PLoS ONE: BANF1 nedreguleres ved IRF1-Reguleret MicroRNA-203 i livmoderhalskræft

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) spiller en vigtig rolle i forskellige biologiske processer og er tæt forbundet med udviklingen af ​​kræft. Faktisk har afvigende ekspression af miRNA blevet impliceret i talrige cancere. I livmoderhalskræft, er MIR-203 niveauer faldt, selv om årsagen til denne afvigende ekspression stadig uklar. I denne undersøgelse undersøger vi de molekylære mekanismer, der regulerer MIR-203 gentranskription. Vi identificerer MIR-203 transkriptionsstartstedet med 5 ‘hurtig amplifikation af cDNA-ender og efterfølgende identificere MIR-203 promoter region. Promotor analyse afslørede, at IRF1, en transskriptionsfaktor, regulerer MIR-203 transkription ved binding til MIR-203-promotoren. Vi viser også, at MIR-203 mål den 3 ‘utranslaterede region af

BANF1

, således nedregulere dets ekspression, hvorimod MIR-203-ekspression er drevet af IRF1. MIR-203 er involveret i cellecyklusregulering og overekspression af MIR-203 undertrykker livmoderhalskræft celleproliferation, kolonidannelse, migration og invasion. Den hæmmende effekt af miR-203 om kræftcellerne er delvist medieret af nedregulere sit mål,

BANF1

, da knockdown af

BANF1

også undertrykker kolonidannelse, migration og invasion.

Henvisning: Mao L, Zhang Y, Mo W, Yu Y, Lu H (2015)

BANF1

nedreguleres ved IRF1-Reguleret MicroRNA-203 i livmoderhalskræft. PLoS ONE 10 (2): e0117035. doi: 10,1371 /journal.pone.0117035

Academic Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, UNITED STATES

Modtaget: August 15, 2014 Accepteret: 17. december 2014 Publiceret: 6 feb 2015

Copyright: © 2015 Mao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer.

Introduktion

det anslås, at cirka 30% af menneskelige gener er reguleret af miRNA. Dereguleringen af ​​miRNA kan ændre ekspressionsniveauerne af målgener, hvilket resulterer i unormale cellulære processer [1]. For nylig har flere undersøgelser vist, at afvigende ekspression af mikroRNA (miRNA) er impliceret i talrige sygdomstilstande, og at dette udtryk er tæt forbundet med udviklingen af ​​de menneskelige maligniteter [2]. Desuden har nogle miRNA blevet udforsket som potentielle biomarkører til diagnosticering eller prognosticering af sygdomme hos mennesker [3-6]. Derfor er de mekanismer, der er involveret i miRNA deregulering er et spørgsmål om presserende og vigtige forskning.

De mekanismer, der fører til afvigende ekspression af miRNA er endnu ikke helt forstået. miRNA er typisk transskriberet af RNA-polymerase II til primære miRNA (pri-miRNA), der behandles af drosha til at pre-miRNA og derefter yderligere spaltes af Dicer til korte, modne miRNA [7,8]. Teoretisk kan afvigende ekspression af miRNA være forårsaget af forskellige mekanismer, herunder deletioner, amplifikationer og mutationer involverer miRNA loci, epigenetiske ændringer og dysregulering af transkriptionsfaktorer, der er målrettet specifikke miRNA. På det genomiske niveau, kromosomafvigelser og epigenetiske modifikationer, herunder mutationer, CpG ø methylering og undertrykkende histon modifikationer, er ansvarlige for miRNA silencing i kræft. På det transskriptionelle niveau, miRNA interagerer med transkriptionsfaktorer og transskription inhibitorer for at skabe en dynamisk balance, der regulerer deres ekspression [1].

Livmoderhalskræft er en af ​​de mest almindeligt diagnosticeret kræft og den hyppigste årsag til kræft dødsfald i hunner i hele verden, der tegner sig for 9% af nye kræfttilfælde og 8% af de samlede kræftdødsfald blandt kvinder [9]. Aberrant miRNA ekspression er blevet fundet i livmoderhalskræft [10-12], og et stort antal af afvigende miRNA funktioner er blevet rapporteret globalt [13]. Imidlertid har de fleste undersøgelser fokuseret på afvigende ekspression af miRNA, mens de, der er involveret i miRNA deregulering mekanismer er mindre rapporteres.

