PLoS ONE: Transport af Berberin i HepG2, HeLa og SY5Y Celler: En Korrelation til sin anti-kræft Effect

Abstrakt

De anti-cancer aktiviteter Berberin (BBR) er blevet rapporteret i udstrakt grad i forskellige kræftcelle linjer. Men den minimale hæmmende koncentrationer af BBR varierede meget mellem forskellige cellelinjer og meget få undersøgelser har været afsat til at belyse dette aspekt. I denne undersøgelse anvendte vi tre cancercellelinier, HepG2, HeLa og SY5Y, at sammenligne transport og distribution af BBR. HPLC-resultater viste, at BBR var i stand til at trænge ind alle cellelinjer mens de kumulative koncentrationer var signifikant forskellige. HepG2-celler akkumuleret højere niveau af BBR længere varighed end de andre to cellelinjer. Molekylære docking undersøgelser afslørede BBR bindende site på P-glycoprotein 1 (P-gp). Desuden har vi belyst, at BBR reguleret P-gp ved både mRNA og protein niveauer. BBR inducerede transkription og translation af P-gp i HeLa og SY5Y celler, mens BBR hæmmede P-gp-ekspression i HepG2-celler. Yderligere undersøgelse viste, at BBR regulerer P-gp-ekspression afhængig af forskellige mekanismer (eller påvirkes af forskellige faktorer) i forskellige cellelinier. For at opsummere, vores undersøgelse har afsløret adskillige mekanistiske aspekter af BBR forordning om P-gp i forskellige cancer cellelinjer og kan kaste nogle nyttige indsigt i brugen af ​​BBR i anti-cancer lægemiddeludvikling

Henvisning:. Pang YN, Liang YW, Feng TS, Zhao S, Wu H, Chai YS, et al. (2014) Transport af Berberin i HepG2, HeLa og SY5Y Celler: En Korrelation til sin anti-cancer effekt. PLoS ONE 9 (11): e112937. doi: 10,1371 /journal.pone.0112937

Redaktør: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, University of Crete, Grækenland

Modtaget: Juni 21, 2014, Accepteret: 17 oktober 2014; Udgivet: November 17, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81374006 og 81073092) og National S T Major Special Project for New Drug R 40 cykler af 94 ° C i 10 sek, 60 ° C i 10 sek, 72 ° C i 20 sek; 72 ° C i 10 minutter og afkølet til 4 ° C. Data blev behandlet i den LC-480 II software program (Roche, USA).

Western blot-

Proteinprøverne blev fremstillet og anvendt til Western blotting som tidligere beskrevet [22]. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse Bio-Rad proteinassay reagens. Proteinprøver blev opløst på 8% SDS-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, USA). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i TBST (TBS-buffer indeholdende 0,05% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med det primære antistof fortyndet med 3% mælk i TBST ved 4 ° C natten over. De primære anvendte antistoffer var monoklonalt muse-anti-P-gp (1:500, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), GFP (1:3000, Abmart, Shanghai, Kina) og β-actin (1:2000, Boster bioteknologi Wuhan, Kina). Det andet anvendte antistof var gede-anti-mus HRP antistof (1:1000, ZSGB-BIO, Kina) blev efterfulgt af kemiluminescens som beskrevet [21].

Statistisk analyse

Alle data repræsenteret som middelværdi ± SD og statistisk analyseret ved anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA). F test blev udført ved hjælp af Excel Software til Office 2007 (Microsoft, USA). Efter F-test, den studerendes

t

-test mellem to grupper blev udført. En-vejs ANOVA

t

-test blev ansat til at analysere forskellene mellem sæt af data ved hjælp af Graph Pad Prism 5.0 software (Graph Pad, San Diego, USA).

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Cellulær optagelse af BBR

Den intracellulære fordeling af BBR er vigtig for forståelsen af ​​den rolle, BBR som et anti-cancer lægemiddel. Vi anvendte tre repræsentative cellelinier: HepG2, HeLa og SY5Y at analysere BBR fordeling [23] – [26]. En ikke-toksisk dosis af BBR (0,5 ug /ml) blev anvendt gennem hele undersøgelsen baseret på resultaterne af cytotoksicitet assay og letalitet kurver (fig. 1A-F). Det konfokale mikroskop afbildet BBR fordeling i levende celler (fig. 2A), hvilket viste, at BBR kan indtaste HepG2, HeLa og SY5Y-celler inden for 1 time efter lægemiddelbehandling (fig. 2B, C). Størstedelen af ​​BBR var i cytoplasmaet og ingen indlysende nuklear indlæg blev observeret. Tidligere rapporter har vist BBR indtaste nucleus og konkurrere med TBP (TATA Box Binding protein) for TATA Box i PC12 celler [14]. Vi undlod dog at observere kernen fordeling af BBR i disse tre kræftceller.

