PLoS ONE: En forbedret kvantitativ tilgang til vurdering af mitokondrie Fragmentering i kemoterapi kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Mitokondriel fission er en proces, der involverer spaltning af mitokondrier i mindre fragmenter og er reguleret af GTPase dynamin-relaterede protein 1 (Drp1). Højere niveauer af mitokondrie fission er associeret med induktion af apoptose i cancerceller. Men for at de nuværende metoder præcist at kvantificere mitokondrie fission for at sammenligne midler, som er rettet mod denne proces ofte tvetydige eller afhængige af subjektive vurdering. Mitokondrier er også tilbøjelige til sammenlægning, hvilket gør nøjagtig analyse vanskelig. Her beskriver vi en forbedret tilgang til kvantificering af mitokondrie fragmentering involverer flere forskelle fra øjeblikket eksisterende metoder. Celler først underkastet cytologisk centrifugering, hvilket reducerer cellulær z-aksen højde og dispergerer individuelle mitokondrier er lettere at observere. Tre kommercielt tilgængelige fluorescens analyseværktøjer påføres derefter disambiguate resterende mitokondriske klynger, der kræver yderligere inspektion. Endelig afskæringen scoring anvendes, som kan skræddersys til individuelle celletype. Den resulterende fremgangsmåde giver mulighed for en effektiv og objektiv vurdering af mitokondrie fragmentering i respons på behandlingen. Vi anvendte denne teknik til en eksperimentel spørgsmål involverer chemosensitive og kemoterapi kræft i æggestokkene (OVCA) celler. Cisplatin og fytokemiske piperlongumine fandtes at inducere både mitokondrisk fission og apoptose i chemosensitive celler, mens kun piperlongumine var i stand til at fremkalde disse cellulære responser i kemoterapi celler. Piperlongumine apoptose forekom at være medieret af Drp1-afhængig mitokondriel fission da den apoptotiske respons blev svækket ved tilstedeværelsen af ​​Drp1 inhibitoren mDivi-1. Vores undersøgelse giver grundlag for en mere objektiv tilgang til kvantificering af mitokondrie fragmentering, og kaster yderligere lys over en potentiel virkningsmekanisme for piperlongumine i behandlingen af ​​kemoterapi OVCA

Henvisning:. Farrand L, Kim JY, Im -Aram A, Suh JY, Lee HJ, Tsang BK (2013) En forbedret kvantitativ tilgang til vurdering af mitokondrie Fragmentering i kemoterapi i æggestokkene Cancer Cells. PLoS ONE 8 (9): e74008. doi: 10,1371 /journal.pone.0074008

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: 8. maj 2013; Accepteret: 29 Juli 2013; Udgivet: 9. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Farrand et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra World Class University (WCU) program (R31-10056) gennem National Research Foundation of Korea, finansieret af Undervisningsministeriet, videnskab og teknologi og den canadiske Institutes of Health Research (MOP-119381). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mitokondrier er dynamiske organeller findes i de fleste eukaryote celler, der undergår de processer af fission (opdeling i separate strukturer) og fusion (sammenlægning af to eller flere tilstødende strukturer). Fission er kendt for at gå forud for apoptose i en række celletyper, og menes at lette en hurtigere frigivelse af mitochondriale pro-apoptotiske faktorer, herunder cytochrom c og smac [1]. Men den præcise kvantificering af mitokondrie fission er teknisk udfordrende på grund af det store antal til stede i mange celletyper, og deres morfologiske træk. Celler udviser typisk varierende grader af fission afhængigt af celletype og miljømæssige kontekst [2]

