PLoS ONE: A Novel Biomarkør Panel Undersøgelse Reaktion på gemcitabin med eller uden Erlotinib for kræft i bugspytkirtlen Therapy i NCIC Clinical Trials Group PA.3

Abstrakt

Formål

NCIC Clinical Trials Group PA.3 var et randomiseret kontrol forsøg, der viste forbedret samlet overlevelse (OS) i patienter, der fik erlotinib foruden gemcitabin for lokalt fremskreden eller metastatisk pancreascancer. Forud for behandlingen, patienterne havde plasmaprøver trukket til fremtidig undersøgelse. Vi forsøgte at identificere biomarkører inden for disse prøver.

Eksperimentel Design

Brug af nærhed ligeringsassayet (PLA), blev en sonde panel bygget fra kommercielt tilgængelige antistoffer til 35 vigtige proteiner udvalgt fra en global genetisk analyse af pancreascancer, og anvendes til at kvantificere proteinniveauer i 20 pi patientens plasma. For at bestemme, om nogen af ​​disse proteiner niveauer uafhængigt forbundet med OS, univariate og mulitbaraible Cox modeller blev anvendt. Derudover undersøgte vi sammenhængen mellem biomarkør udtryk og sygdom scenen på diagnose ved hjælp af Fishers eksakte test. Sammenhængen mellem Erlotinib følsomhed og hver biomarkører blev vurderet ved hjælp af en test for interaktion mellem behandling og biomarkør.

Resultater og konklusion

Af de 569 egnede patienter, 480 havde prøver til rådighed for undersøgelsen. Prøver blev tilfældigt tildelt i uddannelse (251) og validering sæt (229). Blandt alle patienter, forhøjede niveauer af interleukin-8 (IL-8), carcinoembryonisk antigen (CEA), hypoxi-inducerbar faktor 1-alfa (HIF-1 alpha) og interleukin-6 blev uafhængigt associeret med lavere OS, mens IL- 8, CEA, blodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa- og mucin-1 var forbundet med metastatisk sygdom. Patienter med forhøjede niveauer af receptortyrosinkinase-proteinkinase erbB-2 (HER2) ekspression havde forbedret OS når de behandles med erlotinib sammenlignet med placebo. Afslutningsvis PLA er et stærkt værktøj til at identificere biomarkører fra arkiveret, lille volumen serumprøver. Disse data kan være nyttige at stratificere patientresultater uanset terapeutisk intervention

Prøve registrering

ClinicalTrials.gov NCT00040183

Henvisning:. Shultz DB, Pai J, Chiu W, Ng K, Hellendag MG, Heestand G, et al. (2016) A Novel Biomarkør Panel Undersøgelse Reaktion på gemcitabin med eller uden Erlotinib for kræft i bugspytkirtlen Therapy i NCIC Clinical Trials Group PA.3. PLoS ONE 11 (1): e0147995. doi: 10,1371 /journal.pone.0147995

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Modtaget: September 24, 2015; Accepteret: 10. januar, 2016 Udgivet: 25 januar 2016

Copyright: © 2016 Shultz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante findes i papiret og dets Støtte Information filer data

Finansiering:. Finansiering af denne undersøgelse blev leveret af My Blue Dots og Sydney Ng Memorial Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: GH har fungeret som konsulent for Bayer, Merrimack, og Genomic Health. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDCA) er en aggressiv malignitet med en dårlig prognose. Patienter diagnosticeret med resektable tumorer er potentielt helbredes, men lokalt fremskreden (LA) eller metastatisk PDCA er ensartet fatal. [1, 2] Forbedret biomarkører er nødvendige for at forfine den terapeutiske styring af avancerede PDCA og forbedre resultaterne.

Valideret prognostiske biomarkører for pancreas duktalt adenokarcinom (PDCA) er begrænsede. CA 19-9, den mest etablerede biomarkør for PDCA, har en sensitivitet og specificitet for bugspytkirtelkræft på ca. 80% og 90%, henholdsvis [3] og i nogle scenarier niveauer er prædiktive for kemoterapi eller strålebehandling svar [4, 5]. Imidlertid, CA 19-9 kan falsk forhøjede hos patienter med obstruktiv leversygdom eller pancreatitis og falsk negativ i patienter, som mangler Lewis-antigen glycosyltransferase (5-10% af befolkningen). Desuden, CA 19-9 niveauer giver begrænset indsigt i de biologiske funktioner af PDCA der kan dirigere systemisk terapi. Derfor er der behov bedre biomarkører til at guide patientpleje.

PA.3 var en randomiseret fase III studie udført af NCIC Clinical Trials Group, der viste forbedret overlevelse hos patienter behandlet med erlotinib plus gemcitabin sammenlignet med gemcitabin alene, i der, EGFR ikke var prædiktiv for en reaktion på erlotinib [6]. I denne aktuelle undersøgelse i forbehandling plasmaprøver fra patienter indskrevet på PA.3, søgte vi at identificere biomarkører, der var prognostiske for overlevelse samt forudsigende for en reaktion på erlotinib.

