PLoS ONE: En enkelt-nukleotid polymorfisme i Katalase er stærkt forbundet med kræft i æggestokkene Survival

Abstrakt

Kræft i æggestokkene er den mest dødelige af alle gynækologiske kræftformer. Nylig dokumentation påviser en sammenhæng mellem enzymatisk aktivitet ændrer enkelt nukleotid polymorfier (SNP) med human cancer modtagelighed. Vi søgte at vurdere sammenslutning af SNPs i centrale oxidant og antioxidant enzymer med øget risiko og overlevelse i epitelial kræft i æggestokkene. Personer (n = 143) rekrutteret blev opdelt i kontrol, (n = 94): raske frivillige, (n = 18), høj-risiko

BRCA1 /2

negativ (n = 53), høj risiko

BRCA1 /2

positive (n = 23) og æggestokkene kræfttilfælde (n = 49). DNA blev underkastet TaqMan SNP genotype analyse valgt oxidant og antioxidant enzymer. Af de syv valgte SNP undersøgt, ingen forbindelse med æggestokkene risiko cancer (Pearson Chi-square) blev fundet. Imidlertid blev en katalase SNP identificeret som en forudsiger af æggestokkene overlevelse kræft ved Cox regressionsmodellen. Tilstedeværelsen af ​​denne SNP blev forbundet med en højere risiko for død (hazard ratio (HR) på 3,68 (95% konfidensinterval (CI): 1,149 til 11,836)) for patienter med ovariecancer. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste en signifikant overlevelse forskel (108 versus 60 måneder, p 0,05) for dem uden katalase SNP sammenlignet med dem med SNP. Derudover alder på diagnosetidspunktet større end medianen viste sig at være en signifikant prædiktor for død (HR på 2,78 (95% CI: 1,022-7,578)). Denne undersøgelse viser en stærk sammenhæng med katalase SNP og overlevelse af patienter med ovariecancer, og dermed kan tjene som en prognosticator

Henvisning:. Belotte J, Fletcher NM, Saed MG, Abusamaan MS, Dyson G, Diamond MP et al. (2015) En enkelt-nukleotid polymorfisme i Katalase er stærkt forbundet med kræft i æggestokkene Survival. PLoS ONE 10 (8): e0135739. doi: 10,1371 /journal.pone.0135739

Redaktør: Alvaro Galli, CNR, ITALIEN

Modtaget: 18. maj 2015; Accepteret: 25 Juli 2015; Udgivet: 24 August, 2015

Copyright: © 2015 Belotte et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) tegner sig for 85 til 90% af alle kræfttilfælde i æggestokkene, æggeledere og primær bughinden og viser forskellige histologier såsom serøs, mucinous, eller endometrioide [1]. Kræft i æggestokkene er den mest dødelige af alle gynækologiske kræftformer med en anslået 22,980 nye tilfælde og 14,270 dødsfald forventes i 2014 i USA alene [1,2]. Typisk behandling af ovariecancer udført med enten cytoreduktive kirurgi (CRS) efterfulgt af platin /taxan kombinationskemoterapi eller neoadjuverende kemoterapi med interval CRS [3,4]. I almindelighed kan en 50-80% komplet klinisk respons opnås hos patienter med fremskreden sygdom. Desværre vil de fleste behandlede patienter tilbagefald inden for 18 måneder med kemoterapi sygdom [5]. Mens chancerne for langsigtede patientoverlevelse er signifikant forøget, når kræften opdages ved sin tidlige fase, til dato, er der ingen pålidelig metode til rådighed til tidlig opdagelse af denne sygdom [5].

