PLoS ONE: Efter Mitokondrisk Footprints gennem en lang slimhinder Sti til lungekræft

Abstrakt

Baggrund

mitokondrie-DNA (mtDNA) mutationer er rapporteret i forskellige tumorer. Men der er ingen oplysninger om den tidsmæssige udvikling af mtDNA mutationer /indhold ændring og deres omfang i normal og unormal slimhinde kontinuerligt udsættes for tobaksrøg i patienter med lungecancer.

Metode

Vi undersøgte mønsteret af mtDNA ændring (mtDNA mutation og indhold indeks) i 25 luftvejs mucosale biopsier svarende tumorer og normale lymfeknuder opnået fra tre patienter med primær lungekræft. Derudover undersøgte vi mønster af mtDNA mutation i tilsvarende tumorer og normale lymfeknuder opnået fra otte andre patienter med primære lungekræft. Hele 16,5 kb mitochondriegenom blev sekventeret på Affymetrix Mitochip v2.0 sekventering platform i hver prøve. For at undersøge mtDNA indhold indeks, vi udførte real-time PCR-analyse.

vigtigste resultater

De luftvejs slimhinder biopsier opnået fra tre lungekræftpatienter var histopatologisk negative, men udstillede flere klonale mtDNA mutationer påviselige i tilsvarende tumorer. En af patienterne blev opereret to gange til fjernelse af tumoren fra højre øvre og venstre nedre lap henholdsvis inden for et spænd på to år. Begge disse tumorer udstillede tyve identiske mtDNA mutationer. MtDNA indhold steget betydeligt (P 0,001) i lungekræft og alle histologisk negative slimhinder biopsier undtagen én i sammenligning med kontrolgruppen lymfeknude

Konklusioner /Betydning:.

Vores resultater dokumentere omfanget af massive klon-patches, der udvikler sig i levetid rygere og i sidste ende giver anledning til klinisk signifikante kræftformer. Disse observationer belyse omfanget af sygdom i luftvejene af rygere sporbare gennem mtDNA mutation. MtDNA mutation kunne være et pålideligt værktøj til molekylær vurdering af respiratorisk epitel udsat for kontinuerlig røg samt afsløring sygdom og overvågning. Funktionel analyse af de patogene mtDNA mutationer kan være nyttigt at forstå deres rolle i lunge tumorigenese

Henvisning:. Dasgupta S, Yung RC, Westra WH, Rini DA, Brandes J, Sidransky D (2009) Efter Mitochondrial Footprints gennem en lang slimhinder Sti til lungekræft. PLoS ONE 4 (8): e6533. doi: 10,1371 /journal.pone.0006533

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: May 16, 2009; Accepteret: 6 Juli 2009; Udgivet: 6 August, 2009

Copyright: © 2009 Dasgupta et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af EDRN tilskud UO1CA084986. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det humane mitokondrie-DNA (mtDNA) er en 16,5 kb dobbeltstrengede lukket cirkulært molekyle, som koder for de 12S og 16S rRNA, 22 tRNA’er og 13 proteiner er essentielle for den mitokondriske respiratorisk kompleks [1] – [2]. De fleste humane celler indeholder hundredvis af kopier af mitokondrie-DNA (mtDNA) og næsten alle disse mtDNA kopier er identiske dvs. homoplasmiske ved fødslen [1] – [2]. Mutation sats i mtDNA er cirka 10 gange højere end nuklear genomisk DNA (nDNA) [1]. Til dato er der rapporteret klonale mtDNA mutationer i forskellige tumorer [3]. Der er ikke meget information om den tidsmæssige udvikling af disse mutationer og deres omfang i normal og unormal slimhinde udsat for tobaksrøg.

Lungekræft dræber mere end 1 million mennesker verden over med at ryge er den vigtigste risikofaktor [4] . I USA, var der over 215,020 tilfælde af lungekræft og en anslået død 161.840 i 2008 [4]. Trods betydelig forbedring i terapeutiske modaliteter, herunder kirurgi, platinbaseret kemoterapi og strålebehandling alene eller i kombination, den samlede 5-års overlevelse er kun 15% [4]. Firs-fem procent af lungekræft forekommer i tobak rygere [4]. Desuden berørte patienter forbliver på betydelig risiko for udvikling af anden primær tumor i hele deres levetid. Således udvikling af passende metoder til tidlig påvisning af sygdommen, overvågning og løbende evaluering af luftvejene hos patienter med primær lungekræft er af afgørende betydning.