De fleste af de nuværende tilgange til kvantitativ vurdering af mitokondrie fission er variationer af to overordnede strategier [2] -. [7] . Den første fremgangsmåde kræver måling af længderne af enkelte mitokondrier at bestemme graden af ​​fission [3] – [5]. Vi har fundet, at aggregering af mitokondrier [6], [7], især opvikling og knuder af strukturerne [8], samt det store antal mitokondrielle fragmenter i hver celle gør denne fremgangsmåde upraktisk i mindst nogle celletyper. Det tager heller ikke hensyn til den 3-dimensionelle struktur af mitokondrier i celler, som ikke tillader måling langs z-aksen, hvis der anvendes en enkelt 2-dimensionelle billede. En anden fremgangsmåde kræver, at subjektive vurdering af mitokondrie morfologi, og kræver, at operatøren vise billeder, der anses for at være repræsentative for celler med rørformede eller fragmenterede mitokondrier (andre udtryk, der anvendes til at beskrive morfologi omfatter aflange, smeltet, mellemliggende, præget og “kornet”) . Kvantificering ved hjælp af denne metode er hovedsagelig baseret på udtalelser fra observatøren, og hver celle er kategoriseret hvorefter repræsentativt billede det mere ligner [9] – [11]. Et stort problem i at anvende denne teknik er dens afhængighed af subjektive afgørelse, som indfører variation mellem individuelle observatører. Traditionel immunocytokemi i kamre skibe producerer også billeder, der typisk indeholder mindst nogle mitokondrier, der er ude af fokus under fluorescensafbildning og derfor ufuldstændig gengivelse af hele prøven.

Formålet med dette studie var at udvikle en forbedret metode til at kvantificere graden af ​​mitokondrie fragmentering i celler, og at anvende denne fremgangsmåde i at sammenligne indflydelse phytochemical piperlongumine på mitokondrie fission i chemosensitive og kemoterapi ovariecancerceller

in vitro

. Mens kvantificering af mitokondrie fragmentering tænkes vil tegne sig for små mitokondrie fragmenter optræder på grund af den syntese af nye mitokondrier og fragmentering forårsaget af mitophagy, når det kombineres med yderligere validering ved hjælp af passende markører, kan gøres mere præcise vurderinger af omfanget af mitokondrie fission. Vores fremgangsmåde involverer cytologisk centrifugering, som indfanger apoptotiske og raske celler under anvendelse 3-dimensional imaging (via konfokal laser mikroskopi z-stacking), og producerer flade celler med spredte mitokondrier der er lettere at skelne under billedbehandling. I tilfælde af mitokondrie sammenlægning, er tre kommercielt tilgængelige softwareværktøjer (Fluorescence Intensity Profilering, ortogonal Sektionsinddeling, og Heat Mapping), der anvendes til at disambiguate klyngerne og identificere antal individuelle mitokondrier. Desuden er en cut-off scoring teknik anvendt på mere effektivt at vurdere celler som værende enten fragmenteret eller rørformede.

Vi søgte at demonstrere den praktiske anvendelse af vores nye strategi, ved at bruge det til at undersøge betydningen af ​​mitokondrie fission i kemoterapi ovariecancer (OVCA). Modstand mod CDDP (cisplatin: cis-diammindichlorplatin (II)) i kræft i æggestokkene er en væsentlig hindring for en vellykket behandling [12]. Mens inddragelse af mitokondrier i caspase-medieret apoptose er blevet grundigt undersøgt, stadig at blive fuldstændigt forstået rolle mitokondrie morfologi i kemoresistens. Piperlongumine er en naturlig bestanddel af den lange Pepper (

Piper longum

L.) og er blevet rapporteret til at udvise en række bioaktive virkninger, herunder hæmning af trombocytaggregationen [13], nedregulering af androgen receptorer [14], og brede virkninger mod en række kemoresistent cancer celletyper gennem induktionen af ​​reaktive oxygenarter [15]. Vi har anvendt den ovenfor beskrevne kvantitativ tilgang til at sammenligne effekten af ​​CDDP og piperlongumine på mitokondrie fission og apoptose i chemosensitive og kemoterapi OVCA cellelinjer.