Epidemiologiske undersøgelser har klart fastlagt rolle familiens historie som en vigtig risikofaktor for både bryst- og ovariecancere [6]. Mutationer i

BRCA

øjeblikket anvendes til at vurdere risiko for bryst- og ovariecancer, men denne metode er ikke ideel, fordi mutationer er så sjældne (1 ud af 500 personer), fører til en lille samlede indvirkning på dødelighed sats [7]. Genomisk variationer mellem personer er blevet mere og mere anvendt i lægegerningen [8-12]. En enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) opstår på grund af punktmutationer, der selektivt opretholdes i populationer og er fordelt over hele det humane genom til en anslået samlet hyppighed på mindst én i hver 1000 basepar [13]. Ikke-synonyme SNP’er erstatning indkodede aminosyrer i proteiner, og er mere tilbøjelige til at ændre struktur, funktion og interaktion af proteinet [14]. Nylig dokumentation påviser en sammenhæng mellem enzymatisk aktivitet ændrer SNPs i oxidative DNA reparation gener og antioxidant gener med human cancer modtagelighed [15]. Derudover har en pro-oxidant tilstand blevet impliceret i patogenesen af ​​flere maligne lidelser, inklusive ovariecancer [16,17]. Den aktuelle undersøgelse er baseret på det faktum, at visse SNPs stede i centrale oxidanter og antioxidanter enzymer resulterer i ændret enzymatisk aktivitet, samt vores tidligere offentliggjorte arbejde afgrænse rolle oxidativt stress i kræft i æggestokkene. Målet med denne undersøgelse var at bestemme, hvorvidt specifikke SNP på centrale oxidant og antioxidant enzymer er forbundet med øget risiko samt den samlede overlevelse æggestokkene kræftpatienter.

Materialer og metoder

Studie design

Vi udførte en case-kontrol undersøgelse, der sammenligner kvindelige forsøgspersoner med og uden EOC og afgøres, om der er en sammenhæng med flere udvalgte SNPs i etablerede redox gener. Støtteberettigede kvinder var 19 til 80 år og var tidligere rekrutteret gennem Karmanos Cancer Institute Genetisk Registry (KCIGR), Detroit, MI. Forskningsaktiviteter og metode samtykke blev gennemført med godkendelse af Wayne State University Institutional Review Board (IRB # 024199MP2F (5R)). Skriftlige godkendelse former blev udnyttet, og tilladelsen blev givet til indsamling af blodprøver og for adgang til journaler for alle fag.

patientpopulation.

Ansatte individer (n = 143) blev delt i kontroller (94), raske frivillige (n = 18), høj risiko

BRCA1 /2

negativ (n = 53), høj-risiko

BRCA1 /2

positiv (n = 23 ) og æggestokkene kræfttilfælde (n = 49). Kontroller blev udvalgt primært fra forsøgspersoner, der anses for høj risiko for bryst- og ovariecancer, uden kræft i æggestokkene, der undergik genetisk screening for

BRCA1 /2

luftfartsselskab status. Notatet kriterierne for screening inkluderet personlige historie af bryst-og ovariecancer, slægtshistorie af bryst- og ovariecancer, og

BRCA1 /2

mutationer. Derudover blev raske frivillige også ansat som kontrol fra hovedstadsområdet Detroit-området med sådanne historier. Sager blev udvalgt på grundlag af histopatologi-bekræftet primær diagnose af EOC. Alle deltagere, undtagen raske frivillige, havde tidligere gennemgået

BRCA1 /2

test og resultaterne blev stillet til rådighed for os.

Prøver, der anvendes til denne undersøgelse blev indsamlet fra deltagere rekrutteret mellem 1999 og 2012. DNA-prøver blev anvendt til at bestemme tilstedeværelsen af ​​polymorfier i generne beskrevet i tabel 1. de SNPs blev valgt baseret på tidligere rapporterede associationer med flere kræftformer [18-26]. Af de 143 patienter, 49 (34,3%) havde en primær diagnose af kræft i æggestokkene, mens 94 (65,7%) uden kræft tjente som kontroller. For kræft i æggestokkene kohorten: 13 (26,5%) var

BRCA1 /2

positiv i forhold til 34 (69,4%)

BRCA1 /2

negativ; 2 (4,1%) tilfælde manglede. Dataene er normalfordelt med en alder af indskrivning varierede fra 18 til 90 Heraf med et gennemsnit på 52 ± 15 og en gennemsnitsalder på 52. alder ved diagnose varierede fra 23 til 77, med et gennemsnit på 52 ± 11 og en median alder af 52. var racemæssige fordeling 88,8% (kaukasisk), 8,4% (afrikansk-amerikansk) og 2,8% (Andet). Personlige og familiemæssige historier af brystkræft, kræft i æggestokkene, andre kræftformer, og

BRCA1 /2

blev kvantificeret. Hyppigheden af ​​tilstedeværelsen af ​​SNP (heterozygot plus homozygote mutant) sammenlignet med homozygot vildtype blev bestemt for hvert gen undersøgt.

