PLoS ONE: Den skæbne Chrysotil-induceret multipolær Mitose og aneuploid Befolkning i dyrkede Lung Cancer Cells

Abstrakt

Chrysotil er en af ​​de seks typer af asbest, og det er den eneste, der stadig kan kommercialiseres i mange lande. Udsættelse for andre typer af asbest er blevet forbundet med alvorlige sygdomme, såsom lunge- carcinomer og pleurale mesotheliomas. Foreningen af ​​chrysotil eksponering med sygdom er kontroversielt. Imidlertid

in vitro Salg undersøgelser viser mutagene potentiale af chrysotil, som kan inducere DNA og celleskader. Det foreliggende arbejde var at analysere ændringer i lunge småcellede carcinom kulturer efter 48 timers chrysotil eksponering, efterfulgt af 2, 4 og 8 dages restitution i fiber-frit dyrkningsmedium. Nogle ændringer, såsom aneuploid celle dannelse, blev observeret øget antal celler i G2 /M-fase og celler i multipolære mitose selv efter 8 dages restitution. Tilstedeværelsen af ​​chrysotilfibre i cellekulturerne blev detekteret og cellemorfologi blev observeret ved laserscanning konfokal mikroskopi. Efter 4 og 8 dages restitution, kun nogle få chrysotil fragmenter var til stede i nogle celler, og den cellulære morfologi var i lighed med kontrolceller. Celler transficeret med GFP-mærket α-tubulin plasmid blev behandlet med chrysotil i 24 eller 48 timer og celler i multipolær mitose blev observeret af time-lapse mikroskopi. Skæbner disse celler blev etableret: tilbageholdelse i metafase, celledød, progression gennem M fase genererer mere end to datterceller eller cellefusion under telofase eller cytokinese. Nogle af dem var relateret til dannelsen af ​​aneuploide celler og celler med unormal antal centrosomer

Henvisning:. Cortez BDA, Quassollo G, Caceres A, Machado-Santelli GM (2011) Den skæbne Chrysotil-induceret multipolær mitose og aneuploid Befolkning i dyrkede Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (4): e18600. doi: 10,1371 /journal.pone.0018600

Redaktør: Robert Qi, Hongkong Universitet for Videnskab og Teknologi, Hongkong

Modtaget: November 30, 2010; Accepteret: 7 marts 2011; Udgivet: April 5, 2011

Copyright: © 2011 Cortez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fundação de Amparo en Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, Brasilien og af tilskud fra Agencia Córdoba Ciencia og MINCyT (PICT 815 og PME), Argentina. BAC var en kollega fra Red de MacroUniversidades de America Latina y el Caribe, under hendes ophold i Argentina. GQ er en ph.d.-stipendiat i FONCyT (Argentina). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Asbest er et silikat mineral opdelt i to store grupper – serpentiner og amphiboles. Amfibol fibre blev almindeligt anvendt i kommercielle applikationer, indtil foreningen af ​​amfibol eksponering med flere alvorlige sygdomme, såsom asbestose, bronkial cancer og malignt mesotheliom i lungehinden og bughinden [1], [2]. I øjeblikket kan amfibol fibre, ikke anvendes i mange lande, og er blevet erstattet af chrysotil, en Serpentine asbest, der betragtes som mindre skadelige for menneskers sundhed.

Chrysotil består af buede silkebløde fibre med et lille tværsnit (80 til 130 Å) og en rørformet struktur. Dens clearance fra lungevæv er hurtigere end den af ​​amfibol fibre, og chrysotil akkumuleres ikke i lungen på grund af en mekanisme, der involverer opsplitning af fibrene i korte stykker [3].

mekanismer, der fører til udviklingen af sygdomme som carcinomer og mesotheliomas efter udsættelse for asbest er ikke godt forstået. Imidlertid har de mutagene og cytotoksiske virkninger af asbest blevet påvist i undersøgelser under anvendelse af dyrkede celler udsat for forskellige asbestfibre i en periode fra 1 time til 72 timer.