MIR-203 er blevet rapporteret at være dysreguleret og fungere som en tumorsuppressor i hepatocellulært carcinom, prostatacancer, lungecancer, esophageal cancer og livmoderhalskræft [14-18]; dog mekanismen fører til afvigende ekspression af MIR-203 er ikke helt klar. I denne undersøgelse har vi identificere MIR-203 transkriptionsstartstedet (TSS) ved 5’hurtig amplifikation af cDNA-ender (5′-RACE) og efterfølgende identificere MIR-203 promotorsekvens. Vi viser, at MIR-203 er rettet mod den 3′-utranslaterede region (3’UTR), i

BANF1

, således nedregulere

BANF1

ekspression, og at MIR-203-ekspression er drevet af transkriptionsfaktoren IRF1 . Vores undersøgelse etablerer en lineær signalvej fra

IRF1

til

BANF1 Hoteller, som kan bidrage til

BANF1

induceret tumorigenese i livmoderhalskræft. Dette arbejde bidrager til omfattende forståelse af mekanismen for HPV-medieret livmoderhalskræft progression.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Humane livmoderhalskræft væv og tilstødende normale cervikale væv blev indsamlet fra Shanghai Changhai Hospital (Shanghai, Kina). Alle patienter forudsat skriftlige samtykke, og undersøgelsen blev godkendt af de etiske udvalg i Shanghai Changhai Hospital og Fudan University (referencenummer 2011-120).

Celledyrkning, RNA-molekyler og transfektion

Cervikal cancercellelinier (CaSki og HeLa) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Gibco, USA) indeholdende 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS, Gibco) ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Syntetiske miRNA molekyler, herunder MIR-203 mimic, inhibitor og negativ kontrol, blev indkøbt fra Ambion, USA. De små interfererende RNA mod

BANF1

og negativ kontrol blev syntetiseret ved Genepharma (Shanghai, Kina) [19]. Sekvenserne var som følger: siRNA-BANF1, 5′-CCAGGUGCAUUUAAAGAAATT-3 ‘og styresekvens, 5′-UUUCUUUAAAUGCACCUGGTT-3’. Celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger.

RNA-ekstraktion og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra væv og celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Ambion, USA) og revers transkriberet under anvendelse af PrimeScript RT reagens (Takara, Kina) ifølge producentens instruktioner. De anvendte primere er listet i S1 tabel. For MIR-203 detektion blev RNA revers transskriberet af en specifik revers-transkription primer (RT-MIR-203). For mRNA detektion blev RNA revers transkriberet efter Tilfældigt 6 merer og Oligo dT primer. SYBR Premix Ex Taq (Takara, Kina) blev anvendt til at kvantificere modne MIR-203 og mRNA-ekspression under anvendelse af LightCycler 480 II Real Time PCR-system (Roche, Tyskland). RNU6B og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som intern kontrol for MIR-203 og mRNA-ekspression hhv. Relative genekspressionsniveauer blev bestemt under anvendelse af delta Ct-metoden [20] og udtrykkes som gennemsnittet af tre uafhængige forsøg ± standardafvigelsen.

5 ‘hurtig amplifikation af cDNA-ender (5’-RACE)

TSS på mIR-203 primære transkript (fra HeLa-celler) blev bestemt ved anvendelse af en 5′-Full RACE kit (Takara, Kina). To mikrogram RNA blev anvendt i hver reaktion, og HL60 total RNA, som blev leveret i kittet, blev anvendt til at analysere 5′-enden af ​​det humane

prohibitin

(PHB) gen (PCR-produkt 750 bp) , der tjente som en positiv kontrol. Niveauerne på MIR-203 primære transkript blev bestemt ved nested PCR under anvendelse af ydre og indre primere (S1 Table). Alle reaktioner blev udført under anvendelse af de samme parametre som foreslået i manualen. PCR-produkterne blev separeret ved 1% agarosegelelektroforese, detekteres, renset og derefter sekventeret.