Oprensning af DNA og TaqMan SNP genotypebestemmelsesassay for SNPs

DNA, fra blodprøver, blev isoleret ved Applied Genomics Technology center (AGTC, Detroit, MI). DNA blev ekstraheret med QIAamp DNA Mini kit pr producentens protokol (Qiagen, Valencia, CA) [27]. TaqMan SNP genotypebestemmelsesassay Sets (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) (NCBI dbSNP genom build 37, MAF kilde 1000 genomer) blev anvendt til genotype udvalgte SNP’er beskrevet i tabel 1. AGTC udførte dette assay og analyse blev udført under anvendelse af QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

Statistisk analyse

data blev analyseret ved hjælp af SPSS (IBM, Armonk, New York) til Mac V.22. De udvalgte til analyserne variable omfatter genotyper, alder ved diagnose og alder ved tilmelding, personlige og familiemæssige historier af bryst-, ovarie-, og

BRCA1 /2

mutationer, foruden andre maligniteter. Brug af median alder ved diagnose /indskrivning som cut punkt, vi dikotomiseret den “alder ved diagnose” variabel. Den “race” variabel blev kategoriseret som: Kaukasisk, afrikansk-amerikanske eller andre. Vi konsoliderede følgende tumor og kliniske variabler til binære kategoriske ordninger: International Federation of Gynækologi og obstetrik (FIGO) iscenesætter ind tidligt (IIA-IIIB) og avancerede (IIIC-IV); Figo kvaliteter (G1 /2) og (G3); histologi (serøs og andet). For alle generne undersøgt, blev “genotype” variabel dikotomiseret anvendelse af følgende skema: homozygot vildtype versus homozygote mutant plus heterozygot mutant. At sammenligne sager til kontrol med de udvalgte demografiske, kliniske, og genotypiske egenskaber, vi udførte Pearson Chi-square analyse. Den recidivraten blev bestemt som den procentdel af patienter, der er gået i remission, men sygdommen er vendt tilbage måneder eller år senere, er baseret på fysisk undersøgelse, radiologiske undersøgelser og serum CA-125 niveauer.

Cox regression og Kaplan -Meier analyser af variabler som en indikator for den samlede overlevelse.

for at undersøge virkningen af ​​den SNPs på samlet overlevelse blev Cox regressionsanalyser udført ved hjælp de ovennævnte variable og klassifikationssystemer, hjælp sandsynligheden forholdet fremad trinvis metode. Adskillige metode simuleringer blev udført såsom: indbrud (ENTER), frem LR (likelihood ratio) osv fremad LR blev valgt til den endelige analyse. Denne metode er en stringent model, der vælger de stærkeste prædiktorer for resultatet, der skal indgå i den endelige model. Tabel 2 indeholder de stærkeste prædiktorer føres af modellen samt variabler afvist af modellen. Alle patienter fik standarden for pleje efter tumor board diskussion. Nærmere oplysninger om behandling karakteristika var ikke tilgængelig. Derudover blev Kaplan-Meier-overlevelseskurver genereret for de valgte model variabler. Vi har udført alle analyser på p-værdi 0,05 for statistisk signifikans.

Resultater

Vi udførte side-by-side sammenligning mellem æggestokkene sager og kontroller kræft ved hjælp af Pearson chi-square analyse. Racistisk fordeling var statistisk ens mellem grupperne (p 0,05). Som forventet, “personlig eller familiær historie af kræft i æggestokkene”, “personlig eller familiær disposition for andre kræftformer” og “fremskreden alder” var signifikant forskellige mellem grupperne og er kendt æggestokkene kræft risikofaktorer (p 0,05, tabel 3). Sammenlignende analyser for mangan superoxiddismutase (