Eksponering af dyrkede celler til asbest fører til dannelsen af ​​oxyradicals og frie radikaler, der skader DNA [4], [5], [6]. Det er blevet vist, at udsættelse af dyrkede celler for chrysotil kan forårsage dobbelte strengbrud i DNA efter 3 og 24 timer [7], [8] og kan også forårsage intrakromosomal deletioner og DNA-mutationer [9]. Chrysotil-induceret DNA-skader kan udløse apoptose i forskellige celletyper følgende 3 til 4 h af eksponering [8], [10].

Mikrokerner er også observeret efter chrysotil behandling [11]. Disse kromatin organer, som indeholder en acentriske kromosom fragment eller et helt kromosom, adskilt fra metafaseplade, kan genereres efter kromosombrud og mitotiske forstyrrelser, såsom multipolære spindler. Derfor er de data antyder, at chrysotil kan forårsage DNA-strengbrud og forstyrre de mitotiske spindler.

cellecyklus forstyrrelser i celler udsat for chrysotil blev undersøgt ved flowcytometri, og blev observeret komplekse ændringer. Celler behandlet med chrysotil i 4 til 48 h viste G2 /M fastholdelse og et nedsat antal S-fase celler, identificeret ved BrdU inkorporering [12].

Mitotisk division efter udsættelse for asbest blev også observeret ved time-lapse og konfokal mikroskopi. Nogle ændringer blev fundet, såsom defekter i spindeldannelse og svigt af cytokinese i nærvær af internaliserede fibre. Disse forsøg viser, at lange fibre kan være placeret mellem datterceller under telofase og føre til cytokinese svigt, genererer flercellede og aneuploide celler [13], [14]. Lignende resultater blev observeret i celler udsat for kulstof-nanorør. Disse celler viste afbrydelser af centrosomer og mitosespindler, hvilket tyder på, at nanorør kan forstyrre mikrotubuli og motoriske proteiner [15].

aneuploid celler er kendetegnet ved unormal DNA-indhold på grund af et tab eller gevinst på hele kromosomer eller dele af kromosomer, og et flertal af solide tumorer indeholder aneuploide celler [16], [17], [18]. Aneuploidi kan skyldes fejl i cellecyklus, fejl i mitotiske checkpoints, der tillader DNA skader eller replikation fejl at blive videregivet til datterceller, fejl i kromosom adskillelse og cytokinese, som kan opstå på grund af centrosom forstærkning og dannelse af multipolære spindler [19 ].

i 1914 Boveri citeret aneuploidi som en årsag til kræft, men den efterfølgende opdagelse af onkogener og tumorsuppressorgener førte til en ny teori, hvor ophobning af mutationer i disse gener var årsag til malign transformation [20]. Diskussionen er fortsat, og i øjeblikket aneuploidi anses for at være involveret i tumor progression, undertrykkelse eller initiering [21], [22], [23]. Det er imidlertid klart, at aneuploidi kan introducere mutationer, der giver anledning til malign transformation og føre til genetisk ustabilitet [24].

Den foreliggende arbejde fokuserer på dannelsen af ​​aneuploide celler efter udsættelse for tre forskellige koncentrationer af chrysotilfibre efterfulgt af lange genopretningstid i fiber-frit medium. Vi analyserede også cellecyklus forstyrrelser, der kunne være involveret i aneuploid celle dannelse, ved at sammenligne ændringer findes i normale og ondartede celler udsat for chrysotil. Multipolær mitose blev også spores til at bestemme skæbner disse celler og deres bidrag til aneuploid celle formation.

Materialer og metoder

Cell Kultur

hK2 celler (en cellelinie etableret fra human ikke-småcellet lungekræft) [25] og VERO-celler (en epitelial line stammer fra grønt abenyre – ATCC CCL-81) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles minimale essentielle medium (Sigma) suppleret med 10% føtalt bovint serum, i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C.