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi mønster af mtDNA ændring (mutation og DNA-indhold) i luftvejs slimhinder biopsier opnået fra opfølgende patienter med primær lungekræft. Tilsvarende tumorer og normale lymfeknuder blev også undersøgt af disse patienter. Alle biopsier optrådte mistænkelig og unormal under autofluorescens bronkoskopi, men de var histologisk negativ. Men kortet af mtDNA ændringer i disse biopsier var slående og forudsat en unik indsigt i omfanget af mitokondriel dysfunktion og øget risiko for malignitet hos patienter, der fortsætter med at ryge.

Resultater

Mønster af mtDNA mutation i patienter

Figur 1 viser mønsteret af mtDNA mutationer i patient 1. Denne patient blev opereret to gange inden for et spænd på to år på begge lunger. Den første tumor (T1) blev fjernet kirurgisk i 2002 fra højre øvre lap efterfulgt af fjernelse af den anden tumor (T2) i 2004 fra den venstre nedre lap. Fem luftvejs mucosale biopsier blev udtaget fra den vigtigste carina (M1), højre nedre (M2 og M3) og venstre øvre lap (M4 og M5), der omgiver den primære tumor sites på begge lunger som afbildet. De mucosale biopsier blev taget under opfølgningen af ​​denne patient efter kirurgisk fjernelse af den anden tumor fra venstre nedre lap. Alle fem mucosale biopsier var histopatologisk uden tegn på dysplasi, og dog udviste en række 3-11 mtDNA mutationer (fig. 1). I alt 16 mtDNA mutationer blev påvist i slimhinden af ​​denne patient. Den første biopsi fra de vigtigste carina udstillet 3 mtDNA mutationer (M1, fig. 1A). Den anden biopsi udstillet 5 mutationer herunder 2 overlappende mutationer med M1 (

A2249C

,

A8341C

, matchede farve, fig. 1A-B). Den tredje biopsi udstillet 7 mtDNA mutationer, herunder 3 overlappende mutationer med M2 (

A3742C

,

G8836C

T15982G

, matchede farve, fig. 1B-C). Den fjerde biopsi husede 7 mtDNA mutationer, herunder overlappende mutationer med M3 (

A3742C

,

T3756C

,

G6035C

,

G8836C

T15402A

, matchede farve, fig. 1A-D), M2 (

A3742C

,

A8341C

G8836C

, matchede farve, fig. 2B og D) og M1 (

A8341C

, matchede farve, fig. 1A-D). Den biopsi taget ved siden af ​​tumor i venstre nedre lap udstillet 11 mtDNA mutationer, herunder overlappende mutationer med M1 (

A2249C

,

T2516C

A8341C

), M2 (

A2249C

,

A8341C

,

G8836C

T15982C

), M3 (

C4014A

,

G8836C

T15982G

) og M4 (

A8341C

G8836C

) biopsier (fig. 1A-E, matchede farve). Begge invasive tumorer (T1 og T2) udstillet 20 identiske mtDNA mutationer, herunder alle de 16 mutationer fundet i det omgivende fem normal slimhinde (fig. 1 E-F) (odds ratio 6,9 × 10

10:01). Tretten af ​​disse 20 (65%) mutationer var i kodende regioner (COI, COII, ATP6, ND1, ND4 og CYTB) og 7 (35%) forekom i ikke-kodende regioner (12SrRNA, 16SrRNA, tRNA-lysin, D-loop ) (fig. 1, F, bund rektangel). De yderligere 4 mutationer detekteret i tumorerne var repræsenteret i fig. 1E (Bund rektangel, sort, understreget). To (

G8836C

A8341C

) til tre mtDNA mutationer (

A2249C

,

A3742C

T15982G

) var til stede i 4/5 og 3/5 mucosa henholdsvis og i begge tumorer (fig. 1). Repræsentative histologiske mikrofotografier af slimhinden og tumor er vist i fig. 1A og 1F. Forskellige farvekoder svarer til et specifikt muteret mtDNA mønster viser den klonale spredning af mtDNA mutationen hele slimhinden og til sidst givet anledning til de genetisk beslægtede tumorer (Omgivet).

