PLoS ONE: Angivelse af stress respons oncoproteinet LEDGF /p75 i Human Cancer: A Study of 21 Tumor Types

Abstrakt

oxidativ stress-moduleret signalveje har været impliceret i carcinogenese og terapi modstand. Linsen epitel vækstfaktor p75 (LEDGF /p75) er en transskription co-aktivator, der fremmer resistens over for stress-induceret celledød. Dette protein er blevet impliceret i inflammatoriske og autoimmune tilstande, HIV-AIDS og cancer. Selvom LEDGF /p75 fremstår som en stress overlevelse oncoprotein, der er knappe oplysninger om sit udtryk i humane tumorer. Den foreliggende undersøgelse blev udført for at vurdere dets ekspression i en omfattende panel af humane cancere. Transcript ekspression blev undersøgt i Oncomine cancer genet microarray database og i en TissueScan Cancer Survey Panel kvantitativ polymerasekædereaktion (Q-PCR) array. Proteinekspression blev vurderet ved immunhistokemi (IHC) i cancer væv microarrays (TMA’er) indeholdende 1735 væv repræsenterer enkelt eller kopierer kerner fra 1220 individuelle sager (985 tumor og 235 normale væv). Der blev analyseret i alt 21 store typer cancer. Analyse af LEDGF /p75 udskrift udtryk i Oncomine datasæt viste betydelig opregulering (tumor vs. normal) i 15 ud af 17 tumortyper. Den TissueScan Cancer Q-PCR vifte afslørede signifikant forhøjede LEDGF /p75 udskrift udtryk i prostata, colon, thyreoidea, og brystkræft. IHC-analyse af TMA’er afslørede betydelige øgede niveauer af LEDGF /p75 protein i prostata, colon, thyreoidea, lever og uterin tumorer, i forhold til tilsvarende normale væv. Forhøjet afskrift eller protein udtryk for LEDGF /p75 blev observeret i flere tumortyper. Disse resultater yderligere etablere LEDGF /p75 som en kræft-relateret protein, og give en begrundelse for igangværende undersøgelser med henblik på at forstå den kliniske betydning af dets ekspression i specifikke humane kræftformer

Henvisning:. Basu A, Rojas H, Banerjee H, Cabrera IB, Perez KY, De León M, et al. (2012) Angivelse af stress respons oncoproteinet LEDGF /p75 i Human Cancer: En undersøgelse af 21 tumortyper. PLoS ONE 7 (1): e30132. doi: 10,1371 /journal.pone.0030132

Redaktør: John R. Battista, Louisiana State University og A M College, USA

Modtaget: 10 juni, 2011; Accepteret: 9. december 2011; Udgivet: januar 19, 2012 |

Copyright: © 2012 Basu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health (NIH) National center for Minority Health og sundhed Forskelle [NIH-NCMHD 5P20MD001632 (MDL, CAC)]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

en voksende mængde af beviser understøtter den centrale hypotese, at en udvidet tilstand af cellulær oxidativ stress (Ascos) er en væsentlig medvirkende faktor til carcinogenese [1], [2]. Mulige udløser af Ascos omfatter livsstil og miljømæssige-relaterede faktorer som kost, infektioner, rygning, alkohol og stoffer [3]. Ascos forårsager skade på DNA, protein og lipider samt aktivering af stress transkriptionsfaktorer, der fører til aktivering af stress, antioxidant, inflammatorisk, og pro-overlevelse veje, der bidrager til malign transformation, cellecyklus deregulering, modstandsdygtighed over for celledød og terapi, invasion, angiogenese og metastase [1], [2].