Chrysotil Behandling

Chrysotil 5R (Quebec Standard) fra SAMA Mineração de Amianto Ltda (Minaçu, GO, Brasilien) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Flavia M. Cassiola. Fibrene blev vasket med hanevand og aktiveres ved sonikering ved kontrolleret pH (7,4) som beskrevet andetsteds [26]. Til behandling blev celler enzymatisk fjernet fra kolberne og udpladet i skåle med en diameter på 35 mm (2,10

5 celler /skål). Efter 24 timer i kultur blev mediet ændret til 2 ml frisk medium med chrysotilfibre på en tilnærmet slutkoncentration på 250 ug /ml, 125 pg /ml eller 62,5 pg /ml, rækkevidde lavere end de fleste

in vivo

undersøgelser (10 til 17 mg /m

3). Fibrene forblev i kontakt med cellerne i perioder på 24 timer eller 48 timer, hvorefter mediet blev ændret. Efter yderligere perioder på 2, 4 eller 8 dage i normalt medium cellerne blev vasket med phosphatpufret saltvand (PBSA) og fikseres. Under hele behandlingen dyrkningsmediet blev suppleret med 10% føtalt bovint serum, og skiftes hver 2 dage under restitutionstid.

DNA kvantificering

Indholdet nukleare DNA af chrysotil behandlede og kontrol HK2 celler blev kvantificeret ved billedanalyse med software CIRES (Cell Billede Retrieval og evalueringssystem-Kontron Eletronik) installeret i Axioskopmikroskop (Zeiss). Til analysen blev kernerne farves ved Feulgen reaktion [16]. Chrysotil behandlinger blev udført under anvendelse af tre forskellige fibre koncentrationer (250 pg /ml, 125 pg /ml, 62,5 ug /ml), og efter 48 timers behandling blev anvendt tre forskellige tidspunkter for nyttiggørelse i fiber-dyrkningsmedium: 2, 4 og 8 dage. Fire hundrede kerner af mononukleære, binucleated og flercellede blev uafhængigt analyseret i kontrol og chrysotil behandlede celler. Tumor celler har normalt genetiske ændringer, og de fleste af dem er hyperdiploid. Da HK2 er en

in vitro

etableret cellelinje, det diploide gruppen blev defineret i henhold til toppen af ​​G0 /G1 i histogrammer, og tetraploide gruppe blev bestemt med dobbelt af DNA-indhold.

flowcytometri

cellecyklussen blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af Guava System. Blev analyseret kontrol og chrysotil (125 ug /ml) behandlede celler i 48 timer og udvundet i normalt medium i 2, 4 og 8 dage. Til analyse celler blev behandlet med trypsin, spundet ned (1.000 rpm i 10 min), vasket med PBSA og fikseret med methanol: PBSA (3:01) i 1 time ved 4 ° C. Derefter blev cellerne spundet ned, vasket med PBSA og inkuberet med en opløsning af 200 pi PBSA, 20 pi RNAase og 20 pi propidiumiodid i 1 time. Det blev undersøgt 5000 celler for hver eksperimentel betingelse

Immunoflurescence:. Mitoseindeks, Cell morfologi og tilstedeværelse af fibre

HK2 celler blev behandlet med 125 ug /ml chrysotil i 24 timer og 48 timer og også behandlet i 48 timer og genvindes til 2, 4 og 8 dage i normalt medium; og VERO-celler blev behandlet med 125 u-/ml chrysotil i 48 timer og udvundet i normalt medium i 24 timer. Kontrol og behandlede celler blev fikseret med formaldehyd 3,7% i 30 minutter og behandlet med Triton X-100 0,1% i 10 min. Derefter blev cellerne forelagt immunofluorescens med anti-α og p-tubulin antistoffer (Sigma, fortyndet 1:200) og med det andet antistof anti-muse CY5 (Invitrogen, fortyndet 1:200). Efter dette blev cellerne behandlet med RNAase i 30 minutter, blev kernerne farves ved propidiumiodid og actinfilamenter med FITC-phalloidin. Cellemorfologien og tilstedeværelse af chrysotilfibre blev afbildet af laser scanning konfokal mikroskopi (LSM 510, Carl Zeiss). Disse præparater blev også anvendt til at kvantificere tilstedeværelsen af ​​mikronucleerede, flerkernede og mitotiske celler: præparater blev observeret ved fluorescensmikroskopi. Mindst 1.000 celler /slide og 100 mitotiske celler blev talt i tre forskellige dias for hver behandling og kontrol.