Materialer og metoder

Reagenser

CDDP blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Piperlongumine blev købt fra Tocris Bioscience (Bristol, UK). Anti-GAPDH, anti-Drp1 og anti-phospho-Drp1 (Ser637) antistoffer var fra Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Anti-TOM20 antistof var fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Alexa Fluor® 488 sekundært antistof, TEMED, RPMI 1640 dyrkningsmedier, kalvefosterserum og forlænge Gold antifade Reagens med DAPI var fra Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Alle antistoffer blev fortyndet i Dako Antibody Diluent (Dako # S0809) fra Agilent Technologies (Glostrup, Danmark). Komplet Mini proteaseinhibitorcocktail tabletter og PhosStop fosfatase-cocktail tabletter blev opnået fra Roche Applied Sciences (Penzberg, Tyskland).

cellelinjer og Kultur

CDDP-sensitive human OVCA cellelinje (OV2008) [16] og dens modstandsdygtige modstykke (C13 *) [17] var gaver fra Drs Rakesh Goel og Barbara Vanderhyden (Ottawa Hospital Cancer center, Ottawa, ON, Canada), og dyrkes som tidligere rapporteret [18]. De er af æggestokkene endometrioide adenocarcinom oprindelse med skællede differentiering.

Annexin V Apoptose Assay

OVCA celler blev farvet med FITC-konjugeret Annexin V (Bioline, London, UK) og propidiumiodid til at bestemme andel af cellerne, der var på de tidlige og sene faser af apoptose [19]. De farvede celler blev derefter analyseret under anvendelse af en BD FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences) og CellQuest /ModFit software.

immunblotting og immunfluorescensmikroskopi

Immunoblotting blev udført som tidligere beskrevet [18]. Band densiteter blev analyseret og kvantificeret under anvendelse af en BioRad ChemiDoc XRS + og Image Lab V3.0 (Hercules, CA, USA). OV2008 celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 8-brønds kammerobjektglas, inkuberet med passende fluorescens-konjugeret sekundære antistoffer og farvet med forlænge Gold antifade Reagens med DAPI (blå, nuklear farvning). De blev afbildet straks med et Zeiss LSM700 konfokalt udstyret med et Zeiss T-PMT digitalkamera (Zeiss, Oberkochen, Tyskland).

Cytologisk Centrifugering og Fiksering af celler

Celler blev podet for 12 timer i RPMI-medium suppleret med 10% FBS i 6-brønds plader. Efter behandling med passende testmidler, blev de høstet efter 2 minutters inkubering med 0,025% trypsin (200 pi) ved 37 ° C. Den trypsinisering blev udført hurtigt for at minimere skade på mitokondrier, og reaktionen blev standset ved tilsætning af 10% FBS i RPMI 1640. Cellerne blev forsigtigt vasket med 1 ml PBS (900 ×

g

, 1 min; alle PBS blev filtreret med et 0,45 mikrometer sprøjte filter, Sartorius Biotechnology, Goettingen, Tyskland), og cellepelleten blev forsigtigt resuspenderet i 500 pi frisk PBS. Halvtreds mikroliter af suspensionen blev centrifugeret (900 ×

g

, 4 min) ved hjælp af cytologiske kanaler sammen med silan-coatede objektglas og Whatman filtrerpapir (Hanil Science Cytospin cytologisk centrifuge, Daejeon, Sydkorea). Cellerne blev derefter fikseret i 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 24 timer. De blev derefter vasket (3 x 5 min) i PBS med forsigtig omrøring, permeabiliseret med 0,02% Triton-X fortyndet i PBS (inkuberet i 10 minutter ved 4 ° C) og underkastet en anden PBS vaskecyklus (3 x 5 min). Cellerne blev inkuberet med TOM20 (mitokondrie import receptor subunit) antistof (1:250, 24 timer, 4 ° C), vasket med PBS og inkuberet med Alexa Fluor® 488 sekundært antistof (stuetemperatur, 1 h). Celler blev derefter vasket i PBS før fiksering med en dækning slip hjælp forlænge Guld antifade Reagens med DAPI, og konfokal billedbehandling påbegyndes umiddelbart.