Metoder

Plasmaprøver blev opnået fra 480 af 569 patienter indskrevet på NCIC kliniske forsøg gruppe (CTG) PA.3 (Clinical.Trials.gov Identifier NCT00040183), en dobbelt blindet internationalt, fase III forsøg med erlotinib (235) versus placebo plus gemcitabin (245) patienter med lokalt fremskreden eller metastatisk pancreas adenocarcinom [6]. Prøver blev opnået på tidspunktet for indskrivning. Det primære endepunkt for dette forsøg var OS. Beskrevet i dette manuskript undersøgelse blev godkendt af Stanford Research Compliance Office: IRB # 5136 (protokol 27492). På tidspunktet for optagelse i PA.3 blev patientens informerede skriftlige samtykke indhentes, og under godkendelse fra vores egen overholdelse forskning kontor, vi fik ikke separat informeret skriftlig eller mundtlig samtykke fra patienter til vores undersøgelse.

Før til laboratorieanalyse blev prøver randomiseret til en uddannelse (251 i alt, 129 fik erlotinib) eller en validering (229 i alt, 106 fik erlotinib) kohorte. Nærheden ligeringsassayet (PLA) [7] blev anvendt til at måle den relative koncentration af 35 biomarkør proteiner (tabel 1). Kort fortalt, blev PLA probesæt hvormed blokeret serum og inkuberet ved 37 ° C i to timer. Derefter blev ssDNA skinner med ligase tilsat robot (Velocity11, Agilent Technologies) og inkuberet ved 30 ° C i 15 minutter. Endelig blev uracil-DNA Excision Mix (Epicentre) tilsat, og det resulterende DNA blev amplificeret under anvendelse af PCR med Platinum Taq (Invitrogen) og PCR-produktet blev derefter amplificeret med iTaq med SYBR (Bio-Rad) ved anvendelse af kvantitativ PCR (Model 7500, Applied Biosystems) for at bestemme de relative koncentrationer af hver enkelt potentiel biomarkør.

biomarkør sonder blev udviklet til tidligere undersøgelser og supplerende blev syntetiseret til denne undersøgelse. [7, 8] potentielle biomarkører blev identificeret gennem et globalt genetisk analyse [9] og bestod af en omfattende litteratursøgning for at identificere offentliggjorte datasæt, efterfulgt af en vurdering af, hvorvidt potentielle biomarkører blev udtrykt på enten celleoverfladen eller i plasma, og endelig, om biomarkører specifikt blev forhøjet i bugspytkirtelkræft versus kronisk pancreatitis . Af de potentielle kandidater er identificeret i denne publikation, blev 320 bekræftet til at blive udskilt og til stede ved forhøjede niveauer i serum af patienterne. Derefter opnåede vi en genekspressionsanalyse datasæt i pancreas duktal adenokarcinom fra Gene Expression Omnibus [10, 11], og efter identifikation af niveauerne af genekspression for de 320 potentielle biomarkører for bugspytkirtelkræft ovenfor beskrevne, vi anvendte en k-means clustering til identificere 13 forskellige underkategorier. Fra hver af disse valgte vi 5 biomarkører, der skal indgå i vores panel, for i alt 65 prober. Adskillige yderligere biomarkører blev identificeret ved direkte litteratursøgning. Fordi kommercielt tilgængelige antistoffer til mange af de biomarkører identificerede ikke var tilgængelig, blev mindre end halvdelen af ​​de potentielle PLA sonder bygget (tabel 1).

biomarkør niveauer blev dikotomiseret i høje og lave kategorier baseret på, om de var større end medianen. Vi næste testet for en statistisk signifikant sammenhæng med den samlede overlevelse (OS) i både uddannelse og validering kohorter bruger Cox regressionsmodeller. Alder ( 70 vs. ≥70), køn (kvinde vs. mand), race (hvid vs ikke-hvide), ECOG performance status (0-1 vs. 2), smerteintensitet (≤20 vs. 20), og sygdomsstadie (III vs. IV) var andre kovariater inkluderet i de multivariable regressionsmodeller. Hver biomarkør blev analyseret individuelt under anvendelse af Cox-modeller, herunder det samme sæt af kovariater anført ovenfor. I en særskilt analyse, vi undersøgte, om biomarkør udtryk (over eller ikke over medianen) var forbundet med sygdom scene. Biomarkører, hvis ekspression blev signifikant associeret med stadium blev bestemt under anvendelse af Fishers eksakte test. Endelig for hver biomarkør, vi testede effekten forudsige for forbedret overlevelse på grund af erlotinib ved hjælp af en multivariabel Cox model herunder en yderligere interaktionen mellem behandling (erlotinib versus placebo) og den binære biomarkør udtryk niveau.