LEDGF /p75 er en stressreaktion protein, der fremmer celleoverlevelse i nærvær af miljømæssige stressfaktorer, der inducerer Ascos, såsom kemoterapi, stråling , varme og serumudsultning [4] – [7]. LEDGF /p75 er også kendt som transskription co-aktivator p75 [8], PC4 og SFRS1 interagerende protein (PSIP1) [9], og tætte fine spættede autoantigen på 70 kD (DFS70) [10]. Det er blevet impliceret i inflammation, autoimmunitet, HIV-1-replikation, og cancer [10] – [17]. De stress overlevelse egenskaber LEDGF /p75 synes at være knyttet til dens evne til at binde specifikke transkriptionsfaktorer og lette transaktivering af stress, inflammatorisk, antioxidant, og cancerassocierede gener [18] – [23]. LEDGF /p75 (530 aminosyrer) og dens mindre karakteriserede alternativ splejsningsvariant, LEDGF /P52 (333 aminosyrer), er afledt af LEDGF /PSIP1 genet [8], [9], [24]. LEDGF /P52 svarer til N-terminale aminosyrer 1-325 af LEDGF /p75, og indeholder et yderligere intron-afledte 8 aminosyre hale [25]. Vores gruppe rapporterede tidligere, at LEDGF /p75 opreguleres i kræftceller sammenlignet med normale celler, og at LEDGF /P52 udtrykkes ved relativt lave niveauer i kræftceller, inducerer apoptose når ektopisk udtrykt, og antagoniserer de pro-overlevelse funktioner LEDGF /p75 [7], [16], [25].

Flere linjer af beviser understøtter den seneste fremkomsten af ​​LEDGF /p75 som oncoprotein i human cancer. For eksempel LEDGF /p75 er et mål af kromosomale translokationer i leukæmier, hvilket resulterer i LEDGF /NUP98 fusionsproteiner med forøget aktivitet [23], [26] – [29]. Dets mRNA-ekspression blev fundet at være opreguleret i blaster fra kemoterapi-resistent akutte myelogenic leukæmi patienter, og dets ektopisk overekspression beskyttet leukæmiceller mod lægemiddel-induceret celledød [30]. LEDGF /p75 bindsler Menin-blandet afstamning leukæmi (MLL) transskription faktor komplekse at kromatin at aktivere leukemogenesis [23]. Vores gruppe rapporterede tidligere, at LEDGF /p75 er et autoantigen i prostatacancer (PSA), med forhøjet proteinekspression i prostata tumorvæv [16]. Vi bemærkede også, at dets ektopisk overekspression fremmet cellulær overlevelse mod stress-induceret død i HepG2 lever tumorceller [7], og svækket docetaxel-induceret lysosomale celledød i PCA celler [31]. Daugaard et al. [17] rapporterede forhøjet LEDGF /p75 udskrift udtryk i human og blære kræft, og at dens ektopisk overekspression i brystkræftceller beskyttet mod narkotika-induceret lysosomale celledød og øget tumorigent potentiale af kræftceller i murine modeller. For nylig blev forhøjede gonadotropiner vist at forbedre LEDGF /p75-afhængig aktivering af VEGF-C-ekspression, forøge lymphangiogenese og angiogenese af ovarietumorer [32].

Selv om udskrift udtryk for LEDGF /p75 blev rapporteret at være opreguleret i leukæmi, bryst- og blære kræft [17], [30], er udført immunhistokemiske (IHC) ekspression af proteinet i humane tumorvæv kun til PCA [16]. Den nye rolle LEDGF /p75 som en stress overlevelse oncoprotein førte os til at foretage en omfattende analyse af dens mRNA og protein-ekspression i 21 større humane tumor typer, hjælp kræft gen microarray databaser, TissueScan Cancer Q-PCR-array, og IHC-analyse af væv microarrays (TMAS). Denne undersøgelse dokumenterer, at LEDGF /p75 selektivt opreguleres i humane kræftformer.

Materialer og metoder

Bioinformatik Analyse af Oncomine Cancer Gene Microarray Database

Til sammenligning af LEDGF mRNA-ekspression mellem tumor og normalt væv, valgte vi datasæt fra Oncomine database (kompendier Biosciences; Ann Arbor, MI, USA; www.oncomine.org). Disse datasæt, der indeholder gen mikroarrays af kræft og tilsvarende sygdomsfrie normale og /eller normale tilstødende væv, forudsat fold-change data for genekspression (tumor vs normal), med p-værdier beregnet ved t-test. Det skal nævnes, at de undersøgte datasæt ikke var specifikke for LEDGF /p75 men billede genekspression data til LEDGF /PSIP1 gen, hvilket giver anledning til både p75 og P52 splejsningsvarianter. I alt 81 datasæt blev undersøgt for LEDGF /PSIP1 transkript ekspression for følgende kræftformer: blære (2 datasæt), bryst (9 datasæt), cervix (2 datasæt), tyktarm og endetarm (3 datasæt), spiserør (3 datasæt), nyre (6 datasæt), hoved og hals (8 datasæt), lever (2 datasæt), lunge (9 datasæt), lymfom (3 datasæt), ovarie (6 datasæt), pancreas (6 datasæt), prostata (13 datasæt), spytkirtel (1 datasæt), hud (5 datasæt), mave (2 datasæt) og livmoderen (1 datasæt). Ingen microarray data var tilgængelige for LEDGF /PSIP1 udskrift udtryk i kræft i galdeblære, tyndtarmen, og skjoldbruskkirtel.

