PLoS ONE: ALDH1A1 Bevarer kræft i æggestokkene Stem Cell-lignende egenskaber ved Ændret forordning af Cell Cycle Checkpoint og DNA Reparation Network Signaling

Abstrakt

Målsætning

Aldehyd dehydrogenase (ALDH), der udtrykker celler har været karakteriseret som besidder stamcellelignende egenskaber. Vi evaluerede ALDH + æggestokkene cancer stamceller celle-lignende egenskaber, og deres rolle i platin modstand.

Metoder

isogene æggestokkene kræft cellelinjer til platin følsomhed (A2780) og platin resistente (A2780 /CP70) som samt ascites fra æggestokkene kræftpatienter blev analyseret for ALDH + ved flowcytometri for at bestemme dens association til platin modstand, gentagelse og overlevelse. En stabil shRNA knockdown model for ALDH1A1 blev anvendt til at bestemme dets effekt på kræft stamceller celle-lignende egenskaber, cellecykluskontrolpunkter og DNA reparation mæglere.

Resultater

ALDH status direkte korreleret til platin modstand i primære kræft i æggestokkene prøver fås fra ascites. Patienter med ALDH

HØJ viste signifikant lavere progressionsfri overlevelse end patienter med ALDH

Lav celler (9 vs. 3 måneder, henholdsvis p 0,01). ALDH1A1-knockdown signifikant svækket klonogene potentiale, PARP-1 proteinniveauer, og omvendt iboende platinmodstandstermometer. ALDH1A1-knockdown resulterede i dramatisk fald i KLF4 og p21 protein niveauer og dermed fører til S og G2 fase ophobning af celler. Stigninger i S og G2-celler demonstrerede forøget ekspression af replikation stress forbundet Fanconi Anæmi DNA reparation proteiner (FANCD2, FANCJ) og replikation checkpoint (pS317 Chk1) blev berørt. ALDH1A1-knockdown induceret DNA-skader, fremgår af robust induktion af γ-H2AX og BAX medieret apoptose, med betydelige stigninger i BRCA1 udtryk, hvilket tyder ALDH1A1-afhængig regulering af cellecyklus checkpoints og DNA reparation netværk i kræft i æggestokkene stamceller-lignende celler.

Konklusion

Disse data tyder på, at kræft i æggestokkene celler, der udtrykker ALDH1A1 kan opretholde platin modstand ved ændret regulering af cellecyklus checkpoint og DNA-reparation netværk signalering

Henvisning:. Meng E, Mitra A , Tripathi K, Finan MA, Scalici J, McClellan S, et al. (2014) ALDH1A1 Bevarer kræft i æggestokkene Stem Cell-lignende egenskaber ved Ændret forordning af Cell Cycle Checkpoint og DNA Reparation Network Signaling. PLoS ONE 9 (9): e107142. doi: 10,1371 /journal.pone.0107142

Redaktør: Robertus AM. de Bruin, University College London, England

Modtaget: 13. maj 2014; Accepteret: August 7, 2014; Udgivet 12. september, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Gynecologic Cancer Foundation Sherri er fra en Whisper til en Roar, Kvinders Motorcycle Foundation æggestokkene Cancer Research Award og The Eleanor Ruth Frenkel fond for æggestokkene Cancer Research (RPR); NIH tilskud R01GM098956, og Abraham Mitchell Endowment tilskud (K.P.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest dødbringende af alle gynækologiske maligniteter, der påvirker mere end 22.000 kvinders liv om året i USA alene. Selvom størstedelen af ​​patienter med ovariecancer opnå en fuldstændig indledende klinisk respons på cytoreduktive kirurgi efterfulgt af kombinationskemoterapi, vil de fleste opleve en gentagelse og desværre bukke under for progressiv sygdom [1]. Vital til prognosen for patienter med ovariecancer er sygdommens varierende følsomhed over for platin agenter. Selvom et kontinuum, patienter stratificeret efter deres sygdom oprindelige reaktion på platin kemoterapi som enten “platin-følsomme” eller “platin-resistent” defineret ved længden af ​​tilbagefald interval. Dette spektrum er yderst prædiktive af kliniske endepunkter, når en kræft opstår igen, succes kirurgi og /eller kemoterapi ved recidiv, og en patients samlede overlevelse.