Time-Lapse Microscopy

HK2 blev transficeret med GFP-tagget alfa-tubulin plasmid for at tillade sporing af mikrotubuli under mitose. Transfektion blev udført med Lipofectamine 2000 Invitrogen) ifølge producentens protokol. Efter 24 timers transfektion blev mediet skiftet til medium med chrysotilfibre. Cellerne forblev med fibre i 24 eller 48 timer, og derefter observeret af time-lapse spinning disk konfokal mikroskopi ved hjælp af en DSU X-81 omvendt mikroskop (Olympus), der er udstyret med MT20 belysning og OSIS indkøbssystemer, et CCD-kamera (Hamamatsu, ORCA AG), og et varmekammer (Harvard Apparatus). Celle blev anbragt på særlige kamre indeholdende 2 ml optagemediet (5% Hanks balancerede saltopløsning, 0,5% glucose, 1% føtalt bovint serum, 20 mM Hepes og 2 mM Glutamax, pH 7,3) og afbildes med FTB-systemet under anvendelse af en 60x 1,42 NA nedsænkning olie mål. Maksimale projektion billeder blev opnået og behandles ved hjælp af Metamorph software og Adobe Photoshop

statistiske analyser

Resultaterne blev analyseret af χ2 test og P .. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

chrysotil koncentrationsafhængig aneuploidi følgende opsving i fiber-frit medium

Dyrkede HK2 celler blev behandlet med tre forskellige koncentrationer af chrysotil og fik derefter lov til at komme sig i fiber-medium i 2, 4 og 8 dage. Nuklear DNA-indhold blev kvantificeret ved billedanalyse og kerner blev inddelt i følgende fem klasser: hypodiploid (DNA-indhold ≤1.49 C), diploide (DNA-indhold mellem 1,5 C og 2,39 C), hyperdiploid (DNA-indhold mellem 2,4 C og 3,59 C) , tetraploid (DNA indhold mellem 3.6C og 5.1c) og hypertetraploid (DNA-indholdet 5.1c). (tabel 1)

Chrysotil behandling førte til en koncentrationsafhængig dannelse af hypertetraploid kerner (også kaldet aneuploide kerner). Efter 48 timers chrysotil behandling efterfulgt af 2 dages restitution i fiber-frit medium, blev frekvensen af ​​aneuploidi målt. I celler behandlet med den højeste chrysotil koncentration (250 ug /ml), 7% af cellerne var aneuploid, mens dem behandlet med den mellemliggende koncentration af chrysotil (125 ug /ml) viste 4,5% aneuploidi; den laveste chrysotil koncentration (62,5 ug /ml) førte til 3,5% aneuploidi, som var større, at frekvensen af ​​aneuploidi i kontrolceller (0,25%). Når analyseret efter længere inddrivelse gange, frekvensen af ​​aneuploide kerner steg og nåede 10,5% i celler behandlet med 250 ug /ml chrysotil efterfulgt af 8 dages restitution. Celler behandlet med 125 ug /ml og 62,5 ug /ml chrysotil og fik lov til at komme sig 8 dage fremkom aneuploidi satser på 5,9% og 4,67% (Tabel 1, Fig. 1).

Nuclear DNA-indholdet i HK2 kontrol og chrysotil (250 ug /ml, 125 pg /ml eller 62,5 ug /ml) -behandlede celler (i 48 timer) gav udvinding i fiber-medium i 2 blev 4 eller 8 dage kvantificeres, og kerner med DNA-indhold 5.1 C blev anset aneuploid. De viste procenter er baggrund (procentdelen af ​​aneuploidi i kontrolceller, 0,25%) – fratrækkes. Chrysotil behandling førte til aneuploidi der varede efter 8 dage for nyttiggørelse (P 0,001).

Efter 48 timers chrysotil eksponering efterfulgt af 2 dages restitution, blev aneuploide befolkning består hovedsageligt af bi og multinuclear celler. Men efter længere inddrivelse gange i fiber-frit medium (4 og 8 dage), aneuploide kerner var for det meste i mononukleære celler (tabel 2).