Dual-luciferase reporter assays og transkriptionsfaktor analyse

3’UTR af

BANF1

blev amplificeret fra human genomisk DNA af HeLa-celler og klonet ind i psiCHECK-2 reporter vektor (Promega, USA), og mutation og deletion af

BANF1

3’UTR blev opnået ved SOE PCR (gensplejsning ved overlap PCR). HeLa-celler blev co-transficeret med reporter vektorer og enten MIR-203 mimic (30 nM) eller miRNA mimic negativ kontrol (NC, 30 nM). Luciferaseaktivitet blev målt ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA), og resultaterne blev udtrykt som normaliserede forhold mellem Renilla til ildflue-luciferase.

På MIR-203 promoter reporter assay 744 -BP genomiske sekvens opstrøms for mIR-203 blev amplificeret ved PCR og klonet ind i pGL3-Basic (Promega, USA) reporter vektor. HeLa-celler blev co-transficeret med promotoren reporter vektor og enten pCDNA-IRF1 eller kontrol plasmid pcDNA3.1. En Renilla luciferase plasmid, pRL-TK, blev anvendt til at normalisere transfektionseffektiviteten. Celler blev lyseret ved 24 eller 48 timer efter transfektion, og luciferaseaktiviteten blev målt med Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA). Resultaterne er udtrykt som normaliseret ratio af ildflue til Renilla luciferase og præsenteres som middel ± SD’er fra tre uafhængige forsøg.

Western blotting

Celler blev lyseret i RIPA buffer plus proteasehæmmere ( Millipore, USA). Lysaterne blev derefter underkastet SDS-PAGE, elektrooverført til PVDF-membraner (Millipore, USA), blokeret med 5% fedtfri mælk, inkuberet med antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur, herunder anti-beta-tubulin (Abmart, M20005, 1: 2000 Kina), anti-BANF1 (Santa Cruz, sc-33.787, 1: 200, USA), HRP-anti-kanin (KPL, 4751-1516, 1: 2000, USA) og HRP-anti-muse (KPL, 0751- 1809, 1: 2000, USA), og fremkaldes med cECL Detection Reagenser (CWBIO, Kina). Billeder blev erhvervet ved hjælp af Gene Gnome Bio Imaging-system (Syngene, UK).

chromatin immunopræcipitation (chip) analyser

chip assays blev udført ved hjælp af EZ-Magna chip One-Day kromatin Immunpræcipitation Kit (Millipore, USA) i henhold til brugsanvisningen. Kort fortalt, ca. 1×10

7 HeLa-celler blev tværbundet og lyseret ved lysepuffer indeholdende Protease Inhibitor Cocktail II. Chromatin blev klippet ved lydbehandling (høj effekt, 10 cykler af 30 s ‘på’ og 30 s ‘off’, Bioruptor UCD-300, USA) til en gennemsnitlig størrelse på 200 til 1000 bp, og de klippede kromatin prøver blev opdelt i 50 -μl alikvoter. Hver portion af kromatin (1×10

6 celle ækvivalenter kromatin) blev fortyndet i 450 pi fortyndingsbuffer. Fem mikroliter (1%) af supernatanten blev fjernet som “input”, og immunpræcipitering antistof, IRF1 (Abcam, ab26109, 5 ug, UK), og 20 pi protein A magnetiske perler blev tilsat til den resterende supernatant. Endelig blev immunkomplekser opsamlet, vasket og elueret, og tværbindingerne blev derefter vendt om. DNA blev udvundet og analyseret ved QRT-PCR. Som en negativ kontrol blev normal muse-IgG anvendes til immunopræcipitation.

celleproliferation og kolonidannelse assays

I de celleproliferationsassays, CaSki og HeLa-celler blev podet i plader med 96 brønde og transficeret med enten 30 nM mIR-203 mimic eller negativ kontrol og vedligeholdes i fuld vækstmedier i 7 dage. Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af et MTT-assay. Til dette assay blev cellerne udsået in triplo på samme indledende densitet, og absorbansen ved 490 nm blev aflæst på sekventielle dage under anvendelse af en pladelæser (BioTek, USA). For kolonidannelse assays blev 200 celler podet i 24-brønds plader og inkuberet ved 37 ° C i enten 10 dage (HeLa-celler) eller 15 dage (CaSki-celler). Cellerne blev farvet med 0,1% krystalviolet og talt hvis kolonien indeholdt mere end 50 celler. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.