Kvantificering af mitokondrie fission

Efter cytologisk centrifugering, fiksering og immunfarvning af cellerne, 3-dimensionelle billeder af individuelle celler blev opnået ved anvendelse af konfokal mikroskopi ved at overlejre mindst 12 tværsnitsbilleder taget i intervaller langs Z-aksen og omfatter hele cellevolumen. indstillinger Standard eksponering involveret en pixel opholdstid i 50 mikrosekunder og felt dimensioner 300 × 300 mikrometer. Mindst 100 celler pr behandlingsgruppe blev vurderet for mitokondrie fission i hver gentagelse, med statistikker, der stammer fra tre uafhængige gentagelser. Hver enkelt celle analyseret blev klassificeret som enten fragmenteret eller ikke-fragmenteret i overensstemmelse med, om det mødte cut-off score på 8. Celler, opfyldte definitionen af ​​”fragmenteret” derfor indeholdt 8 eller flere individuelle mitokondrie fragmenter, der var hver 3 mikrometer lange ind den længste akse. I tilfælde af tvetydighed skyldes sammenlægning af mitokondrierne, tre kommercielt tilgængelige softwareværktøjer inkluderet i Zeiss LSM softwarepakke (Fluorescence Intensity Profilering, ortogonal Sektionsinddeling og Heat Mapping) blev anvendt til at løse de usikkerheder. Fluorescens Intensitet Profilering muliggør påvisning af fluorescens-mærkede mitokondrie grænser (mærket med TOM20), som afspejles af kraftige stigninger eller fald i fluorescensintensitet [20]. Operatøren trækker en lige linje gennem enhver region i billedet, og en automatiseret graf af fluorescensintensiteten er konstrueret. Ortogonale Sektionsinddeling tillader enhver region i billedet der skal inspiceres fra en x- eller y-aksen point-of-view (POV). Dette skaber en virtuel tværsnit perspektiv og giver oplysninger om mitokondrie grænser, der normalt ville blive skjult, hvis du ser fra den traditionelle top-down POV. Heat Kortlægning farvekoder alle fluorescerende objekter inden for en 3-dimensionelle billede i henhold til positionen af ​​objektet langs z-aksen. Til visualisering mitokondrier, værktøjet er mest nyttigt til at skelne separate mitochondrier, der er placeret på modstående sider af kernen (og som ellers ville fremstå som ental mitokondrier). I de fleste tilfælde blev disse værktøjer ikke nødvendigt at erkende fragmenterede mitochondrier, som cytologisk centrifugering dispergeret organeller det nemmere at se. Mitokondrie morfologi på mindst 80 celler pr behandlingsgruppe blev bestemt, med observatøren blindet for identiteten af ​​behandlingsgrupper. Kvantificeringer blev afledt fra tre uafhængige forsøg.

Statistical Analysis

Resultater udtrykkes som middelværdien ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført af en-vejs, to-vejs eller trevejs variansanalyse ved hjælp SigmaPlot software (Versioner 12; Systat Software, Chicago, IL, USA). Forskelle mellem flere forsøgsgrupper blev bestemt ved Bonferroni post-hoc test. Statistisk signifikans blev udledt på

p

. 0,05

Resultater

Cytologisk Centrifugering Forbedrer mitokondrie Imaging ved at øge Adskillelse Afstande mellem Individuel Mitokondrier

Vi først sammenlignede virkningen af ​​cytologisk centrifugering på konfokal imaging kvalitet mitokondrier. Optimering afslørede, at de ideelle rotor indstillingerne for cytologiske centrifuge til billeddannelse OV2008 celler omfattede en 900 × g spin for 4 minutter. blev udført Alle efterfølgende eksperimenter ved hjælp af disse indstillinger. I fravær af centrifugeringen trin blev mitokondrier observeret at aggregere tæt til kernen og at krølle mod vinklen på visning linse (figur 1, figur S1A). Side profilering af celler uden centrifugering afslørede en stor z-aksen højde på mindst 8 mikrometer, hvilket gør individuel skelnen af ​​separate mitokondrier vanskelig. Med inddragelse af en centrifugering skridt blev mitokondrier adskilt yderligere fra kernen, og øget afstand opstået mellem de enkelte mitokondrier. Centrifugerede celler udviste en reduceret z-akse højde på ca. 3 mikrometer, hvilket resulterer i en lettere observation af individuelle mitokondriske strukturer (figur 1B, fig S1B-C). En sammenligning af billedkvalitet med og uden centrifugering, anvendelse af identiske imaging indstillinger, afslørede, at centrifugering forbedret klarhed generelt mitochondriale funktioner (Figur 1C). Dette skyldtes til dels det faktum, at uden centrifugering, de fluorescerende billeder omfattede en højere grad af ‘ude af fokus “baggrundsfluorescens (dvs.. Fra mitokondrier, der ikke var klart synlig inden z-aksen planet, hvor billedet blev taget). Centrifugering forbedrer billedkvaliteten fokus ved udfladning celle funktioner inden for samme fokale plan.