I betragtning af heterogenitet kræft, ikke alle celler i en malignitet ville forventes at være resistente over for kemoterapi. Kræften stamceller (CSCS) teori foreslår, at disse resistente celler omfatter kun et mindretal af celler i en kræft, men er alene ansvarlig for langsigtet tilbagefald [2]. Derved uanset de indledende svarprocenter, hvis kemoterapi undlader at udrydde disse resistente CSCS, så kræft vil regenerere og en recidiv eller progression af sygdommen vil forekomme. Identifikationen af ​​disse resistente celler og fastlæggelsen af ​​deres medfødte molekylære veje er altafgørende i at finde mere effektive målrettede behandlinger [3]. Derfor er et strategi til forbedring af succesen af ​​ovariecancer terapi er at forbedre CSCS følsomhed over for platin agenter. Overvinde platinmodstandstermometer ville være afgørende i behandlingen af ​​ovariecancer med de potentielle fordele ved forbedrede responsrater, længere overlevelse, og flere kure.

For nylig aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet har vist sig at være en meget attraktiv CSCS markør i mange cancere, såsom lunge [4], bryst [5], prostata [6], thyroid [7], hoved- og halscancer [8], og ovariecancer [9] – [12]. ALDH familie omfatter cytosol isoenzymer er ansvarlige for oxiderende intracellulære aldehyder og dermed bidrage til oxidation af retinol til retinsyre i begyndelsen stamcelledifferentiering [4]. Den menneskelige ALDH superfamilien består i øjeblikket af 19 kendte formodentlig funktionelle gener i 11 familier og 4 underfamilier med forskellige kromosomale steder. Af de store ALDH familier og underfamilier, har ALDH1A1 været et gyldigt markør blandt flere maligne væv. Det holder det attraktive skelnen af ​​ikke kun at være en potentiel markør for stemness men potentielt spille en rolle i biologi tumorfremkaldende celler såvel [13]. Derudover havde ALDH1A1 subpopulationen påvist at være forbundet med kemoresistens i æggestokkene kræftpatienter [9], [14].

Nylige undersøgelser i brystkræft modeller viste en interessant sammenhæng mellem BRCA1 og stamcelle differentiering [15], [16]. BRCA1 også har vist sig at spille en vigtig rolle i brystvæv differentiering ved at regulere Notch signalering og tumor respons på anti-endokrin behandling [14]. Specielt er et omvendt forhold mellem ALDH1A1 ekspression og BRCA1 er bemærkelsesværdigt i forbindelse med at studere cancer stamceller-lignende celler og kemoresistens. BRCA1 spiller en vigtig rolle i at beskytte genomet fra afvigende DNA-læsioner, og mutationer eller sletning i dette gen fører til genome ustabilitet og øget forekomst af bryst-, ovarie- og andre kræftformer [17]. Som svar på DNA-skader lokaliserer det hurtigt til de steder, hvor dobbelte strengbrud (DSB) og medierer flere signalering reaktioner, herunder cellecyklus checkpoints og valg af DNA-reparation vej til at løse disse læsioner [17] – [19]. Imidlertid har BRCA1 status og ALDH + ovariecancer vedligeholdelse stamceller-lignende celler og modstandskraft over for kemoterapi ikke undersøgt.

Vi viser, at ALDH + fænotype besidder CSC karakteristika forøget invasion, kolonidannelse, og stamcellemarkører. Den specifikke ALDH1A1 isotype synes at være ansvarlig for ALDH-medieret platin modstand både klinisk såvel som

i in vitro

modeller. Vores data understøtter en ALDH1A1-medieret platin resistens mekanisme i kræft i æggestokkene via en ændret regulering af cellecyklus checkpoint og DNA-reparation netværk signalering.

Materialer og metoder

cellelinjer og kulturer

A2780 og en isogen cisplatin resistente A2780 /CP70 cellelinje blev genereret som beskrevet tidligere [20].