In vitro

migration og invasion analyser

Invasion og migration blev udført ved hjælp af 24-godt Transwell kamre (8 um porestørrelse polycarbonat-membran, Corning, USA) med eller uden 150 ug Matrigel (BD, USA). For migrationen assays, 5 × 10

4-celler i serumfrit medium blev udpladet i det øvre kammer. For invasionen assays, 1 x 10

5-celler i serumfrit medium blev udpladet i det øvre kammer. Medium med 10% FBS blev tilsat til de nederste brønde i kamrene. Efter 20 timer (HeLa-celler) eller 26 timer (CaSki celler) inkubation blev cellerne klæber til nedre membran fikseret med methanol og farvet med 0,1% krystalviolet. De migrerede eller invaderede celler blev talt og filmede med en IX51 omvendt mikroskop (Olympus, Japan).

Flowcytometri assays

Celler blev transficeret med 30 nM miRNA efterligner i 6-brønds plader, den medium blev ændret den næste dag, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 48 timer efter transfektion. For celle-cyklus analysen blev cellerne resuspenderet i NP40 /PI farveopløsning (0,01 mg /ml propidiumiodid, 0,1% Na-citrat, 0,0564% NaCl, 0,025 mg /ml ribonuclease A, 0,3% NP-40) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Cellerne blev derefter analyseret for DNA-indhold ved anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (BD, USA). Celle-cyklus modellering blev udført under anvendelse af Modfit software.

Statistisk analyse

t-test blev anvendt til at evaluere signifikante forskelle mellem to grupper af data i alle egnede eksperimenter. En

P

værdi 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Identifikation af miR-203 promotor

For at bestemme om miR-203 udtryk er. unormal i livmoderhalskræft, blev QRT-PCR udført på 20 parrede patientprøver og livmoderhalskræft cellelinier (HPV 16+ CaSki og HPV 18+ HeLa). Som vist i fig. 1A, miR-203-ekspression betydeligt nedreguleret i livmoderhalskræft væv og cellelinier sammenligner med de tilstødende normale cervikale væv. Men mekanismen ved denne nedregulering er fortsat uklart. At udforske reguleringen af ​​miR-203-ekspression på transkriptionsniveauet, vi først bestemmes TSS af miR-203 ved hjælp 5’RACE analyse. Som vist i fig. 1B, var der to 5’RACE PCR produkter til PRI-MIR-203, som foreslået, at MIR-203 kan have mindst to TSSs. Den TSS nær præ-miR-203 var i overensstemmelse med den vist i en tidligere publikation [21] og var mærket en.

(A) MIR-203 ekspressionsniveauer i normale humane cervikale væv, livmoderhalskræft væv og cervikale cancercellelinier (CaSki og HeLa) blev målt ved QRT-PCR under anvendelse RNU6B som en intern kontrol. (B) 5’RACE PCR resultater viser transcription start sites af human (HeLa-celler) PRI-MIR-203. (C) Skematisk af de forudsagte bindingssteder IRF1 i MIR-203-genpromotoren. Tallet angiver den relative afstand fra 5′-enden af ​​den primære MIR-203-transkript (angivet som +1). (D) Alignment resultater viser bevarelsen af ​​MIR-203 promotorsekvenser mellem forskellige dyr. (E) MIR-203 promotoraktivitet analyse ved dual-luciferase assays. Den forudsagte MIR-203-promotoren blev klonet i pGL3-Basic Vector opstrøms for ildflue-luciferasegenet. Ildflueluciferaseaktivitet, blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet og afbildet i forhold til kontrollen (*

P

0,05). Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Vi derefter udført i silico analyse af miR-203 promoter region (herunder 2 kb opstrøms af præ-miR-203) ved hjælp af de online værktøjer FirstEF, PromoterScan , softberry-fprom, og Arrangøren 2,0 Forudsigelse. Disse værktøjer forudsagde, at en 1-kb, GC-rige sekvens (ca. 70%) i nærheden af ​​MIR-203 TSS var promotoren (fig. 1C). Typisk promotorsekvenser hos forskellige arter bevares. Derfor vi tilpasset den forudsagte humane promotorsekvens til regionen opstrøms for præ-MIR-203 mus, rotte, hund og ko og fundet en stærkt bevaret region (fig. 1D). Vi antager, at dette konserverede sekvens var mest sandsynligt promotorsekvensen af ​​MIR-203. Derefter analyserede vi aktiviteten af ​​denne promotor under anvendelse luciferase reporter assays. Som vist i fig. 1E, sammenlignet med kontrolgruppen vektor, den forudsagte promotorsekvens steget betydeligt luciferaseaktiviteten (ca. 17 gange), hvilket indikerer, at dette konserverede sekvens har en stærk promotoraktivitet.