Menneskelig ‘TissueScan Cancer Survey Panel’ Q-PCR Array

Vi brugte menneske ‘TissueScan Cancer Survey Panel 96-i’ Q-PCR array (CSRT-101, OriGene Technologies Inc., Rockville, MD, USA) til intern analyse af LEDGF /p75 mRNA-ekspression i 96 væv, der dækker 8 store menneskelige kræftformer ( bryst, colon, nyre, lever, lunge, ovarie, prostata, og skjoldbruskkirtel). Denne matrix bestod af første-streng komplementær DNA (cDNA) fra 9 enkelttilfælde af hver cancertype og 3 tilfælde af tilsvarende normale tilstødende væv. Producenten forudsat begrænsede patient klinisk-patologisk oplysninger (alder, køn, tumor stadie, pTNM etape), uden patientidentifikatorer.

Q-PCR blev udført i 96-brønds PCR array-plader (OriGene) ved hjælp af MyiQ termiske cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) med primere specifikke for LEDGF /p75 splejsningsvariant (fremadrettet 5′-TGCTTTTCCAGACATGGTTGT-3 ‘og revers 5′-CCCACAAACAGTGAAAAGACAG-3′), og iQ SYBR Green Supermix (Bio- Rad). Kort fortalt blev 30 pi af PCR-blanding, som omfattede 15 pi 2 x Master mix, 13 pi dobbelt destilleret vand, og 1 pi af hver af forward og reverse primere (10 pmol /pi), tilsat til hver af de 96 brønde i PCR array-plader. PCR-amplifikation blev udført ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minut. mRNA-ekspression blev normaliseret ved hjælp af ekspressionen af ​​housekeeping gen human beta-actin, hvis primere (fremadrettet 5’-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3 ‘og omvendt 5′-AGGTCCAGACGCAGGAT GGCATG-3’) blev leveret i TissueScan Cancer Q-PCR-array kit på en koncentration på 10 pmol /pl. Til analyse af data blev ΔΔCt metode. Fold ændringer blev beregnet som forskellen i genekspression mellem tumorer og tilsvarende normale tilstødende kontroller.

RNA-interferens-medieret Knockdown af LEDGF /p75

PC-3 prostatacancerceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection og dyrkes som anbefalet af leverandøren i en fugtig inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C. Forbigående knockdown af LEDGF /p75 i PC-3-celler blev udført under anvendelse af Amaxa nucleofection metoden (Amaxa, Lonza) som beskrevet tidligere [21]. LEDGF /p75 siRNA (siLEDGF /p75) og scrambled siRNA duplex (siSD, negativ kontrol) blev syntetiseret af Integrated DNA Technologies (IDT). Den siLEDGF /p75-sekvensen svarede til nucleotiderne 1340-1360 (5’AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 ‘) i forhold til det første nukleotid i startkodonen af ​​LEDGF /p75 åben læseramme [21]. Denne sekvens svarer til en region i C-terminalen af ​​LEDGF /p75 ikke deles af LEDGF /P52. Rækkefølgen for siSD var 5’GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 ‘[21]

Antistoffer og immunblotting

Følgende antistoffer blev anvendt:. Mus monoklonale anti-β-actin (Sigma-Aldrich), og anti-LEDGF (1:1000, BD Biosciences); kanin polyklonale anti-LEDGF /p75 (1:1000, Novus Biologicals); anti-LEDGF /p75 (1:1000, Bethyl); og peberrodsperoxidase (HRP) -mærket sekundært IgG-antistoffer (Zymed). Vi brugte også en LEDGF /p75-specifikt kanin polyklonale antistof, der blev udviklet på W. M. Keck Autoimmune Disease Center of The Scripps Research Institute (La Jolla, CA, USA). Denne kanin-antistof, der oprindeligt betegnet anti-DFS /LEDGFp75 # 5087-antistof (i det følgende benævnt Scripps-Ab5087), blev rejst mod et rekombinant, trunkeret DFS70 protein genereret fra en partiel cDNA-klon, pDFS6.1, der kodede for C-terminal region LEDGF /p75 [10]. For at identificere et antistof, der er specifikt kun for LEDGF /p75 splejsningsvariant undersøgte vi reaktiviteten af ​​alle de ovennævnte kommercielle og ikke-kommercielle LEDGF antistoffer ved immunoblotting hjælp cellelysater fra PC-3 celler med siSD og siLEDGF /p75.