ALDEFLUOR Assay og fluorescens-aktiveret cellesortering

for at isolere cellepopulationen med en høj ALDH enzymatisk aktivitet, ALDEFLUOR assaykit (StemCell Technologies Inc.) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Efter trypsinisering blev cellerne suspenderet i ALDEFLUOR assaybuffer indeholdende ALDH enzymsubstrat BODIPY-aminoacetaldehyd (Baaa) og inkuberet ved 37 ° C i ca. 40 minutter. Celler blev farvet under anvendelse af de identiske betingelser med det specifikke ALDH inhibitor, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), for at tjene som en negativ kontrol. Flowcytometri sortering blev gennemført ved hjælp af en BD Bioscience Aria II Sorp celle sorteringsanlæg.

kræftfremkaldende egenskaber

Efter sortering for ALDH fænotyper (ALDH + vs. ALDH-), Matrigel invasion og bløde agar kolonidannelse analyser blev udført som tidligere beskrevet [21]. For at evaluere virkningen af ​​kemoterapi på kolonidannelse blev celler behandlet med frisk medium med 20 pM carboplatin tilføjes hver 3-4 dage. Synlige kolonier ( 50 celler). Blev talt på fem tilfældigt udvalgte 40X mikroskopiske felter i hver brønd

CellTiter-Glo Selvlysende cellelevedygtighed Assay

Sorteret A2780 /CP70 celler blev udsået på tætheden af 4000 celler per brønd i 96-brønds sort plade med klar bund (Corning, NY, USA). Den følgende dag blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af carboplatin op til 72 timer. Efter 24, 48 og 72 timer blev 100 pi CellTiter-Glo-reagens (Promega) per brønd tilsat, inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur og luminescens blev registreret på et Synergy H4 Hybrid Reader (BioTek).

real-time kvantitativ RT-PCR

real-time kvantitativ RT-PCR blev udført som tidligere [21] beskrevne. Primere og prober til TaqMan systemet blev udvalgt fra Applied Biosystems hjemmeside [BMI1 assay ID: Hs00180411_m1, c-myc assay ID: Hs00905030_m1, Kruppel-lignende faktor 4 (KLF4) assay ID: Hs00358836_m1, oct3 /4 assay ID: Hs01009568_m1, S100 calcium protein A1 (S100A1) assay ID: Hs00984741_m1, ALDH1A1 assay ID: Hs00946916_m1, CDKN1A (p21) assay ID: Hs00355782_m1, intern kontrol glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase assay ID: Hs99999905_m1]. De relative ekspression mRNA-niveauer af BMI1, c-myc, Oct3 /4, KLF4, S100A1, ALDH1A1, p21, blev beregnet under anvendelse af ΔΔCt fremgangsmåden og normalisering til GAPDH.

Lentiviral shRNA Vector Transfektion

Seks forskellige pGIPZ Lentiviral shRNA glycerolstamopløsninger mod ALDH1A1 og en negativ kontrol shRNA (Thermo Scientific) blev transficeret ifølge producentens anvisninger. A2780 /CP70-celler blev udpladet med en tæthed på 2 x 10

5 celler pr brønd i en 6-brønds plade i 18-24 timer. For hver brønd blev 2 ug shRNA plasmid-DNA (pGIPZ) transficeret ind A2780 /CP70 hjælp Arrest-In reagens (Thermo Scientific, USA). Puromycin (0,8 ug /ml) blev anvendt til at vælge de transfekterede celler. Efter optimeringen blev ALDH1A1-knockdown effektivitet af de enkelte shRNAs evalueret ved hjælp af real-time kvantitativ PCR og Western Blot. Vector 398.453 demonstrerede den mest effektive transfektion med over 95% knockdown effekt af ALDH1A1 og blev anvendt til alle shRNA knockdown eksperimenter.

Western blot-analyse Salg

Dyrkede celler blev opsamlet i NP-40 lysispuffer med 10 pl /ml proteaseinhibitor cocktail (Sigma) og underkastet immunblotting analyse ved standardteknikker under anvendelse af antistoffer mod ALDH1A1, FANCJ, KLF4 (Sigma-Aldrich), FANCD2, PARP-1, XRCC1, β-actin, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), og p21, phospho-Chk1 (Ser317), BRCA1 antistoffer (Cell Signaling Technology)

RT

2 Profiler PCR Array

Den menneskelige Cancer Drug Resistance Cellecyklus RT

2 Profiler PCR Array (Qiagen, USA) blev anvendt til at profilere ekspressionen af ​​84 gener involveret i cancer lægemiddelresistens og cellecyklus med fem husholdningsgener pr producentens anvisninger. Styringer til genomisk DNA-kontaminering og for effektiviteten af ​​RT-PCR og PCR-reaktioner blev også analyseret. PCR arrays blev kørt under anvendelse af en Bio-Rad iQ5 realtid detektionssystem (Bio-Rad).