Cell cyklus ændringer efter chrysotil behandling

cellecyklussen i HK2 kontrolceller og i celler behandlet med chrysotil i 48 timer efterfulgt af 2, 4 og 8 dages restitution i fiber medium blev analyseret ved flowcytometri. Behandlingerne blev udført med kun én chrysotil koncentration (125 ug /ml). Salg

cellecyklusbegivenheder blev klassificeret som hypodiploid /apoptotiske, G1, S, G2 /M og hypertetraploid celler. I lighed med forsøgene med DNA kvantificering, blev det diploide gruppe bestemt ifølge toppen af ​​G0 /G1 celler i histogrammerne.

I histogrammerne, den første bemærkelsesværdige chrysotil-induceret ændring i cellecyklus var en stigning i hypodiploid /apoptotisk celle formation. Men hyppigheden af ​​disse celler faldt efter en lang periode med opsving, når kontrollen værdi efter 8 dage for nyttiggørelse (tabel 3).

Chrysotil-behandlede celler udviste en 12% lavere antal G1 celler sammenlignet med kontrolceller, og viste også en 5% større antal G2 /M-celler end gjorde kontrolceller (tabel 3). Disse forskelle forekom uanset varigheden af ​​tilbagebetalingsperioden, og blev mere udtalt efter længere opsving. Når antallet af celler i S-fase blev evalueret, observeredes ingen forskel mellem kontrol- og chrysotil-behandlede celler (fig. 2, A). Salg

Celler behandlet med chrysotil og fik lov at komme sig i 2, 4 eller 8 dage i fiber-frit medium blev analyseret ved flowcytometri og ved immunfluorescens. A) Histogrammer i lineær (rød) og log (farvede) skaleres fra flowcytometri viser virkningerne af chysotile på cellecyklussen, især en stigning i antallet af G2 /M og hypertetraploid celler; B) chrysotil-behandlede celler genvindes til 2 og 4 dage viser en stigning i antallet af celler i metafase og et fald i celler i anafase og telofase sammenlignet med kontrolceller (P 0,01 i 48 timer og P 0,001 i 4 dage) .

Mitoseindeks af kontrol og chrysotil-behandlede HK2 celler blev kvantificeret ved hjælp af immunofluorescens. Analyse af mitotisk indeks viste, at det samlede antal celler i M-fase var ens i kontrol- og chrysotil-behandlede celler. I kontrolceller, antallet af celler i anafase og telofase var imidlertid større end antallet af celler i metafase, mens efter 48 timer af chrysotil behandling efterfulgt af 2 til 4 dages restitution, antallet af celler i metafase var større end den antallet af celler i anafase og telofase. Efter 8 dages restitution, antallet af celler i metafase var ens i chrysotil-behandlede og kontrolceller (fig. 2, B).

HK2 og VERO cellemorfologi og tilstedeværelse af chrysotilfibre

Kontrol og chrysotil-behandlede HK2 celler blev analyseret ved laser scanning konfokal mikroskopi, efter immunfluorescerende mærkning af mikrotubuli, actinfilamenter og kerner. Chrysotilfibre blev visualiseret ved deres autofluorescens (se detaljer i [13]). Tilstedeværelsen af ​​flerkernede og mikronucleerede celler, unormal mitose og fibre blev analyseret og kvantificeret

Efter 24 timer og 48 timer for chrysotil behandling blev lange fibre observeret interaktion med hK2 celleoverflade og actinfilamenter.; nogle små fibre fragmenter blev også påvist i celler (fig. 3, A). Ændringer i cellekultur blev observeret, såsom større antal bi- og multi-kerneholdige, mikronucleerede og apoptotiske celler. Antallet af celler med multipolær mitose også steget og nåede 7,23% af alle delende celler efter 48 timers chrysotil eksponering (i kontrol 2,37% af alle celledelinger var multipolær) (fig. 3, B). Salg