(A-F) Den cytotoksicitet og dødelighed af BBR ved hjælp MTT assay. (A, B) HepG2, (C, D) HeLa. (E, F) SY5Y. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,005, statistiske signifikans af BBR behandlede grupper i forhold til at styre grupper. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. fra seks uafhængige forsøg (n = 6).

(A-I) Billeder af den subcellulære lokalisering af BBR i celler før og efter 0,5 ug /ml BBR administration i 1 time. (A-C) HepG2-celler; (D-F) HeLa-celler; (G-I) SY5Y-celler. Fluorescensen af ​​BBR er vist med grønt, differential interferens kontrast (DIC) tal repræsenterer omfanget af celler og skala bar er 10 um.

Så brugte vi HPLC og LC /MS til kvantitativt analysere intracellulære koncentration af BBR i HepG2, HeLa og SY5Y celler efter cellulær post. Resultaterne viste, at BBR effektivt kan adskilles og påvises ved hjælp af HPLC under de angivne betingelser (fig. 3A-C). Standardkurverne af BBR demonstrerede et stærkt signal-til-støj-forhold og en god lineær sammenhæng (R

2 = 0,999) mellem toparealet og koncentrationen af ​​BBR (fig. 3D). Der var forskelle i optagelsen af ​​BBR blandt de tre cellelinjer. HPLC-assay viste, at i HepG2-celler, BBR maksimal koncentration (C

max) var på omkring 2188,8 pmol /mg ved ca. 12 timer efter behandling (fig. 3E). C

max på BBR i HeLa og SY5Y var 357,8 pmol /mg og 65,5 pmol /mg, når (fig. 3F, G). Efter tre timer koncentrationerne af BBR i HeLa og SY5Y-celler kom ned. Det vises, at BBR blev akkumuleret til højere niveau i HepG2 celler end de andre. Salg

(A-C) HPLC-kromatogrammer. (A) Standard BBR; (B) Blank prøve fra BBR-behandlede celler; (C) Prøver fra celler med BBR administration for 12 timer. (D) Standard kurver af BBR-koncentration vers AU intensitet ved hjælp af HPLC-analysen. (E-G) Kinetisk adfærd BBR i cellerne i plot med administrationen gang i 24 timer. (E) HepG2; (F) HeLa; (G) SY5Y-celler. (H, I) LC /MS kromatogrammer af BBR i HepG2-celler efter administrationen i 24 timer. (H) massespektret af BBR; (I) kromatogrammet af BBR. Standard BBR blev vist i grøn; prøven blev vist i lilla farve. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. fra seks uafhængige forsøg (n = 6).

Desuden at forstå, om koncentrationen højere BBR i HepG2-celler skyldtes rolle HepG2 i aktivt metabolizing BBR, vi oprettet LC /MS til analysere metabolit produkter af BBR i cellerne. Som rapporteret, er der metabolit produkter af BBR efter oral eller injektion optagelse i rotter [27]. Men vi ikke registrere nogen af ​​dem i HepG2-celler (fig. 3H, I), hvilket tyder på BBR forblev intakt i HepG2 celler [28].

P-gp har stor efflukstransporteren af ​​BBR

for at validere rolle P-gp i udstrømningen af ​​BBR i HepG2, HeLa og SY5Y celler, en selektiv P-gp-hæmmer, Zosuquidar (LY335979, Selleckchem, USA) blev anvendt [29], [30]. Som vist i fig. 4, Zosuquidar effektivt øgede koncentrationen af ​​BBR i HepG2, HeLa og SY5Y celler, hvilket tyder på, at P-gp har stor BBR efflukstransporteren i disse celler. Disse resultater var i god overensstemmelse med tidligere undersøgelser [28], [31].

Celler blev behandlet med 0,5 ug /ml BBR og 0,3 pmol Zosuquidar, inhibitoren af ​​P-gp-aktivitet, i 12 timer. De intracellulære koncentrationer af BBR blev bestemt ved HPLC-assay. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). . *

v.s

kontrollen,

P

0,05. **

vs

kontrol,

P

0,005,

t

-test

Molekylær docking af BBR til P-gp.

Vi analyseret yderligere interaktionen af ​​P-gp og BBR ved computerbaseret molekylær docking. Krystalstrukturen af ​​humant P-gp er blevet identificeret i en database hos NCBI. Vi udnyttede derfor den samme struktur som receptor til at udføre molekylær docking af BBR. Resultaterne antydede, at BBR kunne binde til lægemidlet binding-lomme af P-gp (fig. 5A, B). Bindingsstedet i BBR blev placeret i “lavere” del af den bindende lomme (fig. 5C, D). Den glide energi er -9.1 kcal /mol, hvilket tyder på høj bindingsaffinitet af BBR til P-gp.

