPC3 og NPC4 er fra patienter med stadie 3 sygdom. NPC2 er fra en patient med stadie 2 NPC. Stærke PIN signaler blev fundet i tumorceller, og som er angivet med gule “

*”. Den tilstødende normale epitel tjente som kontrol, hvor der blev observeret svage pin1 signaler. De røde pile angiver normal nasopharyngeal epitel. (B) Ekspression af PIN1 i NPC tumor linjer, xenotransplantater og udødeliggjort normale NP celler, detekteret af QRT-PCR (øverste panel) og Western blot (nederste panel). For QRT-PCR,

PIN1

transskription i NP460 blev brugt som reference. Den relative udtryk for

PIN1

afskrifter blev angivet som en fold forskel i referenceperioden. p-actin blev anvendt til lastning normalisering. Tilsvarende blev actin anvendt som en intern ladningskontrol i Western blot analyse. Den svage PIN1 udtryk i NP69 og NP460 foreslog, at nedregulering af PIN1 involverede post-translationel regulering.

For at bestemme den mekanisme af post-translationel forordning om PIN1 proteiner, HK-1 og NP69 blev behandlet med den proteasominhibitor MG132 (Carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal). De Western blot Resultaterne viste forøget PIN1 proteinekspression i både HK1 og NP69 celler efter MG132 behandling (S1 Fig). Dette indikerer, at PIN1 proteinekspression er reguleret af proteasom nedbrydning.

Den konsekvente overekspression af PIN1 antyder dens potentielle onkogenisk rolle i NPC udvikling. For at undersøge dens onkogene funktion blev siRNAs og PIN1 inhibitoren Juglone anvendes til at bestemme virkningen af ​​PIN1 suppression på NPC cellevækst. Efterfølgende blev virkningerne af PIN1 udtryk på cellevækst og tumorigenese undersøgt i normale nasopharyngeale epitelceller (NP69) transficeret med en PIN1 udtrykker vektor.

PIN1 regulerer NPC cellevækst og cyklin D1 udtryk

virkningen af ​​pIN1 knockdown på NPC cellevækst blev undersøgt ved at transficere C666-1 celler med pin1-specifikke siRNA’er (siPin1 544 og siPin1 545). Fig 2A og 2B viser den markante nedregulering af

PIN1

mRNA og protein i C666-1cells transficeret med siPIN1. Resultaterne af WST-1 assay demonstrerede observerbar vækstinhibering i siPIN1-transficerede C666-1 celler, sammenlignet med kontrollen (Fig 2C). Endvidere blev kolonidannelse evne signifikant reduceret i siPIN1-transficerede C666-1 (Fig 2D). Disse resultater viser, at PIN1 udtryk regulerer NPC cellevækst. Resultaterne af BrdU-assayet viste signifikant undertrykkelse af DNA-syntese i de PIN1 Knockdown NPC-celler (Fig 2e). Vigtigt er det, blev ekspressionen af ​​cellecyklus regulator cyclin D1 undertrykt i PIN1 knockdown C666-1 celler (Fig 2B). Co-transfektion af pCMV-cyclinD1, en cyclin D1-udtrykkende vektor med siPIN1, restaureret cyclin D1-ekspression, celleproliferation, DNA-syntese og kolonidannelse evne i C666-1 celler sammenlignet med dem for siRNA-behandlede celler (S2 Fig) . Dette antyder, at PIN1 regulerer NPC cellevækst ved modulering cyclin D1-ekspression.

PIN1 suppression inhiberer cellevækst, DNA-syntese, kolonidannelse evne og cyclin D1-ekspression i NPC-celler (A) QRT-PCR og (B) Western blottet blev anvendt i nedregulering af PIN1 transkription og proteinekspression i PIN1 siRNA’er (siPIN1 544 og siPIN1 545) -behandlede NPC-celler og C666-1 hhv. I disse PIN1 knockdown celler, blev reduceret cyclin D1-ekspression observeret. Actin blev anvendt som ladningskontrol i Western blot analyse. (C) WST-1-analysen afslørede væksthæmning i NPC celler transficeret med siPin1 544 og siPin1 545. (D) Kolonidannelse evne var signifikant undertrykt i pin1-lyddæmpet C666-1 celler. Repræsentative billeder af kolonier dannet af siRNA-behandlede og kontrolceller er vist. Statistisk signifikans blev bestemt ved Student t-test, hvor en

P

-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant (*

P

0,05, **

P

0,01). (E) en BrdU-assay blev anvendt til at afsløre signifikant inhibering af DNA-syntese i PIN knockdown NPC celler.

