PLoS ONE: Specifikke Varianter i MLH1 Gene Region May Drive DNA-methylering, Tab af protein Expression, og MSI-H Kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Vi har tidligere identificeret en sammenhæng mellem et fejlparringsreparationsgen,

MLH1

, promotor SNP (rs1800734) og mikrosatellit ustabile (MSI-H) kolorektal kræft (CRC’er) i to prøver. Den aktuelle undersøgelse ekspanderede på dette resultat som vi udforsket den genetiske basis for methylering af DNA i denne region af kromosom 3. Vi antager, at specifikke polymorfier i

MLH1

genregion prædisponere det til DNA-methylering, hvilket resulterer i tab af

MLH1

genekspression, mismatch-reparation funktion, og dermed hele genomet mikrosatellit ustabilitet.

Metode /vigtigste resultater

Vi først afprøvet vores hypotese i en prøve fra Ontario (901 sager, 1.097 kontroller) og replikerede vigtigste resultater i yderligere to prøver fra Newfoundland og Labrador (479 tilfælde, 336 kontroller) og fra Seattle (591 tilfælde, 629 kontroller). Logistisk regression blev anvendt til at teste for association mellem SNP’er i region

MLH1

og CRC, MSI-H CRC,

MLH1

genekspression i CRC, og DNA-methylering i CRC. Sammenhængen mellem rs1800734 og MSI-H CRC’er, tidligere rapporteret i Ontario og Newfoundland, blev gentaget i Seattle prøven. To yderligere SNP’er, i stærk bindingsuligevægt med rs1800734 viste stærke associationer til

MLH1

promotor methylering, tab af MLH1 protein, og MSI-H CRC i alle tre prøver. Den logistiske regressionsmodel af MSI-H CRC, der omfattede

MLH1

-promoter-methylering status og MLH1 immunohisotchemistry status passer til de fleste parsimoniously i alle tre prøver tilsammen. Når rs1800734 blev tilføjet til denne model, dens effekt var ikke statistisk signifikant (

P

-værdi = 0,72 vs. 2,3 × 10

-4 da SNP blev undersøgt alene).

konklusioner /betydning

den observerede sammenslutning af rs1800734 med MSI-H CRC sker gennem dens virkning på

MLH1

promotor methylering, MLH1 IHC-mangel, eller begge

Henvisning.: Mrkonjic M, Roslin NM, Greenwood CM, Raptis S, Pollett A, Laird PW, et al. (2010) Specifikke Varianter i MLH1 Gene Region May Drive DNA-methylering, Tab af protein Expression, og MSI-H kolorektal cancer. PLoS ONE 5 (10): e13314. doi: 10,1371 /journal.pone.0013314

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Juni 28, 2010; Accepteret: September 15, 2010; Udgivet: 13. oktober 2010

Copyright: © 2010 Mrkonjic et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en Team Grant fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR tilskud CRT-43821 til JM, BB, JK, SG, RG, PP og BY). Desuden blev dette arbejde støttes af National Cancer Institute, National Institutes of Health under Request For Applications CA-95 til 011, og gennem samarbejdsaftaler med medlemmer af tyktarmen familien registreringsdatabasen og Principal Efterforskere (U01 CA074783 tildelt Ontario Registry for Studier af familiær Kolorektal Cancer, og U24 CA074794 tildelt Seattle Kolorektal Cancer Family Registry). A.D.P. og N.R. understøttes af Genome Canada. A.D.P. holder Canada Research Chair i Genetics af komplekse sygdomme. B.W.Z. og T.J.H. er modtagere af Senior Investigator Awards fra Ontario Institute for Cancer Research, gennem generøs støtte fra Ontario Ministeriet for forskning og innovation. Desuden blev dette arbejde delvist understøttet af det amerikanske Institute for Cancer Research giver 99B055 (B.B. og J.K.). M.M. er en Research Student af den canadiske Cancer Society gennem en pris fra National Cancer Institute of Canada (018.668). M.M. blev også støttet af graduate studentship fra Team i Interdisciplinary Research på kolorektal cancer med støtte fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) og fra Samuel Lunenfeld Research Institute. Alle forfattere havde det fulde ansvar for udformningen af ​​undersøgelsen, indsamling af data, analyse og fortolkning af dataene, at beslutningen om at indsende manuskriptet til offentliggørelse, og skrivning af manuskriptet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den fjerde mest almindelige kræftform, og anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i Nordamerika [1]. CRCs kan parsimoniously underopdeles i to store grupper defineret af de genetiske involverede veje. Suppressor pathway, observeret i 80% af CRC tilfælde omfatter abnormaliteter af APC /vingeløse signalvej og er karakteriseret ved hyppige somatiske mutationer af onkogener og tab af heterozygositet af tumorsuppressorgener, kromosomale ustabilitet og mikrosatellit stabil (MSS) tumorer. Den mutator pathway, på den anden side, udgør ~15-20% af CRC tilfælde og skyldes en mangel af mismatch-repair (MMR) systemet, hvilket fører til hele genomet mikrosatellit instabilitet (MSI) [2], [ ,,,0],3]. MSI tumorer har clinicopathologic features distinkte fra MSS tumorer i at de har tendens til at forekomme mere almindeligt i proximal colon, har mucinous histologi, tumorinfiltrerende lymfocytter, dårlig differentiering og Crohns-lignende reaktion [4]. CRC’er kan også klassificeres baseret på epigenetisk ustabilitet i CpG Island Methylator Fænotype (CIMP) -positive og CIMP-negative tumorer [5]. CIMP-positive CRC tumorer kan efterfølgende opdeles i to grupper, en mere almindelige CIMP1 tumorer, som er MSI-H på grund af