Cell Cycle Analysis ved flowcytometri

A2780 /CP70 celler blev transficeret med kontrol eller shRNAs målretning til ALDH1A1 anvendelse af lipofectamin 2000 (Life Technologies), og celler blev opsamlet og farvet for cellecyklusanalyse ifølge producentens instruktioner (BD Biosciences). Celler ved 10

6 blev resuspenderet med 300 pi PBS, og 700 pi iskold methanol for at fikseres cellerne natten over ved -20 ° C. Celler blev vasket to gange med PBS, og derefter farvet med 500 pi propidiumiodid (BD Bioscience) ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke. Cellecyklus-profiler blev analyseret ved flowcytometri.

Apoptose Assay

A2780 /CP70 celler transficeret med negativ kontrol eller shRNA-ALDH1A1 blev induceret til apoptose ved behandling med 1,0 pM staurosporin i 6 timer [22 ], [23]. APC-Annexin V og 7-AAD-farvning blev udført ifølge producentens anvisninger. Hver gruppe indeholder tre isotypekontroller: ufarvede celler; celler farvet med APC Annexin V alene; celler farvet med 7-AAD alene. Prøver blev analyseret ved flowcytometri.

PARP aktivitetsassay

PARP-aktivitet blev målt ved anvendelse HT PARP in vivo Farmakodynamiske Assay II kit (Trevigen). Efter behandling med 100 uM carboplatin i 45 minutter, blev A2780 /CP70 celler transficeret med negativ kontrol eller shRNA-ALDH1A1 vasket to gange med 5 ml varm (37 ° C) PBS. Celler blev skrabet over i 300 pi kold celle lysis buffer og inkuberet på is i 15 minutter. SDS blev tilsat til prøverne til en endelig SDS-koncentration på 1% og inkuberet ved 100 ° C i 5 minutter. Når prøverne afkølet til stuetemperatur, blev 0,01 volumen 100X Magnesium kation og 2 pi DNase I (2 enheder /ul) tilsat til prøverne og inkuberet i yderligere 90 minutter ved 37 ° C. Efter en kort centrifugering blev supernatanter opsamlet og PolyADP-ribose (PAR) niveauer i celleekstrakterne blev kvantificeret ved hjælp af ELISA-metoden.

Klinisk Korrelation

Alle deltagere forudsat at deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse, og den institutionelle gennemgang bord på University of South Alabama Health System godkendt denne undersøgelse, samt godkendelsesproceduren. Ascites fra 15 konsekutive patienter, der gennemgår kirurgi for fremskredent stadium IIIC /IV papillær serøs ovariecancer samt 2 patienter med benigne ascites blev opsamlet og blev straks behandlet til udføre ALDEFLUOR assay efter vask dem med PBS og fjerne erytrocytterne Med ACK lyseringsbuffer (Lonza , Walkersville, MD, USA). Clinicopathologic data indsamlet for de respektive patienter og korreleret til procentdelen af ​​celler udviste ALDH + fænotype i deres ascites.

Statistisk analyse

Sammenligninger mellem to grupper blev udført ved hjælp af t-test og ANOVA, hvor passende. Statistisk signifikans blev bestemt ved

s

0,05. Kaplan-Meier-kurve blev udført for overlevelse med log-rank for statistisk sammenligning.

Resultater

ALDH status korrelerer med æggestokkræft modstand mod platin agenter

isogene cellelinier af platin følsom (A2780) og resistente (A2780 /CP70) ovariecancerceller blev bedømt for deres overlevelsesrater i nærvær og fravær af forskellige doser af carboplatin. I overensstemmelse med de tidligere rapporterede resultater [24], [25], A2780 /CP70 celler kræves op til en 10 gange højere dosis af carboplatin at opnå IC