(A) 3-dimensionelle ovenfra og side profiler af ubehandlede OV2008 celler, med og uden cytologisk centrifugering før fiksering. Gule pile angiver typiske områder af adskillelse, der vises mellem mitokondrier efter centrifugering. (B) Ortogonale dele af de samme billeder ses i (A) taget med indstillinger identiske kamera eksponering. Cellerne blev fikseret i 3,7% paraformaldehyd og farvet for nukleare (DAPI, blå) og mitokondrie (TOM20, grøn) signal. (C) Sammenligning af mitokondrie billedkvalitet mellem konventionel immuncytokemi og cytologiske centrifugering tilgange. Billeder af klassisk rørformede og fragmenteret mitokondrie morfologi bliver synligt skarpere efter centrifugering på grund af minimering af fluorescens stammer fra baggrunden kilder uden for fokusplanet. Udvidelsen af ​​kernen efter centrifugering skyldes udfladning af cellerne ved centripetalkraft. Scale barer = 5 um.

Fluorescens Intensitet Profilering, ortogonal Sektionsinddeling og Heat Mapping Tools Tillad for hurtig Distinction af Individual Mitochondriel Fragmenter inden aggregater

Vi bemærkede, at selv om centrifugering forbedret vores evne til at skelne mitokondrier i nogle tilfælde sammenlægning af mitokondrier syntes uundgåelige trods bestræbelser på at løse problemet. Vi vedtog tre fluorescens analyseværktøjer (Fluorescens Intensitet Profilering, ortogonal Sektionsinddeling og Heat Mapping) at supplere kvantificering af mitokondrier til stede i aggregater. Disse værktøjer give flere oplysninger om den rumlige orientering af mitochondriemembraner, så flertydig af fluorescerende signal, der ellers kan virke forvirrende. Fluorescensintensitet Profilering (Zeiss LSM-softwarepakken) er et værktøj, der normalt anvendes til at bestemme signal-til-baggrund-forhold på tværs fluorescerende regioner i et billede [20]. Dette værktøj kan alternativt anvendes til at bestemme antallet af individuelle mitokondrier inden et aggregat, som intensiteten af ​​fluorescens er direkte proportional med antallet af mitochondriske membraner. Efter gennemsigtige overlejringer, kan antallet af mitokondrier ekstrapoleres i store grupper ved simpel deling af toppen signal ved fluorescens-intensiteten opnået fra en enkelt mitokondrie (figur 2A). Heat Mapping giver oplysninger om z-akse mitokondrie steder ved hjælp en farvekodet spektrum (figur 2B, fig S2A-C) [21]. Mitokondrier, der er overlejret eller fladtrykt bagved eller foran kernen let kan identificeres i henhold til deres farve opgave. Endelig ortogonal Sektionsinddeling (Zeiss LSM) tilvejebringer tværsnitsbilleder af enhver x-y placering fra en perspektivisk vinkelret på z-aksen, hvilket tillader tæt inspektion af mitokondrielle grænser, der ellers ville være skjult fra en traditionel top-down view (figur 2C). Ved tilstrækkelig høj opløsning, og med optimal udvidelse af cytoplasmaet via centrifugering skridt, fandt vi, at disse fluorescens værktøjer kun var påkrævet i 10% af tilfældene, hvor en beslutning om ikke kunne nås på grund af uregelmæssig mitokondrie sammenlægning. Den effektive anvendelse af disse værktøjer er afhængig af flere antagelser, for eksempel, at alle mitokondrier i et aggregat er lige farves, at fluorescerende signal har en tilstrækkelig signal-støjforhold, og at mitochondriske membraner kan skelnes ved tilsvarende ændringer i fluorescerende signal.