Patienten blev opereret to gange på 2002 og 2004 med fjernelse af tumorer fra højre øvre (T1) og venstre nedre lap (T2) hhv. Fem bronchoscopically unormale luftveje slimhinder biopsier blev opnået efter anden operation (T2) i denne patient fra vigtigste carina (M1), højre øvre lap (M2 og M3) og venstre nedre lap (M3 og M4) omgiver både tumorer som vist (Panel A -E). De mucosale biopsier udviste en række 3-11 mtDNA mutationer som repræsenteret i anden farve (panel A-E). Identiske mutationer er vist i den samme farve i forskellige biopsier og tumoren. En anden farvekode blev også anvendt til hver mucosa at angive den klonale progression af læsionerne på begge lungerne med akkumulerede mtDNA mutationer. Repræsentative histologisk mikrofotografi af slimhinden, og tumoren er blevet vist i panel A og F. Både tumorerne T1 og T2 udviste tyve identiske mtDNA mutationer (E-F, Bund rektangel), herunder alle de 16 mutationer udvises af de fem mucosale biopsier (Matched farve). De yderligere 4 mtDNA mutationer fundet i tumorerne er repræsenteret understreget i sort farve i den nederste rektangel (Panel E-F). To mtDNA mutationer (

G8836C

A8341C

) var til stede i 4/5 og 3 andre mutationer (

A2249C

,

A3742C

T15982G

) var til stede i 3/5 slimhinder biopsier. Tumorer er omringet at angive deres udvikling fra klonede slimhinder patches. T1: Tumor fra højre øvre lap; T2: Tumor fra venstre nedre lap; M:. Mucosa

Patienten blev opereret 2005 for kirurgisk fjernelse af tumor fra højre øverste lap. Fem bronchoscopically unormale luftveje slimhinder biopsier blev opnået fra vigtigste carina (M1), højre nedre lap (M2 og M3) og højre øvre lap (M3 og M4) omgiver tumorerne som afbildet (panel A-E). De mucosale biopsier udviste en række 2-5 mtDNA mutationer som repræsenteret i anden farve (panel A-E). Identiske mutationer er vist i samme farve i forskellige biopsier og tumoren. En anden farvekode blev også anvendt til hver mucosa at angive den klonale progression af læsionerne med akkumulerede mtDNA mutationer. Repræsentative histologisk mikrofotografi af tumoren og normal slimhinde er vist i panel A og D. tumoren udviste 9 mtDNA mutationer (repræsenteret i Bottom rektangel), herunder alle de 8 mutationer udvises af de fem mucosale biopsier (Matched farve). En yderligere mtDNA mutation (

T7001C

) påvist i tumoren er understreget i sort i bunden rektangel. Tumor blev omringet at angive dens udvikling fra de klonede slimhinder patches. M:. Mucosa

I patient 2 blev fem slimhinder biopsier opnået fra de vigtigste carina (M1), højre nedre lap (M2 og M3) og højre øvre lap (M3 og M4), som omgiver den primære tumor i højre lunge, som vist i figur 2. Alle de 5 læsioner var histopatologisk normale som set i patient 1 men udviste en række 2-8 mtDNA mutationer. Den første læsion udstillede 2 mutationer hvor som den anden udviste 3 med en identisk mutation deles med M1 (

A10995C

, fig. 2A-B, matchede farve). Den tredje læsion (M3) udstillet 3 mtDNA mutationer med en overlappende mutation med M2 (

A14917C

) og M1 (

G8836C

) (fig. 2A-C, matchede farve). I den fjerde læsion (M4), blev påvist 3 mutationer med en overlappende mutation (

G8836C

) med M3 og M1 (fig. 2A-D, matchede farve). Den femte slimhinde læsion (M5) udstillet 5 mutationer, herunder overlappende mutationer af M4 (

A3984C

G8836C

), M3 (

A6831C

,

G8836C

og

A14917C

), M2 (A14917C) og M1 (

G8836C

) (fig. 2A-E, matchede farve). Den primære tumor resektion fra højre øverste lap af denne patient udviste 9 mtDNA mutationer, herunder alle de 8 mutationer fundet i de omkringliggende 5 tilsyneladende normale mucosa prøver. Alle disse mutationer (9/9) var i mitokondrie kodende områder (ND1, oplysninger om oprindelseslande, ATP6, ND4, ND5 og CYTB) i mtdna (fig. 2E, bund rektangel). Den yderligere mutation (