MnSOD

, rs4880), NAD (P) H oxidase (

CYBA

, rs4673), glutathion peroxidase (

GPX1

, rs3448), inducerbar nitrogenoxid syntase (

NOS2

, rs2297518), myeloperoxidase (

MPO

, rs2243828), glutathion reduktase (

GSR

, rs1002149), og katalase (

CAT

, rs1001179) fandt ikke en signifikant forskel mellem de sager og kontroller (tabel 3). Ud af de 49 æggestokkene kræfttilfælde blev 38 (77,5%), yderligere analyseret af Cox regression metode, og 11 (22,5%) blev droppet på grund af manglende data. Størstedelen af ​​tilfældene var serøs histologi, fremskredent stadium, og ædelstål tumorer (tabel 4). Den recidivraten viste sig at være 60,5%.

CAT

SNP er en indikator for kortere overlevelse

På tidspunktet for disse analyser, var der 26 dødsfald (18,2%) og 117 (81,8%) emner i live. Blandt de SNPs undersøgte, kun

CAT

(rs1001179) blev identificeret som en indikator for kortere overlevelse af Cox regressionsmodel med en hazard ratio (HR) på 3,68 (95% CI: 1,149 til 11,836, p = 0,028 ) (tabel 4A). Som forventet, “alder ved diagnose” større end medianen (52) viste sig at være en betydelig prædiktor for død med en HR på 2,78 (95% CI: 1,022-7,578, p = 0,045) (tabel 4). De valgte for analyserne, men afvist af model variabler er anført i tabel 4. Kaplan-Meier (KM) overlevelsesanalyse indregnet af

CAT

genotype, der bruges 84,6% af dødsfaldene, viste en statistisk signifikant median samlet overlevelse forskel (108 [95% CI: 79-137] versus 60 [95% CI: 40-80] måneder, p 0,05) og en gennemsnitlig total overlevelse forskel (182 [95% CI: 75,5 til 288] versus 47 måneder [95% CI: 31-60]., s 0,05) for patienter med normal genotype i forhold til

CAT

SNP genotypen (figur 1)

den solide kurve repræsenterer sager med (CC) homozygot vildtype genotype sammenlignet med den stiplede linje der repræsenterer tilfælde med homozygot mutant plus heterozygot mutant (CT + TT) genotyper. X-aksen repræsenterer patientoverlevelse i måneder; Y-aksen repræsenterer kumulative overlevelse procent. Chi-square p-værdi 0 0,05 anses statistisk signifikant

Diskussion

En stor mængde tyder på, at æggestokkene kræftpatienter har nedsat niveau af cirkulerende antioxidanter og højere niveauer af. oxidativ stress [16,17,28-32]. Vi har rapporteret, at der findes en vedvarende pro-oxidant tilstand i EOC, der omfattede øget udtryk af centrale pro-oxidant enzymer såsom inducerbar nitrogenoxid (iNOS), NAD (P) H oxidase, og MPO [16,32,33] . Interessant ekspressionen af ​​MPO i EOC celler og væv kom som en overraskelse, da det er en oxidant-genererende enzym, der typisk findes i celler af myeloid oprindelse [34]. Vi har også fastslået, at MPO kan producere nitrosonium kation (NO

+) ved anvendelse af NO produceret af iNOS. Dette er vigtigt, fordi NO

+ årsager s-nitrosylering af caspase-3 og inhibering af dets aktivitet, hvilket medførte et fald i apoptose [32]. Denne mekanisme forklarer endvidere den iagttagelse, at EOC celler åbenbart faldt betydeligt apoptose og øget overlevelse [32,33,35,36]. Interessant, evalueringen af ​​mutationer i de forskellige redox enzymer i form af SNP’er er et aktivt område af videnskabelig forskning [37-45]. Genetiske polymorfier er kendt for at være associeret med cancer modtagelighed og kan bestemmes ved at studere funktionelle polymorfier i gener, der styrer niveauet af cellulære reaktive oxygenarter og oxidativ beskadigelse, herunder SNPs til gener involveret i carcinogen metabolisme (afgiftning og /eller aktivering), antioxidanter , og DNA reparation veje [46]. F.eks germline mutationer i

BRCA1

eller

BRCA2

er forbundet med ovariecancer med en hastighed på kun 20-40%, hvilket antyder tilstedeværelsen af ​​andre uidentificerede mutationer i andre gener som en ætiologi [ ,,,0],14,47,48]. Yderligere genetiske variationer, hvoraf mange er blevet identificeret i de seneste genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS), er blevet hypotese at fungere som lav til moderat penetrerende alleler, der bidrager til æggestokkene kræftrisiko, samt andre sygdomme [14,49] . Til støtte for denne, de seneste undersøgelser har også forbundet genetiske polymorfier i gener, der er involveret i undertrykkelse af tumorgenicitet samt de involverede i cellecyklus med ovariecancer [50,51].