50 koncentration end dets platin følsomme modstykke, A2780 (figur 1A) . For nylig, i flere kræftmodeller, ALDH status har været impliceret i tumor resistens mod kemoterapi ved at opretholde cancerstamceller-lignende cellers karakteristika såsom aggressiv vækst, øget overlevelse og re-differentiering potentiale [9]. For at teste sammenhængen mellem ALDH status og platin resistens i ovariecancerceller, blev ALDEFLOUR assays udført på disse isogene celler. Interessant platin resistente ovariecancer cellelinie A2780 /CP70 udviste mindst 110 gange højere procentdel af ALDH + -celler (med en afstand af 22-40%) sammenlignet med platin- følsomme A2780 celler, som kun havde 0,2% ALDH + -celler (figur 1B) . Ligeledes western blot analyse af ALDH1A1 proteinniveauer i disse celler viste lignende resultater, hvilket tyder associering ALDH status med platinmodstandstermometer (figur 1C)

isogene cellelinier (A2780- platin følsom . A2780 /CP70- platin resistent) blev bedømt for platin reaktion under anvendelse lægemiddelfølsomhed assay som beskrevet i M M (A). For at vurdere procentdelen af ​​ALDH + celler, i A2780 og A2780 /CP70 celler ALDEFLUOR assay blev udført ved anvendelse af BODIPY-aminoacetaldehyd (Baaa) som substrat for ALDH enzym, efter 40 minutters inkubation ved 37 ° C flowcytometri analyse blev udført (B) og Western blot data viser repræsenterer niveauer af ALDH1A1 isozym i disse celler (C).

for at vurdere, om ALDH + cancer stamceller-lignende celler er også til stede i primære tumorer og dens tilknytning til progressionsfri overlevelse af patienterne har vi samlet ascites fra 15 patienter med ovariecancer med fremskreden sygdom og 2 benigne ascites fra Meigs syndrom patienter og analyseret for procentdelen af ​​celler med ALDH ekspression under anvendelse ALDEFLOUR assay. Efter aftale med kræft stamcelle hypotese, ALDH + celler var til stede i langt større procentdel i maligne ascites i forhold til deres godartede modstykker. Procentdelen af ​​ALDH + celler i maligne ascites varierede fra 1.3 til 25,4% (patienter 3-17) sammenlignet med 2 benigne ascites (patient 1 og 2. gennemløb) (figur 2A). Vigtigst er det, procent af ALDH + -celler i patienten ascites omvendt korreleret til progression overlevelse. Patienter, der udviste ALDH

HIGH ( 15% ALDH) i deres ascites viste signifikant lavere progressionsfri overlevelse sammenlignet med patienter med ALDH

LOW ( 15% ALDH) (3 vs. 9 måneder, henholdsvis;

s

= 0,003) (Figur 2B). Selv om det er vanskeligt at drage en meningsfuld konklusion på grund af det begrænsede antal ascites anvendt i denne undersøgelse, disse data indikerer en direkte klinisk sammenhæng mellem ALDH status med tumor respons på platin agenter og progressionsfri overlevelse æggestokkene kræftpatienter.

Ascites fra 15 på hinanden følgende patienter med primær fremskredent stadium III /IV kræft i æggestokkene og 2 fra godartede (Miegs syndrom) blev opnået og analyseret for procentdelen af ​​ALDH + celler gennem ALDEFLUOR assay. Histogrammet i indsatte viser procent af ALDH + celler i benigne og maligne ascites (A). Den clinicopathologic oplysninger fra æggestokkene kræftpatienter blev korreleret med procent af ALDH + celler i deres ascites og evalueres progressionsfri overlevelse med ALDH

HIGH ( 15% ALDH) til ALDH

LOW ( 15% ALDH) patienter (3 vs 9 måneder henholdsvis;

s

0,01). (B)

ALDH + ovariecancerceller udstillinger stamceller-lignende egenskaber

Disse resultater førte os til yderligere at karakterisere ALDH som en potentiel stamcelle markør i kræft i æggestokkene. Tumorudvikling kan være forbundet med tilstedeværelsen af ​​en undergruppe af celler, som udtrykker stamcellemarkører og udviser aggressiv adfærd egenskaber, herunder invasive og øget risikoen kolonidannelse. For at undersøge deres invasive egenskaber blev sorterede celler (ALDH + vs. ALDH-) vurderes ved anvendelse Matrigel invasion assay. Som vist i figurerne 3A 3B, ALDH + celler demonstreret over 1,7 fold stigning (

s

0,01). I invasion gennem Matrigel forhold til ALDH- celler

A2780 /CP70 celler blev sorteret i ALDH- og ALDH + fænotyper og evalueret for deres evner til invasion ved hjælp Matrigel invasion kamre (A), kvantitative data som repræsenteret (B) og kolonidannelse potentiale i nærvær og fravær af carboplatin (20 uM) blev vurderet ved anvendelse af blød agar-kolonidannelse assays (C). For at bestemme mulig mekanisme for kræft stamceller karakteristika i ALDH + celler, vi evaluerede flere markører for “stemness”. A2780 /CP70 celler blev sorteret i ALDH- og ALDH + fænotyper, totalt RNA blev isoleret, blev cDNA fremstillet, og real-time kvantitativ RT-PCR blev udført (D). ** Angiver statistisk signifikans (

s

0,01).