T7001C

) detekteret i tumoren er vist i figur 2E (nederst til højre rektangel, sort, understreget). One mtDNA-mutation (

G8836C

) var til stede i 4/5 og en anden mutation (A14917C) var til stede i 3/5 mucosal vævsprøver (fig. 2). Begge disse mutationer blev også påvist i den tilsvarende tumor (fig. 2E). Repræsentative histologiske mikrofotografier af slimhinden, og tumoren er vist i fig. 2A og E). Forskellige farvekoder svarer til et specifikt muteret mtDNA mønster viser den klonale spredning af mtDNA mutation i hele slimhinden og til sidst givet anledning til genetisk beslægtet tumor (Omsluttet). Fire mtDNA mutationer (

G8836C

,

T3756C

,

A3984C

A7251C

) var identiske blandt patienter 1 og 2 (fig. 1-2) .

Patient 3 var en ikke-ryger med en bronchoalveolær carcinom og udviste kun 2 mtDNA mutationer i tumoren (tabel 1). Ingen mutation blev påvist i den normale slimhinde. En margin med metaplasi fra denne patient også viste ingen mtDNA-mutation (tabel 1). Disse resultater antyder en grundlæggende forskel i felt cancerization og omfanget af klonale patches blandt en ikke-ryger tumor. Vi sekventeret 8 andre patienter til mtDNA-mutation og fundet en række 1-9 mutationer i de primære tumorer sammenlignet med kontrollen, hvoraf de fleste var fra de kodende regioner af mtDNA (tabel 2). Andre end somatiske mtDNA mutationer, vi også opdaget nogle kønsceller mtDNA sekvens varianter i tumorerne og tilsvarende slimhinde biopsier af alle patienter (tabel 3). Vejviser

Ændring af mtDNA indhold i lungekræftpatienter

Vi udførte kvantitativ real-time PCR for at bestemme mtDNA indhold i patienternes mucosa, svarende tumorer, og ikke neoplastiske lymfeknuder. Med kun en enkelt undtagelse i en biopsi (Patient 1, M1) mtDNA indhold var signifikant højere (P 0,001) i lungekræft og alle de histologisk normalt mucosale biopsier sammenlignet med kontrollen lymfeknude (fig. 3). Dette var endda sandt i slimhinden og metaplastisk margen identificeret i patient 3, ikke-rygeren (fig. 4). MtDNA indhold blev forøget uden en tilsvarende mtDNA-mutation (Fig. 4). Øget indhold mtDNA er således en funktion i omfattende slimhinder felter fra patienter med lungecancer både rygning og ikke-ryger.

mtDNA indhold blev målt ved multiplex real-time PCR ved nukleare kodet β-actin og mitokondrier kodet COI gen . Et forhold på COI /β-actin svarer til folden forskel i forhold til kontrol. MtDNA indhold steg signifikant (P 0,001) i de mucosale biopsier og tilsvarende tumorer sammenlignet med det normale kontrol i både patienter som angivet. N: Normal lymfekirtel; M: Slimhinde; T: Tumor. * P-værdi. 0,05 sammenlignet med normal lymfeknude

mtDNA indhold steg signifikant (P 0,05) i slimhinden (M), tilstødende normale (NT) og i metaplastisk margin (MT) forhold til normal lymfeknude anvendt som kontrol.

diskussion

mitokondrie-DNA-mutationer er hyppige i forskellige tumortyper [3], og påvist i præneoplastiske læsioner hvilket indikerer deres forekomst på tidlige stadier af flertrins tumorprogression [5]. Påvisning af mtDNA-mutation er lettere og mere pålidelige til kerne-DNA på grund af deres høje kopital i cancerceller [6] – [7]. Derfor gennemgangen mtDNA mutationer i et lille antal celler på forskellige stadier af tumorprogression er mulig. For at kunne bruge mtDNA-mutation som en objektiv værktøj til påvisning af klonale cellepopulationer, er nødvendigt sekventering af hele mitochondriegenom og skal gøres sammen med en passende ikke-neoplastisk kontrol på grund af den meget polymorfe karakter [7] mtDNA. I den foreliggende undersøgelse amplifikation af betydelig mængde mtDNA fra meget små mucosale biopsier, tumor og tilsvarende normale væv muligt for os at scanne hele mitokondrie-genomet. Dette blev let opnås på Affymetrix high throughput Mitochip v2.0 sekventering platform tidligere vist sig at være et pålideligt redskab til påvisning af mtDNA-mutation [5], [8]. Denne seneste version af Mitochip (Sammenlignet med Mitochip v1.0) har ikke kun en høj følsomhed for mutationsdetektering spænder over hele mitochondriegenom men også i stand til at bestemme heteroplasmic mtDNA mutation [8] – [9]. Den observerede mutation kan også verificeres ved traditionel sekventering. Dog kan Mitochip v2.0 ikke registrere små indsættelse /sletning, da det er designet primært til at opdage mtDNA-mutation. De påviste i den foreliggende undersøgelse mutationer var somatiske eller kimcellelinje karakter og bekræftet som ikke skyldes nogen haplotypisk variation [5], [8] – [9]. Således er alle de de novo mutationer detekteres og rapporteres i denne undersøgelse er forbundet med tumoren fænotype.