(a) Fluorescensintensitet profilering af en enkelt celle med fragmenterede mitokondrier. Intensitet af mitokondrie signal langs en lineær profil valgt af operatøren (lyseblå pil) er repræsenteret kvantitativt. (I) Emission top af en enkelt mitokondrie indikeres grafisk (gul pil). (Ii) adskilt mitokondrier er tydelige som selvstændige toppe. (Iii) Højere toppe (gul pil) antyder tilstedeværelsen af ​​multiple mitochondrier, overlejret under centrifugering. 3D billeddata er lagdelt gennemsigtigt, med individuelle mitokondrisk antal er direkte proportional med intensiteten af ​​fluorescensen. (B) Heat kortlægning af en enkelt celle behandlet med CDDP (10 uM, 12 timer). Forskelle i z-akse placering værdier af mitokondrielle fragmenter er repræsenteret som farver. (I) Forstørrelse (gul boks) afslører tydelig mitokondrier ved forskellige z-akse højder (grøn vs. appelsin). (Ii) Den omvendte billede af den samme celle i (i), hvilket indikerer yderligere individuelle fragmenter (cyan vs blå, gul pil). (C) ortogonal sektion værktøj viser tværsnit af en enkelt celle langs y-aksen (indsat stiplede gule boks, forstørret som grønne boks) og x-aksen (forstørret som rød boks). Y. (i) Forstørrelse (grøn boks) af y-aksen vinkelret sektion. (Ii) Forstørrelse (rød boks) af x-aksen vinkelret sektion. Gule pile angiver rum adskiller de enkelte mitokondrier.

Anvendelse af Cut-off Scores Giver Skelnen mellem celler indeholdende forskellige grader af mitokondrie Fission

Selvom det er muligt præcist at bestemme antallet af mitokondrier i en given celle, er det tidskrævende og upraktisk, hvis vurdering af en stort antal celler. Vi næste udtænkt en semi-kvantitativ tilgang til en mere effektiv og mindre arbejdskrævende vurdering af billederne. Vi fortsatte ved at vurdere det mitokondrielle fænotype (rørformet eller fragmenteret) baseret på en cut-off score defineret af et minimumsantal af mitokondrielle fragmenter af en defineret længde stede i hver celle. Stringens kategorisering bestemmes af cut-off score vælges (figur 3). Hvis 8 eller flere mitokondrier, der var hver kortere end 3 mikrometer i længde blev fundet overalt i cellen, vil hele cellen betragtes som “fragmenterede”. Opfyldelse af kriterierne gør yderligere vurdering af de resterende mitokondrier unødvendige (vist i figur 3).

Figuren viser tre celler med varierende grader af fission. (I) En cut-off score på 2 (resultatet er »Ja«, hvis der konstateres 2 eller flere mitokondrie fragmenter, der er 3 mikrometer i længden tværs den længste akse) sætter alle 3 celletyper i samme kategori. (Ii) En cut-off score hævet til 5 adskiller Cell A som anderledes til celler B og C (et kriterium for klassificering Cell A som “rørformet”) (c) En cut-off score på 10 steder Cells A og B i samme kategori, der adskiller sig fra celle C. Anvendelse af mere end en cut-off score giver mulighed for skelnen af ​​varierende grader af mitokondrie fission.

kemosensitivitet til CDDP og Piperlongumine er associeret med mitokondrie fission

Vi anvendte næste denne teknik til at undersøge indflydelsen af ​​piperlongumine og CDDP (0 og 10 uM, 12 timer) på mitokondrie fission i chemosensitive (OV2008) og kemoterapi (C13) OVCA celler (figur 4). Begge forbindelser forårsagede forøgelser i mitokondrie fission og apoptose i en koncentrationsafhængig måde i OV2008. Men kun piperlongumine haft samme virkning i C13, hvilket tyder på, at sidstnævnte ikke blot fremmer apoptose men også inducerer mitokondrie fission i kemoterapi OVCA celler. Mindst 100 celler pr behandlingsgruppe blev vurderet for mitokondrie fission i hver replikat, med statistikker, der stammer fra tre uafhængige gentagelser.