(A) Side og (B) oven af ​​BBR bindende lomme af P-gp. (C, D) de samlede docking visninger af BBR i bindingslommen af ​​P-gp. Blå maske: proteins elektron isodensity kort omkring bindingssted. Protein er repræsenteret som tegneserie (gennemsigtighed = 20%), små molekyler og vigtige aminosyrer (som mærket) er repræsenteret som linjer (hvid og grøn, carbon. Rød, oxygen. Blå, nitrogen). Gul streg linje, hydrogenbinding.

BBR påvirker P-gp udtryk

For at belyse, om BBR regulerer P-gp udtryk, undersøgte vi mRNA og protein ekspressionsniveauer af P-gp i HepG2, HeLa og SY5Y celler efter BBR behandling. Resultaterne viste, at mRNA af P-gp blev forøget i HeLa og SY5Y-celler, mens faldet i HepG2-celler på en dosis-afhængig måde efter BBR behandling (fig. 6A). Endvidere Western blot-analyse valideret disse resultater, der viser, at BBR øget P-gp-ekspression i HeLa og SY5Y-celler, men faldt ekspressionen i HepG2-celler (fig. 6B, C).

(A) mRNA udtryk for endogene P-gp ved hjælp af real-time PCR-analyse. (B) Western blotting assay viste ændringer i P-gp-protein med BBR behandling. (C) forholdet ændringer af P-gp versus β-actin. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. fra 3 uafhængige eksperimenter (n = 3). Koncentrationen af ​​BBR var 0,5 ug /ml. *

v.s

kontrollen,

P

. 0,05; . **

v.s

kontrollen,

P

0,005,

t

-test. For paneler i (A) og (C), Venstre, HepG2; Mellemøsten, HeLa; Right, SY5Y.

Hvordan BBR regulerer P-gp udtryk er ukendt. For at bestemme virkningen af ​​BBR på P-gp transkriptionsinitiering, blev et P-gp 1 kb-promotoren fusioneret GFP konstrueret (fig. 7A) og transficeret ind i de tre cellelinier [19]. Disse celler blev behandlet med eller uden BBR og efterfulgt af flowcytometri udvælgelse og RT-PCR-analyse (fig. 7B-D). RT-PCR-resultater viste, at BBR har ingen regulering rolle i promotoren aktivitet af P-gp. Desuden blev proteinet ekspressionsniveauet af GFP ikke påvirket af BBR ifølge Western blotting-resultater i fig. 7E-H. Da GFP blev fusioneret med P-gp-promotoren i plasma, og det er ikke til stede i mammale celler, GFP protein udtryk data viste, at BBR ikke kunne virke på P-gp-promotoren på udskriften niveau.

(A ) Skematisk kort over P-gp 1 kb-promotoren fusioneret GFP (P-gp-promotor-GFP) konstruktionen. Sort, P-gp-promotoren. Green, læseramme af EGFP. (B-D) mRNA udtryk for P-gp 1 kb-promotoren fusioneret GFP i nærvær eller fravær af BBR af real-time PCR-analyse. (B), HepG2; (C), HeLa; (D), SY5Y. (E) Western blotting assay viste ændringer af P-gp 1 kb-promotoren fusioneret GFP-protein med BBR behandling. (F-H) forholdet ændringer i GFP versus β-actin. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. fra 3 uafhængige eksperimenter (n = 3). “

ns”

betyder ingen statistisk signifikans.

Diskussion

Formålet med denne undersøgelse er at forstå samspillet mellem BBR, en potent anti-cancer sammensatte, og P-gp, et vidt udbredt lægemiddel efflukstransporteren. Tidligere undersøgelser afslørede, at ved en koncentration på 0,5 ug /ml BBR var effektive til beskyttelse af dyrkede neuronceller mod skader efter oxygen og glucose deprivation [22], og vi bekræftet den ikke forårsage nogen skade på HepG2, HeLa eller SY5Y-celler baseret på MTT-assay . I vores nuværende arbejde, observerede vi indgangen BBR ved konfokal mikroskop og registreres den dynamiske akkumulering af BBR anvendelse af HPLC og LC /MS. Resultaterne viste signifikante forskelle mellem de tre cellelinier, HepG2 akkumuleret mere BBR længere varighed end de andre to cellelinjer. Ved LC /MS assay fandt vi der var ingen metabolitter af BBR i HepG2 celler efter BBR administration, hvilket indikerer den høje koncentration af BBR i HepG2-celler er kun BBR selv. Vi konkluderede derfor, at HepG2 kunne akkumulere mere BBR og holde det i længere tid i cellerne.