Celler blev bearbejdet ved immunofluorescens at visualisere kerner, actinfilamenter og mikrotubuli, og chrysotilfibre blev observeret af deres autofluorescens. A) Konfokal billeder hK2 celler behandlet med chrysotil i 24 timer eller 48 timer viser lange, tykke fibre interagerer med cellerne og multipolær mitose; B) ændringerne i cellemorfologi blev analyseret, og efter 24 timer eller 48 timer af chrysotil behandling, antallet af binucleated og flerkernede celler steg, og antallet af celler med mikrokerner, apoptotiske celler og celler i multipolær mitose (P 0,001) .

efter 48 timers chrysotil behandling efterfulgt af en tilsvarende opsving periode, flerkernede celler, unormal mitose og blev observeret lange og små chrysotilfibre i celler (fig. 4, a). Yderligere analyse viste, at cellerne lov til at komme i lange perioder indeholdt færre fibre; chrysotilfibre og små fiber fragmenter blev observeret i perinukleære region af celler efter 4 dages restitution, mens efter 8 dages restitution var der ingen lange fibre og nogle små fragmenter af fibre i celler (fig. 4, A). Efter 4 dages restitution, antallet af bi /flercellede celler faldet, men det var stadig højere end i kontrol- celler, dog antallet af celler i multipolær mitose og mikrokerner blev forøget (fig. 4, B). Efter 8 dages restitution, cellens morfologi af chrysotil-behandlede celler lignede kontrol celler, der omfattede mononukleære celler, celler i bipolar mitose og få mikrokerner og apoptotiske celler. Antallet af celler i multipolær mitose faldt sammenlignet med den for celler lov til at komme sig i 4 dage; Men i de chrysotil-behandlede celler, der var flere forekomster af multipolær mitose, end der var i kontrolcellerne (fig. 4, B).

Celler blev undersøgt under anvendelse af immunofluorescens at visualisere kerner, actinfilamenter og mikrotubuli blev og chrysotilfibre observeret af deres autofluorescens. A) Konfokal billeder af kontrol HK2 celler og celler behandlet med chrysotil i 48 timer og fik lov at komme sig i 2 dage, 4 dage eller 8 dage, viser cellemorfologi og tilstedeværelsen af ​​chrysotilfibre. Efter 2 dages restitution blev lange fibre observeret at interagere med celler overflade; men efter 4 og 8 dages restitution, sås kun fiber-fragmenter; B) de ændringer i cellemorfologi blev kvantificeret, og efter 48 timers chrysotil behandling og 4 dage for nyttiggørelse, antallet af bi /flercellede celler og apoptotiske celler faldet, men var stadig højere end kontroller (P = 0,30 for bi /flerkernede efter 4 dage og P = 0,05 for apoptotiske celler). Antallet af celler med mikrokerner i chrysotil-behandlede gruppe forblev større end i kontrolgruppen (P 0,001 efter 4 dage), og antallet af celler i multipolær mitose var størst (P 0,001). Efter 8 dages restitution, at antallet af celler i multipolære mitose celler forblev højere end i kontrol- celler (P = 0,02).

For at bestemme om normale celler på samme måde ville reagere på chrysotil, kulturer af VERO-celler blev udsat for chrysotilfibre i 48 timer og fik lov til at komme sig i 24 timer i fiber-frit medium, og derefter blev de behandlet ved hjælp immunofluorescens at analysere cellemorfologi. De kontrol celler bestod hovedsageligt mononukleære celler (99,29%), med sjældne celler med mikrokerner (1,55%) og ingen unormal mitose. Efter chrysotil behandling blev bi /flerkernede og celler med mikrokerner observeret i større antal end i kontrol- celler (6,34% og 3,89% henholdsvis), og multipolær mitose og cytokinese resulterer i tre datterceller blev også observeret (7,18% af alle celledelinger) ( fig. 5, A og B).