I patient 1 blev små opfølgning biopsier taget fra områder af luftvejene slimhinde der udkom unormal under Autofluorescens-bronkoskopi. Selv om alle de biopsier var histopatologisk negative og uden dysplastiske forandringer, de udstillede flere mtDNA mutationer hvoraf nogle blev delt på tværs af store spor luftvejene epitel. Disse resultater viser den klonale spredning af multiple mtDNA mutationer i hele den respiratoriske slimhinde. Klonal spredning af p53 mutation og mikrosatellitændringer (LOH og MA) ved multipel foci i normalt udseende bronkieepitel er blevet rapporteret tidligere [10] – [12]. I den foreliggende undersøgelse, dramatisk udvidelse af mutant bronchieepithelceller kloner var spores gennem mtDNA mutation med stor præcision og i en saglig måde ved sekventering af hele mitokondrie genom i hver prøve.

Det er sandsynligt, at biopsier indeholdt heterogene patches af celler med klonale ændringer erhvervet af tilfældig mitokondriske genetisk drift [7]. Som i patient 1, mest af klonerne deles et antal identiske mtDNA mutationer sammen med yderligere mutationer, der er nødvendige for den klonale ekspansion (fig. 5). The fittest kloner huser mere fordelagtige mtDNA /nDNA mutationer skred gennem slimhinden og til sidst gav anledning til to tilsyneladende uafhængige primære tumorer, der er alligevel sikkert forbundet af identiske mtDNA mutationer [7], [13]. Påvisning af alle slimhinde mtDNA mutationer i både tumorer resektion inden for en spændvidde på 2 år støtter kraftigt deres klonal oprindelse. Desuden har vi også vist, at de to separate tumorer fra den modsatte lunger udviste multiple identiske mtDNA mutationer; odds for denne forekomst tilfældigt er forsvindende lav. Den første tumor formentlig udviklet sig fra en af ​​de mere dominerende kloner spredt på højre lunge efter at erhverve de nødvendige mtDNA /nDNA ændringer tilstrækkelige til at fremme tumorigenese. Den anden tumor sandsynligvis udviklet på samme måde på venstre lunge, men erhvervet nDNA mutationsmønstre hits flere måneder senere, eller på anden måde kunne det muligvis være en pulmonal metastaser. Dataene fra patient 2 understøtter også den omfattende klonal spredning af mtDNA mutationer og efterfølgende tumor udvikling efter at erhverve tilstrækkelig mtDNA og /eller nDNA ændringer. En høj opløsning genom bred analyse af disse biopsier og tilsvarende tumorer afslørede klonal ændring af en række centrale nDNA kodede gener hos disse patienter (Upubliceret observation) yderligere støtte dette begreb. Men på grund af manglende rådighed, kunne vi ikke undersøge mønsteret af mtDNA ændring spektrum i et relativt stort antal patienter.

Mulig klonal udviklingen i lungetumorer er blevet afbildet. Hver slimhinde biopsi (i cirkel, M1-M5) delte nogle identiske mtDNA mutationer (Matchet farve) sammen med yderligere mutationer i den heterogene slimhinde feltet. The fittest kloner opstod i de primære tumorer (T1-T2) med mere selektive mtDNA mutationer (I alt 20 mtDNA mutationer, 16 blev delt mellem M1-M5 som i figur 1).