Immunoblotting blev udført i det væsentlige som tidligere [21] beskrevne. Kort beskrevet totale proteiner fra PC3 celler med siSD og siLEDGF /p75 blev separeret ved SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%, Invitrogen), efterfulgt af overførsel til polyvinyldifluorid (PVDF) membraner (Millipore). Membraner blev blokeret med 5% tørmælk opløsning i TBS-T-buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,1% Tween 20) i 1 time og undersøgt med primære antistoffer. Efter adskillige vaske med TBS-T, blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer i 30 minutter og derefter vasket igen med TBS-T. Protein bånd blev påvist ved forøget kemiluminescens (Amersham).

immunhistokemisk analyse af kræftvæv Microarrays

Menneskelige cancer væv microarrays (TMAS), kommercielt tilgængelige fra National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA , USA), IMGENEX Corp. (San Diego, CA, USA) og US Biomax Inc. (Rockville, MD, USA), blev anvendt til IHC-analyse af LEDGF /p75. Flere forskellige TMA’er blev anvendt til at øge antallet af tumor vævstyper og størrelse (tabel 1). Kort fortalt købte vi NDRI omfattende pan-cancer TMA’er indeholder dublerede kerner af 642 unikke sager (522 tumorvæv af 20 store tumor typer og 120 sygdomsfrie normale og /eller normale tilstødende prøver) i en 5 slide sæt (TS-1, TS -2, TS-3, TS-4 og TMA5). Hver af pan-cancer TMA’er IMH-326, IMH-327 og IMH-328 (IMGENEX Corp), indeholdt 59 prøver af forskellige tumortyper, mens TMA’er IMH-336, IMH-337 og IMH-338 (IMGENEX Corp.) indeholdt tilsvarende 59 matchede normale tilstødende væv.

Vi brugte også TMA IMH-303 (IMGENEX Corp.), som indeholder 40 PCA væv og 9 matchede normale tilstødende væv. Otte ekstra TMAs fra US Biomax blev anvendt, som hver indeholder multiple vævsprøver af en enkelt tumortype (bryst, colon, nyre, lunge, lever, bugspytkirtel, prostata, skjoldbruskkirtlen) samt tilsvarende sygdomsfri normal kontrol og /eller normal tilstødende væv. Producenterne af disse TMA’er forudsat begrænsede grundlæggende klinisk-patologisk oplysninger (alder, køn, tumor stadie i nogle tilfælde), der svarer til de væv kerner, uden patientens identifikatorer. Der forelå ingen oplysninger om patientens race eller etnisk oprindelse, neo-adjuverende behandling, kirurgisk teknik, årgang kirurgi, institutioner, der indsamlede væv, antal institutioner, opfølgning rutiner, og væv håndtering teknikker. Den begrænsede patient opfølgningsdata forbundet med TMAs forhindrede enhver Kaplan-Meier overlevelsesanalyse.

TMAs blev farvet ved anvendelse af en Biogene i6000 auto-farvningsværktøjet (Biogenex Corporation, Fremont, CA, USA) som tidligere beskrevet [16] , [33]. Kort fortalt blev paraffinindlejrede vævssnit i TMA lysbilleder afparaffiniseret og objektglassene blev nedsænket i Citra-Plus antigen-genvinding opløsning (Biogenex Corp.). Antigen genfinding blev udført ved mikrobølgeopvarmning objektglassene i 2 minutter ved 100% effekt efterfulgt af 10 minutter ved 20% kraft. Objektglas blev derefter afkølet i antigenet hentning opløsning i 20 minutter. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset ved behandling med 3% hydrogenperoxid i 10% methanol, og Power Block © universel blokerende reagens (Biogenex Corp.) blev anvendt til at blokere ikke-specifik proteinbinding.