(A) Repræsentative billeder af rørformede og fragmenterede mitokondrier i chemosensitive celler (OV2008) og deres resistente modparter (C13). Mitokondrier og kerner blev farvet med TOM20 (grøn) og DAPI (blå), hhv. (B) Effekt af piperlongumine og CDDP på ​​mitokondrie fission i OV2008 og C13-celler, som vurderet med en enkelt cut-off score på 8 (celler, der indeholder 8 eller flere mitokondrie fragmenter 3 mikrometer i længden blev klassificeret som havende fragmenteret mitokondrier). (C) Effekt af CDDP og piperlongumine på apoptose, som vurderet af Annexin V assay (*,

s

0,05, **,

s

0,01, ***,

s

. 0,001 versus respektive ubehandlet kontrol)

CDDP og Piperlongumine-induceret Mitokondriel fission og Apoptose er Drp1-afhængige i Chemosensitive OVCA

Som svar på forskellige celletyper stress, er Drp1 aktiveret ved dephosphorylering ved Ser637. Dette efterfølges af sin rekruttering til mitokondrierne, hvor det oligomeriserer at tilvejebringe den mekaniske styrke er nødvendig for fission at forekomme [22]. Vi antager, at hvis Drp1-afhængige mitokondrie fission er en afgørende faktor for den chemosensitive respons, bør både CDDP og piperlongumine behandling resultere i dephosphorylering af Drp1. Dette var faktisk tilfældet i OV2008-celler (figur 5A). Vigtigere, behandling af OV2008-celler med en farmakologisk inhibitor af Drp1, mDivi-1, signifikant svækket både mitokondrie fission og apoptose induceret af de to forbindelser (figur 5B). Disse data understøtter en årsagssammenhæng mellem fission og apoptose. Mindst 100 celler pr behandlingsgruppe blev vurderet for mitokondrie fission i hver replikat, med statistikker, der stammer fra tre uafhængige gentagelser.

(A) CDDP (10 uM) og piperlongumine (10 uM) nedreguleret af phospho -Drp1 indhold (Ser637) i OV2008 celler

in vitro

. (B) (i) Effekt af mDivi-1 (0-10 uM) på CDDP- og piperlongumine-induceret mitokondrie fission og (ii) apoptose som vurderet af Annexin V assay (**,

s

0.01, ***,

s

0,001 versus respektive DMSO kontrol behandlet med identisk mDivi-1-koncentration, #,

s

0,05 versus respektive PL eller CDDP behandling i mangel af mDivi-1).

Drp1-afhængige mitokondriel fission er en afgørende faktor for Piperlongumine-induceret apoptose i kemoterapi OVCA

Vores tidligere undersøgelser har vist, at mitokondrie fission er forbundet med kemosensitivitet, mens CDDP modstand er præget af en mangel på en sådan aktivitet (figur 4). Vi næste forsøgt at afgøre, om piperlongumine var årsag apoptose i kemoterapi C13 * celler via Drp1-afhængige mitokondrie fission. Koncentration-respons-analyse viste, at piperlongumine, men ikke CDDP, induceret dephosphorylering af Drp1 på Ser637 (figur 6A). Tilsætning af Drp1-inhibitoren mDivi-1 også delvist svækket piperlongumine-induceret mitokondrisk fission og apoptose (figur 6B). Mindst 100 celler pr behandlingsgruppe blev vurderet for mitokondrie fission i hver replikat, med statistikker, der stammer fra tre uafhængige gentagelser.