Resultater

Proteiner hvis koncentrationer, efter dichotomizing baseret på at være større end medianen, der er forbundet signifikant (p 0,05) med OS i både uddannelse og validering kohorte på univariate eller multivariable analyse er vist i figur 1A og 1B, henholdsvis . De viste resultater er for patienter i valideringen kohorte. Som vist på multivariabel analyse, høj interleukin 8 (IL-8) niveauer blev forbundet med dårlig overlevelse i begge behandlingsgrupper, mens højere carcinoembryonisk antigen (CEA) og hypoxi induceret faktor 1 alfa (HIF-1alpha) niveauer blev forbundet med ringere overlevelse hos patienter behandlet med erlotinib. Fuldstændige resultater findes i S1 og S2 Tables

hazard ratio (HR) (af høj til lav koncentration biomarkør) og p-værdier er vist for biomarkører, der var signifikant associeret (p 0,05). Med overlevelse. De viste resultater er fra validering kohorter.

Fireogtyve procent af patienterne indskrevet på PA.3 havde stadie III (lokalt avanceret) snarere end metastatisk sygdom (stadie IV). I en separat analyse undersøgte vi hvorvidt biomarkør koncentration (større end median) var forbundet med fase (III vs. IV). Signifikant flere patienter med høj IL-8, CEA, blodpladeafledt vækstfaktor alpha (PFGFRalpha), og mucin 1 (MUC-1) niveauer havde stadie IV metastatisk sygdom. (Fig 2). De viste resultater er fra validering kohorten

yderste periferi og p-værdier er vist for biomarkører, der var signifikant forbundet (p 0,05).. De viste resultater er fra validering kohorte.

Endelig har vi forsøgt at identificere biomarkører, der forudsagt for en respons på behandling ved at måle interaktionen effekten mellem erlotinib behandling, biomarkør niveau, og OS. I en multivariabel analyse, hvor biomarkør niveauer blev analyseret ved at være større eller mindre end medianen blev ingen signifikant associeret med erlotinib respons i både træning og validering sæt. Men når niveauet af hver markør blev undersøgt som en kontinuerlig variabel og de statistiske begrænsninger var, afslappet til p 0,1 for sættet træning og p 0,05 i valideringen sæt, receptor tyrosin-protein kinase erbB-2 (HER2) alene var identificeret som havende en signifikant interaktion effekt med erlotinib respons (HR for interaktion 0,95, 95% CI 0,72-1,26, p = 0,08 i uddannelse kohorte og 0,7, 95% CI 0,5-0,99, p = 0,004 i validering kohorte). I valideringen kohorte, havde patienter med HER2 over medianen forbedret overlevelse ved behandling med erlotinib (median OS 8.2 vs. 5 måneder, HR 0,36, 95% CI 0,21 til 0,63, p 0,0001), mens ingen signifikant forskel mellem erlotinib og placebo var fundet fra patienter med HER2 2 niveauer lavere end median (median OS 6,0 vs. 8,3 måneder, HR 1,28, 95% CI 0,8-2,1, p = 0,3) (fig 3).

median samlet overlevelse (med 95 % CI) blev forbedret med erlotnib behandling hos patienter med højere end median niveauer af plasma HER2 (8,2 vs. 5,0 måneder), men ikke hos patienter med lavere plasma HER2 (6,0 vs. 8,3 måneder).

diskussion

NCIC CTG PA.3 bevist sin hypotese, at erlotinib plus gemcitabin resulterer i forbedret OS sammenlignet med gemcitabin alene for lokalt fremskreden eller metastatisk PDCA dog median OS i den eksperimentelle og kontrollere arme afveg kun 0,3 måneder (6,2 versus 5,9). Formålet med denne aktuelle undersøgelse var at identificere biomarkører, der var prognostiske i enten arm, korreleret med metastatisk versus lokalt fremskreden sygdom, eller forprogrammeret til forbedret overlevelse hos patienter behandlet med erlotinib versus placebo, når det tilsættes til gemcitabin.