TMA Objektglassene blev inkuberet natten over med Scripps-Ab5087 anti-LEDGF /p75 antistof [16], efterfulgt af 3 vaske i PBS. Objektglas blev derefter inkuberet med Multi-link © biotinyleret sekundært antistof (Biogenex Corp.) i 20 minutter, efterfulgt af inkubation med streptavidin-koblet peroxidase supersensitive Label © (Biogenex Corp.) i 20 min. Immunfarvning blev påvist ved peroxidase aktivering af 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) chromagen (Biocare Medical, Concord, CA, USA). TMA’erne blev modfarvet let med hematoxylin (Sigma, St. Louis, MO, USA) og monteret med Permount (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). For negativ kontrol det primære antistof blev udeladt og erstattet med kanin præimmun-serum. Vævssnit blev undersøgt under et Olympus BX50 mikroskop, og billeder blev erhvervet ved hjælp af en digital Spot RT3 ™ kamera (Diagnostiske Instrumenter, Sterling Heights, MI, USA). Immunofarvet TMA’er blev scoret blindt for LEDGF /p75 immunoreaktivitet af en bestyrelse certificeret patolog. En 4-tier pointsystem (0 = negativ, 1 = svag, 2 = moderat, 3 = stærk) blev anvendt til at evaluere farvningsintensitet. Væv med snesevis af 0-1 blev anset for at have lav intensitet farvning, mens væv med snesevis af 2-3 blev anset for at have høj intensitet farvning. Vævsprøver, der viste dårlig kvalitet blev udelukket fra analyserne. Disse undersøgelser blev udført under godkendelse fra Institutional Review Board.

Statistisk analyse

t-test blev anvendt til at vurdere betydningen af ​​ændringen i mRNA-ekspression mellem tumor og normal tilstødende kontrol prøver i TissueScan Cancer Q-PCR-array. Statistisk analyse af IHC-data og deres forhold til patienternes kliniske resultater blev udført ved hjælp af SAS-software-pakke (version 9.2, SAS Institute). For at lette statistisk analyse blev vævsprøver grupperet i to kategorier baseret på deres scores. “Lav” farvning blev bestemt som puljede farvningsintensitet score på 0 og 1, mens “høj” farvning havde puljet score på 2 og 3. Forskel i ekspressionsniveauer af LEDGF /p75-protein mellem tumorer og normale væv blev analyseret under anvendelse af Fishers eksakte test.

for at kontrollere for falske positiver, som kan opstå i flere-hypoteser-test undersøgelser, falsk opdagelse sats (FDR) korrigeret p-værdier blev også beregnet. FDR er en kvantificering af fejl anvendt almindeligt i flere sammenligninger. Den styrer den forventede andel af forkert afviste nulhypoteser. Med andre ord, FDR styrer den del af positive detektioner, der er falsk. Associationer mellem ekspressionsniveauer af LEDGF /p75 og klinisk-patologiske parametre blev bestemt under anvendelse af Fishers eksakte test (for alder og køn) og Kendall tau korrelationsanalyse (for tumor fase). Sandsynlighedsværdier

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Reproducerbarhed replikater kerner blev vurderet ved Cochran-Mantel-Haenszel test, som undersøges for ensartethed mellem replikater.

Resultater

LEDGF /p75 udskrift opreguleres i forskellige menneskelige typer kræft

i silico analyse af LEDGF /PSIP1 mRNA-ekspression i cancervæv blev udført under anvendelse af kræft gen microarray datasæt fra Oncomine database, sammenlignet cancervæv til normale væv (enten sygdomsfri normal og /eller normal tilstødende). Som opsummeret i tabel 2, observerede vi en statistisk signifikant (

P

0,05) opregulering af LEDGF /PSIP1 transkript i nogle af de tilgængelige microarray datasæt fra kræft i bryst, cervix, colon, spiserør, nyre, hoved og hals, lever, lunge, lymfom, ovarie, pancreas, prostata, spytkirtel, hud og mave. Fold-stigning var større end 2 i kræft i bryst, cervix, hoved og hals, nyre, hud og mave (tabel 2). Stigningen var beskeden (mellem 1 og 2) i colorectal, esophageal, lever, lunge, ovarie, bugspytkirtel, prostata, og spytkirtel kræft. Ingen ændringer i LEDGF /PSIP1 udskrift udtryk blev påvist i blæren (5 datasæt) og uterin (1 datasæt) kræftformer. Ingen af ​​de ovennævnte 17 cancertyper viste signifikant nedregulering af LEDGF /PSIP1 transkript i ethvert datasæt. Ingen datasæt var tilgængelige sammenligne tumor vs normal udtryk for LEDGF /PSIP1 udskrift i galdeblære, tyndtarmen, og skjoldbruskkirtelkræft.