IRF1 er involveret i den transskriptionelle regulering af miR- 203

Ved at scanne den identificerede miR-203 promotor med TRANSFAC (https://www.biobase-international.com/product/transcription-factor-binding-sites), flere potentielle transkriptionsfaktorer (AP-1, HSF1, MZF1, IRF1, og Sp1) blev forudsagt. For at validere denne forudsigelse, undersøgte vi virkningen af ​​flere potentielle transkriptionsfaktorer på MIR-203-promotor-drevet luciferaseaktivitet. Blandt disse forudsagte transkriptionsfaktorer, overekspression af IRF1 i HeLa-celler markant aktiveret MIR-203-promotor-drevet luciferaseaktivitet (Fig. 2A). Endvidere blev virkningen af ​​IRF1 overekspression på MIR-203-ekspression analyseret ved miRNA QRT-PCR. Som vist i fig. 2B, IRF1 overekspression øget endogen modne MIR-203-ekspression 8 gange sammenlignet med kontrolvektoren. Disse resultater indikerer, at miR-203 transskription reguleres af IRF1.

(A) Dual-luciferaseassays viser effekten af ​​flere transkriptionsfaktorer (IRF1, MZF1, AP-1, HSF1, og Sp1) på miR- 203 promotoraktivitet. Konstruktionerne blev cotransficeret ind i HeLa-celler med vektorer, der udtrykker transkriptionsfaktorer og pRL-TK vektor som transfektion kontrol. Den vildtype pCDNA3.1 plasmid tjente som en negativ kontrol. De relative luciferaseaktiviteter er vist som forholdet mellem ildflue /Renilla luciferaseaktivitet. (B) QRT-PCR-assays vise virkningerne af IRF1 overekspression på MIR-203-ekspression. (C) Chromatin immunopræcipitationsanalyser viser

in vivo

samspil mellem IRF1 og miR-203 promotor. HeLa-chromatin fragmenter blev immunpræcipiteret med et antistof for IRF1 eller negativ kontrol-antistof (normal IgG). DNA-prøverne fra immunopræcipitater blev analyseret ved QRT-PCR under anvendelse af primere specifikke for MIR-203-promotoren. (D) Luciferase assays under anvendelse af de mutante promotorkonstruktioner. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *

P

0,05

Samspillet mellem IRF1 og miR-203 promotor blev yderligere bekræftet af Chip QRT-PCR-analyser.. Som vist i fig. 2C,

in vivo

binding af IRF1 til miR-203 promotor var signifikant højere end for kontrollen. At identificere IRF1 bindingssteder i MIR-203 promotorsekvens, muterede vi de forudsagte IRF1 bindingssteder (fig. 1C). Som vist i fig. 2D, mutation af IRF1 bindingssted 2 (pGL3-mut 2) ophævede virkningerne af IRF1 på reporter, mens mutere bindingssted 1 havde ingen virkning. Ifølge disse resultater, IRF1 regulerer ekspressionen af ​​miR-203 ved at binde til site 2 (CACTT).