(A) Piperlongumine men ikke CDDP (0-10 uM) nedregulerer phospho-Drp1 (Ser637) indhold. (B) (i) Effekt af mDivi-1 (0-10 uM) på piperlongumine-induceret mitokondrie fission og (ii) apoptose, som vurderet af Annexin V assay (**, p 0,01, ***, s 0,001 versus respektive DMSO kontrol behandlet med identisk mDivi-1-koncentration, #,

s

0,05; ##,

s

0,01; ###,

s

0,001 versus respektive PL eller CDDP behandling i fravær af mDivi-1))

diskussion

Mens kvantificering af mitokondrie fission er iværksat i flere veldesignede.. undersøgelser, beskrivelserne af offentliggjorte fremgangsmåder er noget tvetydige og subjektive [2] – [7]. Vi noterer to væsentlige vanskeligheder i præcist at kvantificere fission. Den første er aggregering af mitokondrier, især omkring kernen, hvilket gør skelnen af ​​separate organeller vanskelig. Den anden er den tid det tager at kvantificere mitokondrierne, selv om alle individuelle fragmenter kan skelnes ved hjælp af avancerede 3-dimensionelle kortlægning teknikker.

Vi anerkender, at der findes flere publicerede automatiserede metoder, som vi har undersøgt og fundet at være interessant. Men vi mener, at disse metoder kræver omfattende baggrundsviden om beregningsmæssige algoritmer for at blive brugt effektivt. En metode bruger automatiseret fluorescerende pulserende ved 30 Hz og ansættelse af computerstøttet analyse [23]. I vores forsøg på at følge de trin, som forskerne fandt vi store vanskeligheder ved fortolkningen af ​​en række af de instruktioner, der kræver betydelig baggrundsviden, og var ude af stand til at lykkes i at producere meningsfulde data. Frembringelsen af ​​en syntetisk binært billede som en test model kræver også omfattende kendskab til relevante dimensioner af mitokondrier i hver celletype, et krav ikke nødvendig for vores tilgang.

En anden spændende beregningsmæssige tilgang [24] indebærer automatiseret subtypning af mitokondrie morfologi. Vi har også forsøgt at ansætte microP software skrevet af forfatterne til vores eksperimentelle behov, men det var ligeledes meget vanskeligt for os at lære på grund af den tekniske (beregningsmæssige viden) behov. MicroP kræver, at brugeren med held kalibrere softwaren før brug.

I de foreliggende undersøgelser har vi fat på spørgsmålet om aggregering ved at anvende en cytologisk centrifugeringstrin, som flader cytoplasmaet langs planet af slæden og gør skelnen af individuelle mitokondrier betydeligt lettere. Spørgsmålet om tidspres blev behandlet ved anvendelse af cut-off scoring at give mulighed for mindre arbejdskrævende kategorisering af mitokondrie fænotyper. Mens den mest nøjagtige metode til kvantificering af fission ville være en absolut optælling af det samlede antal individuelle fragmenter, den nødvendige tid gør denne fremgangsmåde upraktisk, især for studier med en stor stikprøve. Vores foreslåede tilgang giver mulighed for erhvervelse af mitokondrie fission data kan sammenlignes med det, der kræves i studiedesign tidligere [2] – [7], men med mere specifikke retningslinjer for uafhængig reproducerbarhed. En oversigt over den nye metode er vist i figur 7.

Mens vores tilgang giver åbenlyse fordele, vi også bemærke flere potentielle faldgruber. Mangfoldigheden i mitokondrie morfologi tværs celletyper er betydelig og kan kræve finjustering og validering af protokollen. For eksempel kan nogle celletyper har et stort antal af mitokondrier og en relativt lavere volumen cytoplasma. I sådanne tilfælde kan der være behov omhyggelig optimering af centrifugen trin og et større antal z-akse billeder pr celle. Højere centrifuge hastigheder forbedre mitokondrie dispersion, men kan også fremme sprængning af kernen (vist i fig S3). Vi har også forsøgt at bruge vores tilgang med

in vivo

OVCA tumorprøver farvet med TOM20, og fandt, at den manglende evne til at centrifugere solide tumorer kombineret med overdreven uspecifik baggrund signal gjort det umuligt.