Udtrykket af LEDGF /p75 udskrift blev yderligere vurderet eksperimentelt i otte solide tumorer (bryst, colon, nyre, lever, lunge, ovarie, prostata og skjoldbruskkirtel) under anvendelse af TissueScan cancer Q-PCR array, som indeholdt cancer vævsprøver fra 12 individuelle donorer tilfælde (n = 9 for hver cancertype, n = 3 for tilsvarende normale væv). Primers til LEDGF /p75, blev anvendt i disse eksperimenter. Som vist i figur 1, en statistisk signifikant (

P

0,05) opregulering af LEDGF /p75-transkript blev observeret i prostata (2,38 fold,

P

= 0,002), thyreoidea (1,85 fold ,

P

= 0,031), bryst (2,26 gange,

P

= 0,037) og kolon (2,04 gange,

P

= 0,047) kræftformer. Selv om niveauet af LEDGF /p75-transkript blev forhøjet ( 1,02 gange) i andre typer cancer (med undtagelse af leverkræft) fold ændringer var ikke statistisk signifikante. Levertumorer viste en lille nedregulering (-1,24 gange) i LEDGF /p75-transkript ekspression, men faldet var statistisk insignifikant.

Data blev analyseret ved anvendelse af ΔΔCt metoden med værdier normaliseret til p-actin niveauer. Y-aksen repræsenterer induktion fold af LEDGF /p75 mRNA-niveau i otte cancertyper (n = 9) sammenlignet med matchende normale tilstødende væv (n = 3) i arrayet. Fejlsøjler viser området af standardfejlen. *

P

0,05.

P

værdier blev bestemt med t-test.

Udvælgelse af LEDGF /p75-specifikt antistof for IHC

For at identificere et antistof, der er specifikt for LEDGF /p75, og som kan bruges af IHC til at vurdere ekspressionsniveauerne af dette protein i kræft TMAs, vi evalueret ved immunblotting specificiteten af ​​for tiden tilgængelige anti-LEDGF antistoffer. Tre kommercielt tilgængelige anti-LEDGF antistoffer (Bethyl, BD og Novus) og en ikke-kommerciel antistof (Scripps-Ab5087) mod LEDGF blev testet ved immunblotting i PC-3 celler med og uden forbigående knockdown af proteinet (figur 2). PC-3-celler transficeret med siSD tjente som kontrol. Immunoblotting-analyse viste, at alle de 3 kommercielle antistoffer mod LEDGF omsat med både p75 og P52-varianter. Imidlertid Scripps-Ab5087 antistof detekteres kun LEDGF /p75 og blev derfor udvalgt til IHC studier.

Celler blev transficeret med siLEDGF /p75 for at inducere transient knockdown af LEDGF /p75. PC-3-celler transficeret med små interfererende scrambled RNA duplex (siSD) tjente som tilsvarende kontrol. Immunoblotting-analyse testet specifik reaktivitet af alle antistoffer mod LEDGF /PSIP1. Alle blottet par (siSD og siLEDGF /p75) for hvert antistof blev afledt fra den samme blot.

LEDGF /p75 protein er overudtrykt i forskellige menneskelige Kræft Typer

Vi udførte IHC analyse af LEDGF /p75-proteinekspression i tumorvæv under anvendelse af en omfattende panel af TMAs indeholdende i alt 2330 vævskerner, herunder 1754 tumorer vævskerner fra over 35 vigtigste typer af human cancer og tilsvarende 576 ikke-tumor (normal og ikke-kræft inflammatorisk ) vævskerner (tabel 1). Vi er udelukket fra vores statistiske analyse de tumortyper der havde 5 tumor væv fyldning eller /og havde ingen tilsvarende ikke-tumorvæv. De ikke-tumor inflammatoriske væv kerner blev også udelukket, fordi ikke alle tumortyper havde de tilsvarende inflammatoriske væv. Nogle væv kerner kunne ikke scoret på grund af dårlig væv kvalitet. I sidste ende blev 21 tumortyper inkluderet i vores statistiske analyse (tabel 3). Disse omfattede i alt 1735 væv, der repræsenterer en enkelt eller kopiere kerner fra 1220 individuelle donorer sager, med 985 tumor tilfælde og 235 ikke-tumor sager.