MIR-203 undertrykker

BANF1

udtryk ved at målrette 3’UTR af

BANF1

for at undersøge funktionen af ​​miR-203, søgte vi efter potentielle miR-203 målgener hjælp miRNA-databaser (Targetscan, Miranda, og miRecords). Som vist i fig. 3A, frø region MIR-203 er perfekt komplementær til målsekvensen i 3’UTR af

BANF1

. For at validere dette in silico forudsigelse, klonede vi den del af

BANF1

3’UTR indeholdende MIR-203 målsted i luciferasereporterplasmid psiCHECK-2. Vi derefter udført en luciferase reporter assay efter co-transfektion af reporteren konstruktioner med MIR-203 efterligne ind i HeLa-celler. I nærvær af MIR-203 mimic, luciferaseaktiviteten af ​​reporter konstruktion indeholdende

BANF1

3’UTR blev signifikant reduceret, mens den for det umodificerede konstrukt ikke blev ændret (fig. 3B). Endvidere mutation (Mut) og deletion (Del) på MIR-203 frø sekvens både ophævede MIR-203-medieret reduktion i luciferaseaktivitet (fig. 3B).

BANF1

mRNA-niveauer blev målt ved QRT-PCR, som viste nedsat niveau af

BANF1

mRNA i nærvær af MIR-203 mimic (fig. 3C). For yderligere at bekræfte, at

BANF1

er et mål for miR-203, undersøgte vi endogene

BANF1

protein niveau via western blotting efter forbigående transfektion af miR-203 mimik og inhibitor i HeLa og CaSki celler . Som vist i fig. 3D,

BANF1

ekspressionsniveau faldt som den koncentration af transficerede MIR-203 mimic blev forøget, medens

BANF1

ekspressionsniveau øges, når celler blev transficeret med MIR-203-inhibitor. Disse resultater indikerer, at miR-203 direkte kan målrette

BANF1

3’UTR og nedregulere

BANF1

udtryk.

(A) Modent miR-203 sekvenser og genkendelsessites inden 3’UTR af

BANF1

. Frøene sekvens af MIR-203 er understreget. Den vilde type (WT), muteret (Mut) og slettes (Del)

BANF1

3’UTR-genkendelsessites er også vist. (B) Den relative luciferaseaktivitet af konstruktioner, der indeholder

BANF1

WT, Mut eller Del 3’UTRs. Luciferase konstruktioner blev co-transficeret med miRNA efterligner negativ kontrol (NC, 30 nM) eller MIR-203 mimic (30 nM) i HeLa-celler. Renilla luciferaseaktivitet blev målt 36 timer efter inkubation og normaliseret til ildflue-luciferase-aktivitet. En stjerne angiver signifikant nedregulering af præ-MIR-203 sammenlignet med ekspressionen af ​​WT

BANF1

3’UTR konstrukt. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) QRT-PCR-analyse af

BANF1

mRNA fra CaSki og HeLa-celler transficeret med miRNA efterligne NC (30 nM) eller MIR-203 mimic (30 nM). Data blev normaliseret til det niveau af GAPDH mRNA, og forholdet mellem

BANF1

/GAPDH i den negative kontrol blev sat til 1. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (D) Western blot-analyse af endogen

BANF1

ekspression i CaSki og HeLa-celler 48 timer efter transfektion med MIR-203 mimic eller inhibitor. Tubulin tjente som en belastning kontrol. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (E)

BANF1

ekspressionsniveauer i humane normale cervikale væv, livmoderhalskræft væv og cervikal cancer cellelinjer (CaSki og HeLa) blev målt ved QRT-PCR, under anvendelse af GAPDH som en intern kontrol. (F) Western blot-analyse af BANF1 niveauer i 20 parrede tumorvæv (T) og tilstødende normale cervikale væv (N). Tubulin tjente som en belastning kontrol. De fem parrede prøver, der udviste nogen forskelle i BANF1 ekspression, er angivet med bokse. *

P

0,05, **

P.

0,01

For at bestemme, om reduceret miR-203-ekspression er korreleret med

BANF1

ekspressionsniveauerne i livmoderhalskræft, vi vurderet den

BANF1

niveauer i 20 parrede livmoderhalskræft vævsprøver og deres tilstødende normale cervikale prøver samt i livmoderhalskræft cellelinjer (HPV 16+ CaSki og HPV 18+ HeLa) via QRT-PCR.

BANF1

ekspression var betydeligt højere i cervikal cancer celler og væv end i normalt væv (Fig. 3e). Desuden viste western blot-analyse, at udtryk for BANF1 var forhøjet i 15 ud af 20 parrede (75%) tumorvæv (T) end i normal (N) cervikale væv (fig. 3f). De øvrige 5 parrede prøver udviste ingen forskelle i BANF1 ekspression, er angivet med bokse. Disse resultater antyder, at den unormale fald i MIR-203 niveauer i livmoderhalskræft er relateret til den høje ekspression af

BANF1

.