Som litteraturen rapporteret [15], P-gp primært er ansvarlig for udstrømningen af ​​BBR. Derfor anvendes vi en specifik hæmmer af P-gp, som effektivt blokerede udstrømningen af ​​BBR og øget BBR koncentration i HepG2-celler. En specifik binding lomme af P-gp for BBR blev afsløret i den molekylære docking forudsigelse. Dette forklares delvist site, hvorigennem BBR kunne påvirke evnen af ​​P-gp i mediering BBR efflux, selvom en detaljeret mekanisme indbyrdes sammenhæng mellem disse to fænomener (bindingen af ​​BBR og efflux effektiviteten af ​​P-gp) er stadig ukendt.

Ved at anvende molekylærbiologi og biokemi metoder målte vi niveauerne af mRNA og protein af P-gp i cellerne efter BBR behandling. Resultaterne viste, at BBR inducerede mRNA og protein udtryk for P-gp i HeLa og SY5Y-celler, og følgelig fremmes udstrømningen af ​​BBR og reducerede koncentrationen af ​​intracellulært BBR. Disse resultater kan forklare den observation, at den intracellulære koncentration af BBR toppede og faldt meget hurtigt i disse celler. Imidlertid P-gp-ekspression faldt med stigende koncentrationer af BBR i HepG2-celler, som var i god overensstemmelse med den kendsgerning, at den intracellulære koncentration af BBR kontinuerligt opbygget i HepG2-celler.

Som vist i fig. 6 og fig. 7, mRNA og protein udtryk for P-gp i HeLa og SY5Y-celler blev opreguleret efter BBR administration, mens mRNA-ekspression af P-gp i promotoren transficeres i cellerne var ikke opreguleret. For at verificere resultatet, vi udførte en supplerende eksperiment ved hjælp GFP proteinekspression. Resultaterne viste GFP protein udtryk var ikke opreguleret efter BBR administration, understøtter mRNA udtryk data af P-gp i promotoren transficeret i HepG2, HeLa og SY5Y-celler. Da der ikke er GFP protein i pattedyrsceller, GFP protein udtryk data kraftigt støtte, at BBR ikke handlede på promotor af P-gp.

BBR blev rapporteret at øge biotilgængeligheden af ​​flere forbindelser ved at hæmme P- gp i Caco-2 tarmceller [16]. Det fremmede også ekspressionen af ​​P-gp i multiresistens af cancerceller, herunder oral (KB, OC2), gastrisk (SC-M1, NUGC-3) og kolon (COLO 205, CT 26) cancerceller [32], [33 ], hvilket tyder på kompleksiteten i forholdet mellem BBR og P-gp i forskellige celler.

Da BBR ikke kunne komme ind kerner, er det ikke sandsynligt, at BBR har uden virkning DNA /gensekvenser, der fører til ingen virkning af BBR på P-gp-promotoren transkription. Kombinere med de forskellige P-gp ekspressionsmønstre induceret af BBR forudser vi, at der skulle opstå virkningen af ​​BBR på P-gp-ekspression efter gentranskription, for eksempel mRNA og protein stabilitet eller protein posttranskriptionel modifikation. Beskæftigelse af P-gp inhibitoren drastisk inhiberet P-gp funktion at transportere BBR i de tre cellelinier, hvilket indikerer, at der ikke er nogen forskelle mellem funktionen af ​​P-gp protein i cellerne. Dette antyder, at der kan være forskellige cellulære faktorer for P-gp proteinekspression i cellerne, og samspil mellem BBR, P-gp og forskellige signaltransduktionsveje kan være drastisk forskellige i forskellige cancercellelinjer, hvilket resulterer i de forskellige respons af tumor celler til BBR. Det kræver yderligere undersøgelse.

Konklusioner

Sammenfattende er dette den første rapport om, hvordan BBR reguleret P-gp aktiviteter blandt HepG2, HeLa og SY5Y kræft cellelinjer. P-gp kombinerer med BBR for at opfylde BBR, og samtidig BBR forstyrrer P-gp-ekspression til at regulere sin egen udstrømning fra cytoplasma. BBR inducerede ekspression af P-gp i HeLa og SY5Y-celler, men inhiberede ekspression af P-gp i HepG2-celler, sandsynligvis forårsaget af forskellige mønstre af P-gp proteintranslation. Der var ingen direkte regulering af P-gp-promotor transskription, hvilket indikerer forskelle i regulering og /eller mekanismer, der eksisterer i HepG2 celler og HeLa og SY5Y celler. Forskellene mellem de tre cellelinier, der er angivet i denne undersøgelse kan hjælpe os med at forstå kræftcellernes evne til optagelse og transport kræftmedicin, også medvirken i viden om mulige lægemiddel resistensmekanismer.

Tak

Vi takker alle de kolleger i vores laboratorium. Vi takker Dr. Yu Tian, ​​Drug Discovery Facility af Tsinghua University, for ved hjælp af LC /MS detektion.