En anden surrogat foranstaltning at karakterisere cancer stamceller-lignende celler er evnen til at danne kolonier, især i overværelse af kemoterapeutika [26]. I overensstemmelse med deres invasive potentiale, ALDH + celler viste forbedret kolonidannelse evne i forhold til ALDH- fænotyper (2-fold stigning,

s

0,01). Vigtigt er det, der vises, ALDH + fænotyper forbedret kolonidannelse evne i nærvær af carboplatin (5,4-fold stigning,

s Restaurant 0,01) (figur 3C). For at få indblik i de potentielle stamceller-lignende mekanismer i disse celler, vi evalueret potentielle stamceller veje af interesse i disse celler. RT-PCR-data viste næsten 3 gange højere niveau ekspression af Krüppel-lide Factor 4 (KLF4) i ALDH + celler i forhold til deres ALDH- modstykker. KLF4 tilhører zink finger familie af transkriptionsfaktorer, som er blevet rapporteret at være kritisk for opretholdelsen af ​​brystkræft stamceller og deres aggressive adfærd, såsom migration og invasion ad modstand mod cisplatin [27] [28]. Men andre stamceller mediatorer som BMI1, c-myc, Oct3 /4 og S100A1 ikke vise nogen mærkbare ændringer i deres udtryk i forhold til ALDH- fænotyper (

s

0,01). (Figur 3D)

ALDH1A1 isotype fremmer ovariecancer stamceller-lignende celler ‘egenskaber

i overensstemmelse med CSC litteratur, afslørede vores data forhøjet udtryk for ALDH1A1 isozym i platin resistente A2780 /CP70 celler. For yderligere at evaluere rolle ALDH1A1 i vedligeholdelse af cancer stamceller-lignende celler egenskaber platin-resistente ovariecancerceller har vi nedreguleret ALDH1A1 specifikke isozym hjælp shRNAs (figur S1). I modsætning til den høje ekspression, er nedregulering af ALDH1A1 ikke vist nogen betydelige forskelle i invasive egenskaber af disse celler (figur 4A 4B). Men ALDH1A1 knockdown påvirkede deres evne til at danne kolonier i blød agar, viser en 2,5-fold fald i kolonierne (

s

0,01) (Figur 4C). Tilsvarende nedregulering af ALDH1A1 alene signifikant sensibiliserede inhærent platin resistent A2780 /CP70 celler til carboplatin. I betragtning af IC

50 doser, der kræves (82,9 uM og 43,8 uM til negativ kontrol og shALDH1A1 celler henholdsvis) til disse celler, omkring 50% reduktion i carboplatin dosis er tydeligt for ALDH1A1 knockdown celler (

s

0,001 ) (figur 4D). Sammen disse data antyder, at ALDH1A1 status er en af ​​de kritiske faktorer i at bevare stamceller-lignende celle egenskaber og platin modstand i kræft i æggestokkene.

Lentivirale vektorer, der udtrykker ALDH1A1 specifikke shRNAs eller nontargeting shRNAs blev transficeret i A2780 /CP70 celler og dens virkning på stamceller-lignende celle egenskaber blev vurderet for invasive potentiale hjælp Matrigel invasion kamre (A), kvantitative data som repræsenteret (B), klonogene potentiale ved hjælp af blød agar kolonidannelse (C, og carboplatin afhængig væksthæmning af CellTiter-Glo Selvlysende Cell levedygtighed Assay (D). Statistisk signifikans blev vurderet ved hjælp af studerendes

t-test.