Tilstedeværelsen af hyppig kimcelletransformanter mtDNA sekvensvarianter blev foreslået som en indikator for en høj modtagelighed genetisk baggrund, som kunne lette samtidig somatisk mutation i mtDNA og nDNA [14]. Påvisning af klonal kønsceller sekvens varianter og samtidige somatiske mtDNA mutationer i tumorer og slimhinde af patienter de lungekræftpatienter går stærkt denne opfattelse.

Patogene mtDNA mutationer kan indikere for deres funktionelle bidrag i progression af tumorer. Blandt mtDNA mutationer observeret hos disse patienter, er den kodning G8836C (ATP6) mutation nylig rapporteret hos patienter med Leber Arvelig synsnerveatrofi (LHON) -lignende syndrom og skjoldbruskkirtlen tumorer [15] – [16]. Den interspecies bevaring af dette nukleotid er høj, og denne mutation er blevet forudsagt at være patogene [15]. Især blev denne mtDNA mutation påvist i 8/10 slimhinder biopsier og alle 3 tumorer undersøges fra både patienter, der støtter en funktionel bidrag i tumorigenese. Men yderligere funktionelle analyse er nødvendig for at drage en mere definitiv konklusion. MtDNA mutation ved identisk nukleotidposition mellem forskellige lunge og nyre kræftpatienter blev rapporteret tidligere [16]. I lyset af en patogen /bidrager mtDNA mutation, en specifik mtDNA-mutation syntes at have været valgt i forskellige tumortyper. Vi gjorde lignende bemærkning i nærværende undersøgelse og dermed forekomsten af ​​den patogene G8836C og andre identiske mtDNA mutationer observeret mellem forskellige lungecancerpatienter er usandsynligt at skyldes prøve kontaminering. Især den G8836C patogene mtDNA-mutation påvises i LHON og thyreoideacancer [15] – [16] og ofte i vores undersøgelse indikerer, om en funktionel rolle i lungekræft progression

De fleste af disse mutationer blev fundet i kodningen. områder af mtDNA hvilket potentielt kan føre til en afbrydelse af det respiratoriske komplekse og resultere i en stigning i reaktive oxygenarter (ROS). Nylige undersøgelser har vist, at mtDNA mutationer føre til en stigning i ROS og fremme tumorcellevækst, proliferation og metastase [17] – [20]. En undersøgelse har vist en stigning i mtDNA kopital i lungefibroblaster som en tidlig begivenhed i afhængighed af oxidativ stress [21]. For nylig blev en stigning i mtDNA indhold identificeret med aldring og rygning associeret lunge-væv og primær hoved og hals skællede celle karcinomer [22] – [23]. Histologisk negative mucosale biopsier samt tumorer i begge patienterne udviser signifikant forhøjet niveau af mtDNA indhold. Det ser således ud, at med udviklingen af ​​homoplasmiske mtDNA mutation og klonal spredning, mtDNA indhold også stiger. Notatet nogle mutationer (herunder

G8836C

) var identiske i både patienter, der var regelmæssige rygere, hvilket tyder på effekten af ​​fælles mål fra tobak kræftfremkaldende stoffer på mtDNA. Den høje frekvens af mtDNA mutationer blandt rygere tyder også en nøglerolle for tidlige mitochondriale genetiske ændringer i progressionen af ​​deres tumorer.

I den foreliggende undersøgelse, klonal progression af histologisk normalt udseende respiratorisk slimhinde i tumoren var spores gennem mtDNA mutationer. Dette er den mest definitive undersøgelse for at påvise, at de 2 tumorer i de modstående steder i en patient (patient 1) er klonbeslægtede. Men vi kunne ikke undersøge mere opfølgende patienter på grund af mangel på bio-prøver. Dokumentation af disse omfattende klonpopulationer med mtDNA mutationer belyser udfordringerne i tidlig påvisning tilgange. Desuden målrette disse mtDNA mutationer kan være nyttige baseret på molekylær påvisning i sputum og blod DNA i kemoforebyggelse strategier og nye biologiske terapeutika. Yderligere funktionel analyse af de fælles mtDNA mutationer vil give os mulighed for bedre at forstå deres særlige rolle i cancer progression og kemoresistens.