Celler blev undersøgt ved hjælp forelagt immunofluorescens at visualisere kerner, actinfilamenter og mikrotubuli, og chrysotilfibre blev observeret ved deres autofluorescens. A) Konfokal billeder af kontrolceller og celler behandlet med chrysotil i 48 timer og fik lov at restituere i 24 timer, viser cellemorfologi og tilstedeværelsen af ​​chrysotilfibre. Efter inddrivelsen blev lange fibre observeret at interagere med cellerne, og flerkernede celler blev celler med mikrokerner og celler i multipolær mitose overholdes; B) de ændringer i cellemorfologi blev kvantificeret, og chrysotil behandling førte til øget antal af celler med mikrokerner, bi /flerkernede celler, apoptotiske celler og celler i multipolær mitose (P . 0,001)

Time- lapse Microscopy: skæbner abnorme mitotiske celler og dannelsen af ​​multiple centrosomer

for time-lapse spinning disk konfokal mikroskopi blev HK2 celler transficeret med GFP-mærket α-tubulin. Hver transficerede celle blev observeret i en periode på 2-3 timer. Når en kontrolcelle i metafase blev fundet, det skred frem til anafase og nåede telofase i 30 til 100 minutter. Alle de observerede i kontrolcellerne divisioner var bipolar (fig. 6, A). Derimod når blev observeret chrysotil-behandlede celler, ca. 40% af metafaser var multipolær. Analyse af den skæbne 30 af disse celler afslørede forskellige mønstre; hver af dem blev observeret mindst to gange.

Celler transficeret med GFP-mærket α-tubulin blev behandlet med chrysotil for 24 eller 48 timer og derefter observeret af time-lapse spinning disk konfokal mikroskopi. Celler i metafase blev observeret i 2 til 3 timer. A) En tidsserie af maksimal projektion billeder, der viser en bipolar mitose der genererede kun to datterceller efter 1 time i en kontrol kultur; B) en tidsserie af maksimal projektion billeder, der viser en tripolær mitose fra en chrysotil-behandlet kultur, der ikke fremskridt gennem M-fasen; C) en tidsserie af maksimal projektion billeder, der viser en chrysotil behandlet celle, der organiserede spindel poler i en tripolær mode og skred til anafase og telofase generere tre datterceller; D) en tidsserie af maksimal projektion billeder, der viser cytokinese i en chrysotil behandlet celle, genererer tre datterceller, der erhvervede interfase morfologi; E) en tidsserie af maksimal projektion billeder af en chrysotil behandlet celle, der trådte anafase genererer fire datterceller; imidlertid cellerne fusioneret under telofase og dannede kun to datterceller.

Omkring halvdelen af ​​cellerne i multipolær metafase ikke videre til anafase i observationsperioden, forbliver i metafase med pseudo-bipolar, trepolet eller quadripolar spindler (fig. 6, B). I disse tilfælde, mikrotubuli var dynamisk, og spindel poler var mere dynamisk, når samlet i pseudo-bipolar spindler. Celler i multipolær metafase undergik også celledød, som det fremgår af udsivning af cytoplasma observeret i det lys kanal.

Nogle celler i multipolær metafase efter chrysotil behandling også skredet til anafase, telofase og cytokinese. Tripolær metafaser genererede tre datterceller forbundet af to midbodies med mikrotubuli organisation svarende til den observeret i kontrol-celler (fig. 6, C). De tre datterceller enten opholdt separeret og erhvervet en interfase morfologi 100 minutter efter begyndelsen af ​​cytokinesen (fig. 6, D), eller kondenseret under cytokinese. I disse tilfælde, to af de tre datterceller blev fusioneret og forbundet med den intercellulære bro ved to strukturer af mikrotubuli. Cellen fusion skete også under telofase indtil intercellulære bro dannelse, så to datterceller var forbundet med kun én midterstykke (Fig 6, E.)

Dannelsen af ​​multipolære spindler eller flere centrosomer blev ikke observeret under mitose.; alle forekomster af metafase var unormal siden begyndelsen af ​​observationsperioden. Således blev interfaseceller observeret at identificere ændringer, der kunne være knyttet til centrosom forstærkning, som var ansvarlig for dannelsen af ​​multipolære spindler i den efterfølgende M-fasen.