Resultaterne fra IHC-analyse af poolede scorer for LEDGF /p75-protein-ekspression (dvs. høje = scores 2-3 vs low = scorer 0-1) i tumorvæv sammenlignet med normale væv er vist i tabel 3. Der var signifikant overekspression af LEDGF /p75-protein i prostata, colon, thyreoidea, lever, og uterine tumorer (

P

0,05) (tabel 3 og figur 3). Forhøjede ekspressionsniveauer i brysttumorer var tæt på at statistisk signifikans (

P

= 0,087). Når korrigeret for forekomst af falske positiver, kun prostata, skjoldbruskkirtlen, og levertumorer blev fundet at udvise betydelig overekspression af LEDGF /p75 protein (FDR justeret

P Salg 0,05).

Tissue microarrays blev farvet med antistof mod LEDGF /p75, og de enkelte kerner blev blindt scoret med følgende skala: 0 = ingen farvning, 1 = lav farvning, 2 = moderat farvning, 3 = stærk farvning. Scorede væv blev samlet i to grupper: lav farvning (scores 0 og 1, mørke søjler) og høj farvning (scores 2 og 3, lette søjler). Andelen af ​​prøver i de to farvning kategorier blev plottet for tumorvæv sammenlignet med normale (herunder sygdomsfrie normale og normale tilstødende) væv. *

P

0,05; **

P

0,01.

P

værdier blev bestemt med Fishers eksakte test.

Den procentdel af tumorvæv med høj (scores 2-3) LEDGF /p75 protein-ekspression var 70,5% i skjoldbruskkirtlen, 68% i leveren, 38,3% i prostata, 30,2% i uterin, og 25% i coloncancer, sammenlignet med 12,5%, 31,3%, 0%, 0% og 6,3% i henholdsvis de tilsvarende normale væv (tabel 3) . Der var fire cancertyper (bryst, cervix, ovarie, og spytkirtel), hvor frekvensen af ​​tumorer, der udviser høj LEDGF /p75-proteinekspression var omkring 20% ​​eller mere, og de tilsvarende normale væv udviste lille eller ingen ekspression af proteinet. Men når vi sammenlignet forskelle i LEDGF /p75-ekspression (høj vs. lav udtryk) mellem tumor og normalt væv,

P

værdier nåede ikke signifikans. Interessant, når vi sammenlignet forskelle mellem tumor og normalt væv med hensyn til LEDGF /p75-ekspression (scorer 1-3) vs ingen udtryk (score 0),

P

værdier for brystkræft og livmoderhalskræft nåede signifikans (

P

0,05; data ikke vist). Sammenligning af de gentagne kerner viste ingen signifikant forskel (

P

= 0,6226) mellem replikater tyder høj reproducerbarhed mellem gentagne kerner.

Figur 4A viser repræsentative tumor vævskerner immunofarvede med Scripps-Ab5087 anti-LEDGF /p75 antistof. De repræsentative IHC billeder svarer til prostata, colon og skjoldbruskkirtel tumor vævskerner med lave (scores 0-1) og høj intensitet (scorer 2-3) farvning. Som nævnt ovenfor er disse tre tumortyper viste signifikant opregulering af både transkript (TissueScan Cancer Q-PCR array) og protein (IHC). Figur 4B viser repræsentative IHC billeder af sygdomsfrie normale prostata og tyktarm væv (fra ikke-cancer donorer) samt prostata- og colon tumorprøver med deres matchede tilstødende væv. Den kræft i skjoldbruskkirtlen TMA’er ikke har matchet tilstødende væv for specifikke skjoldbruskkirtlen tumorer. Vi observerede, at de “normale” væv tilgrænsende til prostata og tyktarm tumorvæv havde moderat LEDGF /p75-farvning, sammenlignet med den relativt lave intensitet farvning af sygdomsfrie normale væv. En anden interessant observation var, at LEDGFp75 immunfarvning blev distribueret i både kernen og cytoplasmaet i de fleste tumorvæv undersøgte.