ALDH1A1 styrer cellecykluskontrolpunkter ved regulering af KLF4 og p21 proteiner

Øget ekspression af KLF4 i ALDH + celler (Figur 3D) førte os til at vurdere enhver funktionel sammenhæng mellem ALDH1A1 og KLF4. Selvom ALDH1A1 knockdown ikke påvirke niveauet for KLF4 mRNA, et signifikant fald i KLF4 protein niveauer blev dokumenteret i disse celler (figur 5A ). I betragtning af at den funktionelle status af cellecyklussen regulator p21 er nært forbundet med KLF4 funktion blev mRNA og protein niveauer af p21 også vurderet. Som forventet blev begge ALDH1A1 udskrift og protein niveauer af p21 dramatisk faldt i ALDH1A1 mangelfuld A2780 /CP70 celler (figur 5A). Da ALDH1A1 status påvirket udtryk for cellecyklus checkpoint proteiner p21 /CDK4, vi yderligere analyseret cellecyklus profiler af disse celler. De flowcytometriske data tydeligt angive nedsat G1 cellepopulation (50.25% til 42.10%) og en kompensatorisk stigning i akkumulering af celler i S og G2 faserne (figur 5B). På grund af det faktum, at celler i aktiv replikation (S og G2 faserne) er mere sårbare over for genotoksisk stress i forhold til deres ikke-delende eller andre genstridige faser (G0 og G1) kan re-sensibilisering af ALDH1A1 deficiente celler være delvis tilskrives til ændringerne i cellecyklusfordeling. Desuden har vi også bekræftet, at KLF4 status påvirker p21 ekspressionsniveauerne i A2780 /CP70 celler (Figur S2A S2B). Men evaluering af ALDH aktivitet og ALDH1A1 udtryk i celler ikke udviser nogen mærkbare ændringer, hvilket tyder KLF4 sandsynligvis tjener nedstrøms til ALDH1A1 (figur S2C).

ALDH1A1 dygtige og mangelfuld A2780 /CP70 celler blev evalueret for ekspression af stilken -lignende cellemarkør KLF4 og cellecyklus checkpoint protein p21 ved RT-PCR og Western blot-analyse (A). Cellecyklus fordelinger af celler blev analyseret efter fiksering af cellerne i 70% methanol og propidiumiodidfarvning efterfulgt af flowcytometri (B). Apoptotiske celler blev påvist efter farvning af cellerne med APC-Annexin V og 7-AAD i overensstemmelse med producentens anvisninger og analyseret ved flowcytometri (C).

For yderligere at evaluere de gener, der er ansvarlige for kemoresistens og celle cyklus regulering baseret på status ALDH1A1, har vi brugt RT

2 Profiler PCR Array for den menneskelige Cancer Drug Resistance Cellecyklus (Ambion). De sammenlignende udtryk profiler af gener i ALDH1A1 knockdown vs. kontrolceller afslørede et signifikant fald i ekspression af cellecyklussen regulatorer CDKN1A (p21) (0,27 gange) og CDK4 (0,26 gange), hvilket bekræfter dets rolle i forbindelse med KLF4 ( tabel 1).

af note, med restaurerede platin følsomhed fra ALDH1A1 knockdown, udtryk for den pro-apoptotiske faktor BAX blev opreguleret næsten 3,95 gange. ALDH1A1 knockdown demonstrerede øget antal celler i tidlig apoptotisk fase sammenlignet med kontrollen. Efter eksponering af celler for 1,0 uM staurosporin i 6 timer blev en dramatisk stigning i tidlige apoptotiske celler observeret i ALDH1A1 deficiente celler i forhold til deres ALDH1A1 dygtige counter dele (35,3% vs. 20,3%) (figur 5C). Disse data antyder, at ALDH1A1 knockdown celler er mere modtagelige for BAX-induceret apoptose, som er blevet godt beskrevet i inhibering af p21 cellecyklus checkpoint [29].