plasma proteiner, hvis niveauer blev forbundet med overlevelse i vores undersøgelse, IL-6 [12], IL-8 [13], CEA [14], og HIF-1 alpha [15, 16], er tidligere blevet identificeret som prognostisk i lokalt fremskreden eller metastatisk pancreascancer. HIF-1 alpha, en transkriptionsfaktor kritisk for hypoxi signalering, ikke secerneres, og er formentlig påvises i plasma på grund af tumor lysis. IL-6 [17] og IL-8 [18], som kan secerneres fra tumor- eller stromale væv, er hypoxi induceret proteiner, hvilket antyder, at pancreascancer kan udbrede sig gennem hypoxi signalering via HIF-1 alpha, selvom deres rolle i at fremme sygdom progression er uklar. IL-8 og CEA var også mere tilbøjelige til at være forhøjet hos patienter med metastatisk sygdom, såvel som, MUC-1 og PDGFRalpha. Sådanne biomarkører kunne anvendes til at identificere okkult metastatisk sygdom hos patienter, som ville så blive optimalt behandlet med systemisk kemoterapi, dog udelades aggressiv lokal terapi. MUC-1 overudtrykkes i pancreascancer, og er blevet vist at associere med HIF-1 alpha at drive ekspressionen af ​​hypoxi-induceret onkogener, herunder PDGF [19, 20], hvis receptorer, PDGFRalpha og PDGFRbeta regulere PDCA cellevandring og metastase [ ,,,0],21, 22].

HER2 blev identificeret som en potentielt prædiktiv for erlotinib lydhørhed i vores undersøgelse. Dette er den første klinisk eksempel at linke sygdom reaktion på erlotinib med en blod biomarkør. For nylig,

HER2

blev vist at være amplificeret i 2% af 469 ikke-forbehandlet PDCA tumorer [23]. HER2-signalering, der hæmmes af erlotinib [24], er blevet rettet i HER2 + PDCA, vurderet ved immunhistokemi, hjælp trastuzumab, i mindst 2 tidligere fase II-undersøgelser [25, 26], hverken som viste gunstige resultater sammenlignet med historiske resultater . Det er blevet erkendt, at HER2 amplifikation skal kontrolleres ved hjælp af FISH eller andre metoder i modsætning til IHC alene [27], hvilket kan have ført til de tidligere negative forsøg. Vi hypotesen, at den beskedne overlevelse fordel af at tilføje erlotinib til gemcitabin i PA.3 forsøget kan have været forbedret ved hjælp af biomarkører såsom HER2 at vælge for patienter med størst sandsynlighed vil reagere på erlotinib.

CA 19-9 var ikke identificeret som et prognostisk biomarkør i denne undersøgelse, i modsætning til tidligere rapporter [28-31]. En mulighed for dette resultat er, at i den nuværende undersøgelse blev PLA kun bruges til at rapportere de relative mængder af proteiner i denne meget multi-plexed assay. Analyse CA 19-9 med en median afskæringsværdi i stedet for en absolut proteinkoncentration kan have påvirket disse resultater. En tidligere undersøgelse med PLA fandt, at 19-9 niveauer selv CA var 16 gange højere i bugspytkirtlen patienter sammenlignet med normale kontroller, inden denne population af lokalt avancerede patienter, CA 19-9 var heller ikke ikke prognostisk af resultatet. [8].

Vores undersøgelse har adskillige begrænsninger. Vi målte et relativt lille antal af proteiner, og det ikke er klart, at alle PLA prober var i stand til at påvise deres mål med tilstrækkelig dynamisk område. På grund af prøver begrænsede væv, var vi ikke i stand til at bekræfte, om markørerne identificerede var også over-udtrykkes i væv og ligeledes på grund af begrænset tilgængelighed af plasmaprøver, vi ikke kan bekræfte vores resultater af en anden metode, såsom enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Imidlertid har nøjagtigheden af ​​PLA blevet verificeret via ELISA i tidligere undersøgelser, og de markører, der blev identificeret i den aktuelle undersøgelse har været impliceret af andre som værende prognostiske for PDCA resultater. Endelig er den for nylig rapporteret stort randomiseret studie i bugspytkirtelkræft (LAP07 undersøgelse) l undladt at bekræfte gavn for erlotinib for PDCA, [32] understreger behovet for prædiktive biomarkører for erlotinib og andre terapier til behandling af denne udfordrende malignitet.

konklusioner

Vi identificerede flere biomarkører, der var forbundet med overlevelse og sygdom etape i PDCA. Her2 kan også være prædiktiv for en reaktion på erlotinib. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bekræfte disse resultater i en uafhængig datasæt.

Støtte Information

S1 Table. Resultater af univariate og multivariable analyser, for gemcitabin plus placebo og gemcitabin plus erlotinib kohorter, herunder validering og uddannelse sæt, af sammenhængen mellem biomarkør niveauer og overlevelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0147995.s001

( DOCX)

S2 Table. . Nærmere oplysninger om Multivariable Analyser for de biomarkører identificeret som værende signifikant korrelerede (p 0,05) til samlet overlevelse (data fra validering prøver)

Resultater vist angiver korrelationen for hver variabel til overlevelse: HR (CI) og p-værdi

doi: 10,1371 /journal.pone.0147995.s002

(DOCX)

tak

Vi vil gerne takke Justin Bui for korrekturlæsning og formatering dette manuskript. A.C. anerkender også støtte fra My Blue Dots.