For denne undersøgelse, vi søgte at evaluere sammenslutningen af ​​specifikke SNPs i centrale oxidant og antioxidant enzymer med øget risiko og samlet overlevelse af kræft i æggestokkene. Analysen af ​​patientpopulationen viste, at den gennemsnitlige alder ved diagnose og racemæssige fordeling af dem diagnosticeret med kræft i æggestokkene var i overensstemmelse med kendte risikofaktorer for kræft i æggestokkene, specifikt kvinder af nordamerikanske anstændigt og dem over 50 år gamle. Øjeblikket vi demonstreret, at der ikke er nogen sammenhæng mellem de valgte SNP’er og risikoen for at udvikle ovariecancer (tabel 2). Det er vigtigt at understrege, at selv om de udvalgte SNPs for denne undersøgelse ikke blev fundet at være forbundet med æggestokkene kræftrisiko, ekstra skift af funktion SNPs for disse enzymer findes, og bør undersøges nærmere. Af de SNPs studerede ved undersøgelsen overlevelse, fandt vi

CAT

SNP (rs1001179) at være en væsentlig prædiktor for død, når til stede i æggestokkene kræftpatienter som det fremgår af Cox regression og KM overlevelse analyser (tabel 3 og fig 1). Konkret æggestokkene kræftpatienter med

CAT

SNP døde betydeligt hurtigere end dem uden det (figur 1).

CAT

SNP (rs1001179) findes i promotorregionen af ​​

CAT

genet, erstatte allel C med T i position -262 i 5′-området af kromosom 11 og er korreleret med nedsat enzymaktivitet niveau [52]. Katalase er et meget vigtigt og allestedsnærværende enzym involveret i nedbrydning af to molekyler hydrogenperoxid (H

2O

2) til vand og ilt. De nuværende resultater er i overensstemmelse med flere andre undersøgelser, der er knyttet denne specifikke SNP med risiko, respons på adjuverende behandling og overlevelse af kræftpatienter [18,19,24,53]. Konkret blev lavt serum CAT niveauer er forbundet med negative prognose for ovariecancer [21]. Vores data giver en mulig forklaring på lavt serum CAT niveauer, som kan være et resultat af en

CAT

SNP, der sænker enzymatisk aktivitet. Desuden har mekanistiske undersøgelser identificeret H

2O

2, et resultat af oxidativ stress, forbedre angiogenese og tumorindtrængen gennem flere veje, herunder: hypoxi inducerbar faktor 1-alpha, p38 MAPK og sneglen [54,55]. Det fremgår, at den endelige fælles pathway kulminerer til epidermal vækstfaktor (EGF) -induceret nedregulering af epitelial cadherinekspression der kan inhiberes af eksogent CAT [54]. Epithelial-cadherin er en celle-celle adhæsion glycoprotein kodet af

CDH1

gen hos mennesker, som er blevet karakteriseret som en tumorsuppressor [56,57]. Dens tab af funktion er korreleret med flere solide tumorer, herunder æggestokkene og menes at bidrage til tumorprogression og metastase [58].