IRF1 regulerer MIR-203 og indirekte påvirker ekspressionen af ​​

BANF1

for at validere, om IRF1 regulering af miR-203 kan mediere ændringer i

BANF1

udtryk, vi evalueret

BANF1

udtryk ved QRT-PCR og western blotting under IRF1 overekspression. Som vist i fig. 4A og B, IRF1 mRNA og protein niveauer steg markant i CaSki og HeLa-celler efter cellerne blev transficeret med pcDNA-IRF1. Interessant

BANF1

mRNA og protein-niveauer blev reduceret i CaSki og HeLa-celler transient transficeret med pcDNA-IRF1 (fig. 4C og 4D), som kraftigt antyder, at IRF1 stimulerer MIR-203-ekspression, som efterfølgende nedregulerer

BANF1

ekspression.

(A, B) QRT-PCR og western blot analyse af IRF1 mRNA og protein niveauer i CaSki og HeLa-celler transficeret med pcDNA-IRF1. IRF1 mRNA og protein niveauer blev signifikant forøget, når transficeret med pcDNA-IRF1. (C) QRT-PCR-analyse af

BANF1

mRNA-ekspression i HeLa-celler transient transficeret med kontrolvektor eller pcDNA-IRF1. Dataene blev normaliseret til GAPDH-ekspression. (D) Western blot-analyse af BANF1 ekspression i CaSki og HeLa-celler transient transficeret med pcDNA-IRF1. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *

P.

0,05

MIR-203 undertrykker livmoderhalskræft celledeling og kolonidannelse

Vi udforskede de cellulære funktioner i miR-203 i livmoderhalskræft og fandt, at mIR-203 overekspression markant undertrykt væksten af ​​CaSki og HeLa-celler (fig. 5A og B). Tilsvarende blev kolonidannelse kapaciteten faldt i CaSki og HeLa-celler, når MIR-203 var overudtrykt (fig. 5C og D).

(A, B) celleproliferation assays af CaSki og HeLa-celler transficeret med miR- 203 efterligner eller negativ kontrol. (C, D) kolonidannelse assays af CaSki og HeLa-celler transficeret med MIR-203 mimic eller negativ kontrol. Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *

P.

0,05

MIR-203 er involveret i cellecyklus regulering og undertrykker livmoderhalskræft celle migration og invasion

in vitro

Celler transficeret med mIR-203 mimic blev underkastet cellecyklusanalyse via flowcytometri. Som vist i fig. 6A, cervicale cancerceller overudtrykker MIR-203 havde en højere procentdel af G1-fase celler og en mindre procentdel af S-fase celler, hvilket antyder, at MIR-203 inducerer G1 arrest. Derudover transwell assays med eller uden Matrigel viste, at MIR-203 overekspression i CaSki og HeLa-celler undertrykte migration og invasion evne i forhold til den negative kontrol (NC) celler (fig. 6B, C, D og E).

(A) Flowcytometrianalyse viser virkningen af ​​mIR-203 overekspression på cellecyklussen af ​​CaSki og HeLa-celler. Celler blev transficeret med 30 nM MIR-203 mimic eller negativ kontrol (NC) og opsamlet, farvet og analyseret 48 timer efter transfektion. (B, C) Transwell migration assays af CaSki og HeLa-celler transficeret med MIR-203 mimic eller NC. De migrerede celler blev kvantificeret og repræsentative billeder vises nederst. (D, E) Transwell invasion analyser af CaSki og HeLa-celler transficeret med miR-203 efterligne eller NC. De invaderede celler blev kvantificeret og repræsentative billeder vises. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *

P.

0,05

BANF1

knockdown undertrykker celle kolonidannelse, migration og invasion

For yderligere at validere, om

BANF1

er involveret i miR-203 medieret kolonidannelse, migration og invasion, siRNA målretning

BANF1

designet og transficeret ind CaSki og HeLa-celler. Resultaterne viste, at siRNA målretning

BANF1

faldt betydeligt

BANF1

mRNA og protein niveauer i CaSki og HeLa-celler (fig. 7A og B). Som forventet knockdown af endogent

BANF1

efter siRNA resulterede i et signifikant fald i kolonidannelse (Fig. 7C og D). Ligeledes blev migrationen og invasion evner CaSki og HeLa-celler også faldt betydeligt af

BANF1

siRNA, men ikke af den negative kontrol (NC) siRNA (Fig. 7E, F, G og H).