PIN1 inhibitor inducerer caspase-3 og reducerer tumorstørrelse

A PIN1 inhibitor, Juglone, blev brugt til at belyse effekterne af PIN hæmning i NPC celler

in vitro

in vivo

. En WST-1 assay viste, at halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) af Juglone for C666-1 og HK1 var 6 og 10 um, (fig 3A). Dette fund tyder på, at C666-1 celler med høj PIN1 udtryk er mere modtagelige for Juglone behandling. Den PIN1 inhibitor Juglone undertrykte cyklin D1 udtryk i C666-1 celler (Fig 3B, venstre panel).

in vivo

effekt af PIN1 inhibitor på cyklin D1 repression blev yderligere bekræftet af intra-tumor injektion af Juglone i C666-1 xenografter i nøgne mus modeller (Fig 3B, højre panel). Juglone behandling også væsentligt forbedret caspase-3 aktivitet i C666-1 celler sammenlignet med kontrollerne (fig 3C). Resultaterne antyder, at Juglone inhiberer cellevækst og inducerer apoptose i NPC-celler.

(A) HK-1 (venstre felt) og C666-1 (højre panel) blev behandlet med den PIN1 inhibitoren Juglone i 24 timer til bestemme følsomheden lægemidlet dosis. IC50-værdierne for C666-1 og HK1 celler var 6 uM og 10 uM. (B) Ekspression af cyclin D1 blev undertrykt af Juglone på en dosis-afhængig måde, men der blev ikke konstateret væsentlige ændringer i β-catenin-ekspression. Ekspressionen af ​​cyclin D1 og β-catenin i Juglone-behandlede C-666 xenograft model blev undersøgt ved Western blot. Reduceret ekspression af cyclin D1 blev observeret i tumoren, som havde fået Juglone behandling. PIN1 hæmning resulterede i undertrykkelse af cyklin D1 både

in vitro

in vivo

, og der var en beskeden reduktion i β-catenin niveau i

in vivo

model . (C) De C666-1 celler udviser signifikant højere caspase-3 aktivitet efter Juglone behandling, sammenlignet med deres ubehandlede eller DMSO-behandlede modstykker. Dette indikerer, at PIN1 inhibering kan aktivere caspase apoptosecyklus i NPC-celler. Statistisk signifikans blev bestemt ved Student t-test,

P

-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant (*

P

0,05, **

P

0,01).

fig 4A og 4B demonstrere

in vivo

antitumorvirkningen af ​​Juglone i NPC celler. Tæl ROI var stærkt reduceret i musene behandlet med Juglone, sammenlignet med kontrollerne (Fig 4A). Som fig 4B viser, blev tumorstørrelser i musene behandlet med Juglone væsentligt reduceret, sammenlignet med kontrollen (Fig 4B). En signifikant inhibering af tumorvækst blev observeret i mus behandlet med 1 mg /kg og 1,5 mg /kg Juglone.

(A) Under anvendelse af

in vivo

billeddannelse, tumorvækst af luciferase-mærket C666-1 blev afsløret efter behandling med forskellige doseringer af Juglone (ROI tæller per million fotoner per sekund). Den luciferase signal blev forøget i kontrol ubehandlede tumorer under Juglone behandlingen. I mus behandlet med Juglone i forskellige doser (0,5, 1 og 1,5 mg /kg), var konsekvent lavere luciferase signaler observeret under de 8 dages behandlingsperioder. (B) signifikant hæmning af tumorvækst blev vist i mus behandlet med 0,5, 1 og 1,5 mg /kg Juglone. Fire nøgne mus blev anvendt i hver undersøgelsesgruppe. Statistisk signifikans blev bestemt ved Student t-test, hvor en

P

-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant (*

P

0,05, **

P

0,01)

PIN1 inducerer forankringsuafhængig vækst nasopharyngeale epitelceller

tumorigen effekt af PIN1 overekspression blev yderligere undersøgt i en udødeliggjort nasopharynx epitelial cellelinje (NP69) transficeret. med to pin1 efterligner (pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-pIN1 /”pIN1 1 #” og “pIN1 2 #”). Overekspressionen af ​​

PIN1

transkripter og proteiner blev observeret i pin1-transficerede NP69-celler (Fig 5A). Fig 5A viser den høje transfektionseffektivitet af pin1-transficerede celler, der udtrykker GFP.

(A) overekspression af PIN1 blev detekteret i NP69-celler transficeret med PIN1-udtrykkende Lenti-virale vektorer (PIN1 1 # og PIN1 2 # ) ved qPCR (venstre panel) og Western blot (midterste panel). Repræsentative billeder af pin1-transficerede celler ved lyse felt (i øverste højre panel) og fluorescens felt (højre nedre panel) er vist. Transfektionseffektiviteten blev overvåget ved GFP-ekspression. (B) Udvidet forankringsuafhængig vækst på blød agar i NP69 celler med PIN1-overekspression sammenlignet med kontrolceller (venstre øvre panel, kolonier i 6-brønds plader; venstre nedre panel, kolonier under mikroskop, højre panel, gennemsnitlige data i histogrammet ). (C-D) ingen signifikant effekt af PIN1 overekspression på cellevækst og kolonidannelse evne blev påvist i de immortaliserede nasopharyngeale epitelceller NP69 ved WST-1 og kolonidannelse assayet hhv. Statistisk signifikans blev bestemt ved Student t-test, hvor en

P

-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant (*

P

0,05).