Det er vigtigt at understrege, at den manglende sammenhæng mellem de valgte SNPs i denne undersøgelse med æggestokkene kræftrisiko ikke endeligt svar på dette vigtige spørgsmål, fordi yderligere change-of-funktion SNPs for disse enzymer findes, og bør undersøges nærmere. Nylige genetiske undersøgelser har knyttet MPO til lunge og ovariecancer ved at demonstrere en slående sammenhæng mellem den relative risiko for udvikling af sygdommen og forekomsten af ​​funktionelt forskellige

MPO

polymorfier [59]. Derudover har en SNP i NAD (P) H oxidase (rs4673) blevet associeret med øget risiko for ovariecancer [60]. I brystcancer, til tilstedeværelsen af ​​

CAT

SNP (rs1001179), blev vist bibringe øget risiko [24]. Vi har udvalgt en række yderligere SNPs baseret på deres effekt på enzymaktiviteter eller forening med kræft. Adskillige SNP’er i

NOS2

har været forbundet med gastrisk, esophageal, hud og urogenitale cancere [20,22]. Også SNPs i

MnSOD

,

GPX1

,

GPX4

,

CAT

viste sig at være forbundet med prostatacancer [24].

Andre undersøgelser har fundet en SNP i

MnSOD

(rs4880) og en SNP i

MPO

(rs2333227) at være forbundet med øget risiko for ovariecancer [34].

MPO

SNP vi har analyseret i denne undersøgelse er i 100% konkordans med SNP rs2333227 [61]. Således ud over at undersøge andre ændringer af funktionelle SNP’er, øge størrelsen af ​​vores kohorte kan være tilstrækkelig til at nå statistisk signifikans i flere af SNPs valgt til denne undersøgelse. Styrken af ​​vores undersøgelse omfatter omfattende karakter redox gener studeret og translationel aspekt af vores tilgang ved at vurdere samtidigt kliniske og genotypiske karakteristika af befolkningen. Vi mener, at vores kontrol kohorte er heterogen repræsenterer styrke, fordi det omfatter patienter behandlet på høj risiko for

BRCA1 /2

mutation og dem uden nogen etablerede risikofaktorer for kræft i æggestokkene, hvilket afspejler baseline risikogruppe (generel befolkning). Interessant, patienter, der er testet negative for

BRCA1 /2

mutationer, samt, dem med arvelig

BRCA1 /2

mutationer, men også testet negativ for

BRCA1 /2

bør overvejes på et højere risikoprofil end den almindelige befolkning. Endnu vigtigere er, så vidt vi ved, er vi de første til at rapportere en sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ​​denne specifikke

CAT

SNP og kræft i æggestokkene overlevelse. Undersøgelsen har flere begrænsninger såsom lille prøvestørrelse, den retrospektive natur uløseligt forbundet med case-control studier, og den geografiske begrænsning af befolkningen. I vores patientpopulation, blev gentagelse sats sig at være 60,5%; dog var den nøjagtige dato for tilbagefald ikke er etableret gør beregning af progressionsfri overlevelse (PFS) umuligt. Vi anerkender, at fastsættelsen af ​​PFS ville have styrket vores resultater som PFS ofte er blevet brugt som et primært endepunkt eller et surrogat for den samlede overlevelse i kliniske forsøg [62-67].

Det er nu klart, at oxidativt stress spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​cancer, herunder ovariecancer imidlertid de nøjagtige mekanismer endnu ikke afklaret. I denne forundersøgelse var vi i stand til at vise, at et bestemt

CAT

SNP er forbundet med dårlig overlevelse i æggestokkene kræftpatienter. vil være behov for yderligere undersøgelser undersøger andre SNPs i vigtige oxidanter og antioxidant enzymer med højere antal patienter til at etablere dette link. SNPs i disse enzymer kan tjene som potentielle markører for kræft i æggestokkene, der er et presserende behov for. Vores undersøgelse indikerer en stærk sammenhæng med

CAT

SNP og overlevelse af patienter med ovariecancer, og dermed kan tjene som en prognosticator.

Støtte Information

S1 fil. Patient data og oplysninger

doi:. 10,1371 /journal.pone.0135739.s001

(PDF)

Tak

Vi vil gerne takke Dr. Michael S. Simon, Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI for hans uvurderlige indsats og de Genetiske Rådgivere i klinisk genetik. Patienterne screenes for berettigelse på en ugentlig klinisk konference og Dr. Simon eller Genetiske Rådgivere indføre /forklare undersøgelsen til de egnede patienter, samtykke dem, og sørge for blod uafgjort. Vi vil også gerne takke Dr. Michael A. Tainsky og Nancy Levin, Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, for deres støtte og for at give DNA-prøverne til denne undersøgelse.