Celler i interfase med to centrosomer blev observeret, og centrosomer nærmede hinanden i stedet for at migrere til modsatte poler. Også den mikrotubulus-netværket af disse celler forblev ligner interfaseceller og dannede ikke spindler. En anden situation, der blev observeret efter chrysotil behandling var tilstedeværelsen af ​​interfasen med to centrosom-lignende organer – strukturer placeret i perinukleære region af cellen, hvor mikrotubuli blev koncentreret. Disse strukturer syntes at være dannet ved meget små prikker, der flyttes i alle optageperioden. Også cellen forblev i interfase og ikke videre til M-fasen (fig. 7, A).

Alterations som kunne være knyttet til en unormal antal centrosomer blev observeret i HK2 celler behandlet med chrysotil til 24 eller 48 timer. A) En tidsserie af billeder, der viser en celle med to centrosom like-strukturer, der ikke fremskridt til M-fasen som forventet for en celle med to centrosomer; B) en tidsserie af billeder, der viser to interfaseceller forbundet af et intercellulært bro uden midterskrog organisation. Cellerne nærmede hinanden under observationsperioden, hvilket afspejler en regression af cytokinese.

En anden mekanisme er ansvarlig for dannelsen af ​​ekstra centrosomer i celler er cytokinese fiasko. Denne proces tager for lang tid, der skal overholdes i løbet af de time-lapse eksperimenter vi udført. Imidlertid blev interfaseceller forbundet af en intercellulære bro uden midterskrog mikrotubuli organisation observeret, og cellerne nærmede hinanden under observationsperioden (fig. 7, B).

Diskussion

Chrysotil er betragtes som mindre skadelige for menneskers sundhed end andre typer af asbest, på grund af manglen på en stærk sammenhæng mellem chrysotil fiber eksponering og udvikling af carcinomer og mesotheliomas. Ikke desto mindre har nogle undersøgelser vist potentialet af chrysotil til at forårsage DNA-skader og cellulære forandringer

in vitro

og lungeskader

in vivo

. Den nuværende arbejde analyseret cellulære ændringer relateret til aneuploidi og cellecyklus forstyrrelser, og kontrolleres, som ændringer fortsætter i kultur efter 2, 4 og 8 dage for nyttiggørelse i fiber-frit medium. Også ændringer i cellemorfologi var relateret til tilstedeværelsen af ​​fibre i kultur i de første 24 timer og 48 timer for chrysotil behandling og også efter længere tids bedring. Vi analyserede også multipolær mitose og centrosom forstærkning, som er ekstra funktioner i chrysotil behandling, der er tæt knyttet til aneuploidi.

Analysen af ​​HK2 celler ved konfokal mikroskopi svælgede at chrysotilfibre ikke fortsætter i cellekultur efter 8 dage for nyttiggørelse, og efter 4 dages restitution kun fragmenter og små fibre var til stede i perinukleære region nogle celler. Efter 4 og 8 dages restitution, cellemorfologi lignede også, at af kontrolceller med hensyn til tilstedeværelsen af ​​bi /flercellede og celler med mikrokerner. Men den aneuploide befolkning varet i cellekultur efter 4 og 8 dage for nyttiggørelse i fiber-frit medium, og de procentdele af aneuploide kerner var altid omkring 10% af den samlede befolkning. De data, som DNA-kvantificering viste også, at aneuploide kerner var for det meste i mononukleære celler efter 4 og 8 dage på genopretning, mens i de første dage på opsving de aneuploide kerner var i bi /flerkernede celler. Alle disse observationer er i overensstemmelse med de data, som flowcytometri, som indikerede, at chrysotil-behandlede HK2 celler viste øget hipertetraploidy selv efter 8 dages restitution.

Tilstedeværelsen af ​​aneuploide celler er en konsekvens af chrysotil behandling observeret efter 48 timer af eksponering, der fortsætter selv efter 72 timer for nyttiggørelse efter behandlingen [11], [13]. Disse celler kan være relateret til udvikling af kræft, fordi tab eller gevinst af et kromosom – eller en del heraf – kan indføre mutationer, der kræves for malign transformation. Vi viser i denne undersøgelse, at induktionen af ​​aneuploidi i celler er chrysotil koncentrationsafhængig, og som beskrevet ovenfor, at procentdelen af ​​aneuploide celler forblev høj i forhold til kontrolceller efter op til 8 dages restitution i fiber-frit dyrkningsmedium.