Den overekspression af PIN1 i N69-celler inducerede signifikant forankringsuafhængig cellevækst i de bløde agar assays (fig 5B). Antallet af kolonier dannet i blød agar ved pin1-udtrykkende NP69-celler var signifikant højere end dem for vektorkontrol. Desværre fik PIN1 overekspression Fremkald ikke celledeling og kolonidannelse evne i NP69-celler (Fig 5C og 5D).

PIN1 overekspression aktiverer MAPK /JNK

En reporter luciferaseanalyse viste, at MAPK /JNK-signalvejen blev signifikant aktiveres i NP69-celler, der stabilt udtrykker PIN1, sammenlignet med dem, transficeret med en vektor (figur 6A). Aktiveringen af ​​HAK, p53 og NF-KB veje blev også observeret i pin1-udtrykte NP69 celler, selv om det ikke nåede statistisk signifikans. Bortset fra cyclin D1, Western blotting bekræftede opreguleringen af ​​både c-Jun og phosphoryl-c-Jun (Ser63 og Ser73) i NP69-celler stabilt transficeret med PIN1 (Fig 6B). Dette fund tyder på, at PIN1 inducerer væksten af ​​nasopharyngeale epitelceller ved at aktivere MAPK /JNK-vejen.

(A) Ved hjælp af Cancer 10-Pathway Reporter Luciferase assay blev observeret signifikant aktivering af MAPK /JNK-signalvejen i to stabilt PIN1-overxpressing NP69 cellelinjer (NP69lenti-PIN1 1 # og NP69lenti-PIN1 2 #). For disse PIN1-udtrykkende celler blev aktiviteten også moderat aktiveret i hak, P53 /DNA skader og NF-KB pathways. (B) Western blot-analyse viste opregulering af c-Jun, phosphoryleret c-Jun (Ser63 og Ser73) og cyclin D1 i de stabile pin1-transficerede NP69 celler. Statistisk signifikans blev bestemt ved Student t-test, hvor en

P

-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant (*

P

0,05).

Discussion

I en nylig undersøgelse, Lu

et al

. demonstreret associering af pin1 promoter- polymorfismer og risiko for NPC [22]. I den aktuelle undersøgelse, giver vi det funktionelle bevis på vigtigheden af ​​PIN1 overekspression i NPC tumorigenese. Vi viser, at PIN1 undertrykkelse hæmmer

in vitro

in vivo

tumorvækst i NPC celler, mens dets overekspression inducerer forankringsuafhængig vækst nasopharyngeale epitelceller. Resultaterne tyder på, at PIN1 overekspression bidrager til NPC tumorigenese, og at dets inhibering kan være en potentiel terapeutisk strategi til EBV-associeret NPC.

PIN1 er et vigtigt enzym, der binder phosphoryleret Ser /Thr-Pro-motiver og katalyserer cis /trans-isomerisering af prolin-holdige peptider [5]. Overekspressionen af ​​PIN er blevet rapporteret i forskellige humane tumorer, heriblandt bryst- [23], esophageal [24], prostata [25] og kolorektal cancer [26, 27]. I denne undersøgelse blev konstitutiv PIN1 overekspression fundet i EBV-associerede NPC tumorceller, men PIN1 protein blev næppe påvist i EBV-negative nasopharyngeale epitelceller. Da

PIN1

transskription ligner i både NPC og normale NP-celler, er PIN overekspression i tumorcellerne reguleret af post-transkriptionelle mekanismer. En nylig undersøgelse rapporterede, at PIN1 ekspression reguleres af tumor undertrykkende miRNA MIR-296-5p i prostatacancer [28]. Imidlertid er afvigende mir-296-5p ekspression sjældent detekteres i NPC [29]. Genoprettelsen af ​​PIN-ekspression i MG132-behandlede NP-celler antyder, at processen med proteasomalaktivitet nedbrydning er en vigtig mekanisme i reguleringen PIN1 funktion. Basu

et al

. viste, at proteasomalaktivitet nedbrydning af PIN1 var afgørende i dets interaktion med BCL2 og tumorcelleoverlevelse [30]. Sammen med de nyeste resultater, kan den manglende eller utilstrækkelig proteasomalaktivitet nedbrydning være en potentiel mekanisme forklare PIN1 akkumulation i EBV-associeret NPC, som efterfølgende hjælpemidler tumorcelleoverlevelse. I vores seneste undersøgelse, viste vi interaktionen af ​​EBV latent protein EBNA1 med PIN1 i NPC-celler (upublicerede data). Ikke desto mindre er det bindende ikke hæmme proteasomalaktivitet nedbrydning PIN1.