Materialer og metoder

Patienters historie og lunge prøver

Tre opfølgende lungekræft patienter blev undersøgt for mtDNA-mutation med underskrevet informeret samtykke i en Johns Hopkins IRB godkendt protokol. Patient 1 var en 75-årig kvinde, der gennemgik en højre øvre lobectomy i 2002 for et fase IIB dårligt differentieret planocellulært karcinom (T3N0MX). I 2004 gennemgik hun en venstre nedre lobectomy for en anden fase IIB (T2N0MX) pladecellekarcinom. Patient 2 var en 58-årig mand, der i 2005 gennemgik en højre øvre lobectomy for en fase IA (T1N0MX) moderat differentieret planocellulært karcinom. Begge patienter var regelmæssige rygere i mere end 10 år. Patient 3 var en 48 år gammel kvinde, der gennemgik en højre øvre lobectomy for en fase IA (T1N0MX) bronchioloalveolar carcinom. Denne patient var en ikke-ryger. Under opfølgning blev luftvejs slimhinder biopsier taget fra områder mistænkelige for mild til moderat til svær dysplasi eller carcinoma in situ (CIS) baseret på Auto-fluorescens-Bronkoskopi (R.Y. og J.B.). Alle biopsiprøver blev taget på samme tid. Biopsier blev histologisk evalueret af en lunge patolog (W.H.W). De kirurgisk resektion lungetumorer blev også opnået fra hver patient. Som en kontrol, matchet normal lymfeknude fri for tumor blev anvendt i hvert tilfælde. Derudover har vi også sekventeret matchede normale og tumorvæv fra 8 andre lungekræftpatienter (tabel 4).

Mitokondriel hele genomet forstærkning og sekventering

Genomisk DNA blev ekstraheret i henhold til vores standardprotokol fra Mikrodissekterede tumorvæv og andre prøver [5]. Vi amplificeret hele mitokondrie genomisk DNA fra 10 ng genomisk DNA-template under anvendelse Repli-g mitokondrie-DNA-amplifikation kit ifølge producentens protokol som beskrevet tidligere [8]. Det amplificerede DNA blev derefter oprenset ved anvendelse af DNA MINIAMP Cleaning kit (Qiagen, Valencia). Vi undersøgte renheden af ​​det amplificerede mtDNA og kontaminering kerne-DNA ved PCR-analyse under anvendelse af primer specifik for mitokondrier kodede coxi /COXII og nuklear kodet β-actin. Fire til fem hundrede nanogram af renset mtDNA blev brugt til sekventering på Affymetrix MitochipV2.0 platform [5], [8].

Mitochip v2.0 sekventering array analyse

Vi udførte fragmentering, mærkning og Chip hybridisering af mtdna som pr Affymetrix protokol med passende kontroller som beskrevet tidligere [5], [8]. Dataanalyse blev udført ved hjælp af Affymetrix GSEQ software og den reviderede Cambridge reference Sequence (RCR’er) blev anvendt som reference sekvens [24]. Den MitoAnalyzer software blev også anvendt til at kontrollere de mtDNA mutationer ved forskellige nukleotidpositioner som tidligere beskrevet [5], [8] .Somatic mutationer blev identificeret som baseparændringer i mtDNA sammenlignet med normale mtDNA sekvens fundet i lymfeknuder fri for tumor. Kimcellelinje mutationer blev identificeret som basepar ændringer til stede i de normale lymfocytter samt tumorvæv og /eller margin prøver sammenlignet med RCR’er [14]. En kønsceller sekvens variant blev udpeget som roman når fraværende i den menneskelige mitokondrie database og andre relevante undersøgelser i de samme haplogruppe [14], [25]. Sekvens varianter tidligere rapporteret i forskellige sygdomme, herunder kræft er udpeget som patogene [14], [25].

Kvantitativ real-time PCR

For at undersøge mtDNA indhold, vi brugte 7900HT Sequence Detection-system (Applied Biosystems, Foster City, CA) at amplificere kerne-DNA (nDNA) kodet β-Actin og mtDNA kodet cytochrom c oxidase i (COI) ved anvendelse af genomisk DNA-template som beskrevet tidligere [26].

Statistisk analyse

Students

t

-test blev udført for at bestemme den statistiske signifikans. P-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle P-værdier genereres var tosidet.

Odds forholdet

Oddsene for 20 tilfældige identiske mtDNA mutationer forekommer tilfældigt i to separate tumorer lokaliseret i de modsatte lunger den samme patient blev beregnet som [ ,,,0],(genom størrelse) × (mutationer)] × [(genom størrelse) × (mutationer)] dvs. [16,499:1 × 20] × [16,499:1 × 20] = 6,9 × 10

10:01 [27].