(A, B) QRT-PCR og western blot analyse af

BANF1

niveauer i

BANF1

-knockdown CaSki og HeLa-celler.

BANF1

mRNA og protein niveauer blev væsentligt reduceret, når transficeret med siRNA-BANF1. (C, D) afslørede kolonidannelse assays, at den gennemsnitlige kolonidannelse antal reduceret i

BANF1

-knockdown CaSki og HeLa-celler. (E, F) Cell migration analyser afslører, at de migrerede celler blev reduceret ved at banke ned

BANF1

. (G, H) Cell invasion analyser afslører, at de invaderede celler blev reduceret ved at banke ned

BANF1

. Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *

P

0,05

Diskussion

Et stigende antal undersøgelser har vist, at miRNA er involveret i forskellige fysiologiske processer og er forbundet med udviklingen af ​​sygdomme. gennem deres evne til at regulere målgener [22,23]. Regulering af miRNA udtryk er vigtigt for at opretholde cellulær homeostase; imidlertid de molekylære mekanismer, der regulerer miRNA gentransskription ikke godt forstået [24,25]. Regulering af udtryk på det transkriptionelle niveau er et afgørende skridt i miRNA biosyntese [26].

miRNA gener transskriberes som en enhed eller klynge og kan opholde sig i enten intergeniske regioner eller inden for de introns eller exoner af kodning gener [ ,,,0],27]. Når miRNA opholde sig i intrageniske regioner, kan de transkriberes uafhængigt, hvis de har deres egne promotorer [27], eller de kan transkriberes sammen med værten genet, hvis de mangler deres egne promotorer. Identifikation af TSSs og promotorer er kritisk for at forstå mekanismerne og transkriptionsfaktorer, der medierer miRNA ekspression [28]. MIR-203-genet er lokaliseret i en intergeniske region og transkriberes uafhængigt. Vores undersøgelse identificeret miR-203 TSSs af 5’RACE og efterfølgende identificeret miR-203 promotersekvens.

At have flere TSSs er en vigtig mekanisme til at øge gen kompleksitet og bidrage til funktionel mangfoldighed, et fænomen, der er blevet godt undersøgt for protein-kodende gener. I komplekse arter, er det almindeligt for gener at have flere forskellige TSSs, der kan være aktive under forskellige betingelser [29]. Det er blevet rapporteret, at det humane miRNA-genklyngen MIR-23a-MIR-27a-MIR-24-2 og

Drosophila melanogaster

miRNA MIR-276a og MIR-277 har alternative TSSs [30]. I denne undersøgelse identificerede vi to TSSs for miR-203. I de fleste tilfælde kan de variable transkripter for hver miRNA producere det samme modne miRNA [31]. Derfor danner flere udskrifter har ringe indflydelse på funktionen af ​​en miRNA. spekulere dog, at særskilte TSSs af miRNA kan have forskellige transskription effektiviteter og kunne regulere ekspressionsniveauet af miRNA. Yderligere forståelse af alternativ splejsning kan give mere information om miRNA genregulering.

Vores undersøgelse etablerer en lineær signalvej (

IRF1

til miR-203 til

BANF1

) (Fig . 8).

IRF1

koder interferon regulatorisk faktor 1, et medlem af interferon regulatoriske transkriptionsfaktor (IRF) familie. IRF1 er faldet i kræft væv og funktioner i immunresponset, apoptose regulering, DNA skader reparation og tumor undertrykkelse [32-34]. Tidligere undersøgelser har valideret, at miR-203 regulerer en række målgener, herunder

VEGFA

[18],

ALB1

[35],

PKC

α [16], og

ATM

[36] (fig. 8). Disse mål gener er involveret i biologiske processer ligner IRF1. Desuden har tidligere undersøgelser vist, at HPV E7 funktionelt er forbundet med IRF1.