A. Repræsentative billeder af immunhistokemisk farvning (lav intensitet, scorer 0-1; høj intensitet, scorer 2-3) til LEDGF /p75 i prostata, colon, og skjoldbruskkirtlen tumorer (Scale bar-40 um, forstørrelse = 200 ×). B. Repræsentative billeder af LEDGF /p75 immunfarvning af ikke-sygdomsspecifikke normale prostata og colon væv, og i tumorvæv og deres matchede tilstødende væv (Scale bar-40 um; forstørrelse = 400 ×). TMA’erne blev farvet under anvendelse LEDGF /p75 specifikt kanin-antistof Scripps-Ab5087, som angivet i Materialer og Metoder. Identiske kameraindstillinger blev brugt i erhvervelse og behandling af billeder til en bestemt vævstype.

De tilgængelige klinisk-patologiske karakteristika patienter med tumor typer viser signifikant LEDGF /p75 overekspression er sammenfattet i tabel 4. Antallet af vævsprøver til kolon og prostatakræft adskiller sig sættene diskuterer alder og køn på grund af manglende data i kommercielt tilgængelige TMAs. Data om alder manglede for 4 kerner i prostata cancer TMA’er mens data om sex manglede for 2 kerner i tyktarmskræft TMA. Sammenhæng mellem disse egenskaber og LEDGF /p75 protein-ekspression afslørede, at overekspression af dette protein i leveren og skjoldbruskkirtlen tumorer var signifikant associeret med yngre alder (

P

0,05) (tabel 4). De mediane alder af patienter, der er repræsenteret i TMA’er var 62 år for tyktarmskræft, 53 år for leverkræft, 66 år for prostatakræft, 48 år for kræft i skjoldbruskkirtlen og 70 år for livmoderkræft. Ingen af ​​de fem tumortyper udviste signifikant sammenhæng mellem øget LEDGF /p75 udtryk, køn eller øget TNM tumor stadie. De begrænsede patient opfølgende data knyttet til TMA’er udelukkede korrelere LEDGF /p75 udtryk med patientens overlevelse resultater.

cross-platform analyse af LEDGF /p75-ekspression i forskellige humane tumortyper er blevet sammenfattet i tabel 5. de udskrift og protein udtryk for hver tumortype sammenlignes på tværs af de forskellige platforme, der anvendes:. simulation, Q-PCR og IHC

diskussion

Den foreliggende undersøgelse blev foretaget som en del af vores løbende bestræbelser på at forstå den biologiske og kliniske betydning af LEDGF /p75-ekspression i human cancer. Vores resultater viste signifikant opregulering af både LEDGF /p75 udskrift og protein i prostata, colon og skjoldbruskkirtlen tumorer, udledes af analysen af ​​udskrift udtryk i Oncomine kræft gen microarray database (når data) og TissueScan Cancer Q-PCR array, og analyse af proteinekspression ved IHC i TMAs. Den observerede opregulering af LEDGF /p75 i prostata tumorer er i overensstemmelse med vores tidligere rapporter om, at dette protein er målet for autoantistoffer i nogle patienter med PCa, opreguleres i både PCA cellelinjer og væv, og fremmer kemoresistens i PCA cellelinjer når ektopisk overudtrykt [16], [31].

Betydelig opregulering af LEDGF /PSIP1 udskrift blev også observeret i nogle Oncomine datasæt for kræft i bryst, livmoderhals, spiserør, nyrer, hoved og hals, lever, lunge, lymfom, ovarie, pankreas, spytkirtel, hud og mave. Men kun 4 ud af 8 tumortyper (prostata, tyktarm, bryst og skjoldbruskkirtel) udviste signifikant opregulering af LEDGF /p75-transkript i TissueScan Cancer Q-PCR array. Selvom andre tumortyper (nyre, lunge, og ovarie) udstillet 1,02 fold LEDGF /p75 udskrift elevation i dette array, at opregulering var ikke statistisk signifikant. Disse forskelle mellem Oncomine databasen og TissueScan Cancer Q-PCR-array kunne tilskrives den lille stikprøvestørrelse i sidstnævnte, metodisk /platform variationer, analyse af LEDGF /PSIP1 vs LEDGF /p75, og brugen af ​​uafhængige tumor datasæt. [17].