ALDH1A1-medieret platinmodstandstermometer korrelerer til ændret DNA-reparation netværk

Intakte cellecykluskontrolpunkter og DNA-skade respons (DDR) signaling mekanismer er vigtige for cellens evne til at imødegå med forskellige slags genomiske fornærmelser og ordnet udvikling i cellecyklus. Imidlertid er et fælles træk af kræftceller ændret regulering af disse signaler kaskader at erhverve yderligere genetiske ændringer, der kræves for re-differentiering og overlevelse derved vise terapeutisk modstand. Ligeledes ALDH1A1 celler udviste ændret regulering af KFL4 /p21 medieret cellecyklus checkpoint mekanisme, som primært styrer inhibering af G1 til S og G2 til M progression i respons på DNA beskadigelse give mere tid til cellen at reparere. I betragtning af sammenslutningen af ​​PARP-1 i reparation af carboplatin-induceret DNA-skader, vi evalueret sit engagement i ALDH1A1 celler. PARP-1-niveauer gradvist øges op til 45 minutter efter carboplatin behandling (figur 6A og 6B). Men nedregulering af ALDH1A1 resulterede i signifikant fald (1,8 gange) i alt PAR niveauer (PARP aktivitet) (Figur 6C) sammenlignet med ALDH1A1 dygtige celler (

s

= 0,012).

ALDH1A1 dygtige (kontrol) og mangelfulde (shALDH1A1) A2780 /CP70-celler blev vurderet for deres evner til at reparere carboplatin inducerede enkelt strengbrud ved at kigge på tidsafhængig induktion af PARP-1 proteinniveauer ved Western blots (A), densitometridata af blots af Image J ( B) og total PARP-aktivitet blev analyseret ved måling PAR niveauer (C). At vurdere ALDH1A1 afhængig ekspression DDR og reparation proteiner, helcellelysater blev normaliseret til totale proteiner og western blot-analyse blev udført under anvendelse af antistoffer som repræsenteret (D).

Adskillige nyere undersøgelser af brystkræft stem- celler angiver ændret regulering af DNA reparation net, især et omvendt forhold mellem ALDH1A1 status og BRCA1 genekspression [15], [16]. Som svar på DNA-skade, er BRCA1 kendt for at regulere cellecykluskontrolpunkter og valget af DNA-reparationsmekanismer veje til rettidig reparation af disse DNA-læsioner [16]. I overensstemmelse med brystcancer stamcelle data, Western blot-analyse afslørede et omvendt forhold mellem ALDH1A1 og BRCA1 ekspression i A2780 /CP70 celler, hvilket antyder ALDH1A1 udtrykker ovariecancer stamceller-lignende celler mere tilbøjelige til at miste eller udtrykker lave niveauer af BRCA1. Yderligere analyse viste nedregulering af ALDH1A1 induceret spontan DNA skade responset ved at udtrykke γ-H2AX protein (en markør for dobbelt streng pauser). Dette faldt også sammen med den formindskede niveauer af excision reparation protein (XRCC1), replikation checkpoint kinase protein 1 (Chk1) og andre replikation stress i forbindelse fanconis anæmi (FA) -BRCA genprodukter FANCD2 og FANCJ [30] – [32]. Sammen antyder disse data at ovariecancer stamceller-lignende celler kan opretholde terapeutisk modstand ved at udtrykke ALDH1A1 og udtømning af hvilke, ophæver G1 og S-fase checkpoints (figur 5A og 6C) fører til replikation stress (figur 5B). Selvom ALDH1A1 udtømte celler akkumuleret i S og G2 faser, phosphorylering status replikation checkpoint protein Chk1 (Ser317) og udtryk for replikationsgaffel associeret FA pathway proteiner FANCD2 og FANCJ blev ramt. Dette er også tillagt ved induktion af γ-H2AX, en markør for DSB og reduceret celle overlevelse. Da Chk1 og FA-proteiner er vigtige for replikation checkpoint og stabiliteten af ​​strandede replikationsgafler, kan den spontane DNA beskadigelse respons i disse celler tilskrives defekt i disse proteiner (figur 6D). For at identificere de molekylære netværk signaler, som udtrykkes differentielt i ALDH1A1 udtrykkende celler, vi oprindeligt vurderet ekspressionen af ​​Fanconi anæmi pathway og tumor resistens over for kemoterapeutiske midler. Konsekvent, vores resultater viste en direkte korrelation mellem ALDH1A1 status og FANCD2 ekspression. Sammen vores data indikerer en sammenhæng mellem ALDH1A1 status til stemness og platin modstand ovariecancerceller ved ændret regulering af DNA reparationsarbejder.

Diskussion

Flere potentielle æggestokkene CSCS specifikke overflademarkører er blevet beskrevet sådan som CD44 + /CD117 + [33], CD44 + /MyD88 + [34], CD133 + [35], CD44 + /CD24- [21], [36] og ALDH /CD133 + [37].