MLH1

promotor methylering og CIMP2 tumorer, som er MSS [5]. Ca. 80-90% af sporadisk MSI CRC’er udviser tab af MMR funktion på grund af

MLH1

promotor methylering [6], [7]. Den potentielle mekanisme, som

MLH1

er epigenetisk tavshed er uklar.

Vores tidligere arbejde har til formål at belyse den rolle et panel af SNPs i MMR gener i CRC. Inkluderet i dette panel var den

MLH1

-93G En initiativtager polymorfi (rs1800734), og vi observerede sit samarbejde med MSI-H-tumorer i to prøver fra de canadiske provinser Ontario og Newfoundland og Labrador [8]. Flere undersøgelser efterfølgende bekræftet og udvidet på vores resultater og har observeret associationer mellem

MLH1

-93G En polymorfi og

MLH1

promotor methylering i CIMP CRC’er, samt MLH1 IHC-mangel [9] [10], [11]. Imidlertid har ingen prædiktiv model blevet foreslået at beskrive sådanne fund. Associationen mellem

MLH1

promotor polymorfi (rs1800734) og methylering kan indikere sekvensspecificitet til DNA methylering.

Vi hypotese en trinvis progression til MSI-H CRC’er baseret på genetisk modtagelighed for førende DNA methylering til

MLH1

gendæmpning og mikrosatellit instabilitet (figur 1). Endvidere fremsatte vi den hypotese, at

MLH1

-93G En polymorfi kan være i stærk bindingsuligevægt (LD) med andre varianter, og at en eller flere af disse varianter prædisponere regionen til methylering, som derefter resulterer i tab af

MLH1

genekspression og et defekt MMR-system, hvilket fører til mikrosatellit ustabilitet. Vi har foretaget en populationsbaseret tilgang med tre uafhængige stikprøver. Denne undersøgelse brugt en unik kombination af genetisk epidemiologi og funktionelle strategier at identificere og karakterisere alleler, der spiller en rolle i at ændre CRC udvikling i en vigtig og fælles undergruppe af sager.

Specifikke SNPs prædisponere regionen, herunder

MLH1

genpromotor, methylering, som resulterer i promotor silencing og tab af

MLH1

genekspression, der er målt ved immunohistokemisk farvning. Tab af

MLH1

genekspression fører til genom-dækkende mikrosatellit ustabilitet og MSI-H kolorektal cancer.

Materialer og Metoder

SNP Udvælgelseskriterier

analyseret af 5′-nucleaseassayet i denne undersøgelse polymorfier blev udvalgt på grundlag af omfattende database og litteratursøgning som beskrevet tidligere [8], [12]. De 500 kb region af kromosom 3 omgiver

MLH1

blev genotype for alle tilgængelige polymorfier fra en kombination af Affymetrix GeneChip Humant Mapping 100K og 500K platforme. Derudover valgte vi SNPs i regionen af ​​interesse, der er i stærk LD med rs1800734 i HapMap data (frigive 27 i CEU befolkning), offentligt tilgængelige på https://www.hapmap.org. To sådanne SNP’er blev identificeret og blev også inkluderet

Undersøgelse Emner

Vi gennemførte denne undersøgelse med emner fra tre forskellige steder:. Provinsen Ontario, provinsen Newfoundland og Labrador (i det følgende benævnt som Newfoundland), og Seattle hovedstadsområdet. I alle steder, blev der kun personer med en enkelt tumor inkluderet. CRC patienter og uberørte kontroller fra Ontario og Newfoundland blev periodiseres som tidligere beskrevet [8], [12]. Kort fortalt til Ontario 1004 CRC patienter og 1957 kontrolpersoner blev identificeret af Ontario Familiær Colorectal Cancer Registry (OFCCR) [13]. For at minimere risikoen for befolkningen lagdeling vi udelukket fra analyser sager, der var ikke-hvide og dem, der ikke rapporterer etnicitet. Af de 1004 case patienter, 929 var hvide. Ingen relaterede sager blev anvendt i undersøgelsen. Endvidere har vi udelukket alle CRC patienter med kendte MMR kimlinie genmutationer (11 sager med en kendt mutation i MLH1, 10 i MSH2, og én i MSH6) og alle CRC sager, der var mangelfuld i en af ​​de MMR proteiner end MLH1 ( 14 MSH2 /MSH6 IHC deficiente tumorer). 901 CRC patienter forblev og udgør Ontario sager. Alle patientinformation samt blod- og vævsprøver blev opnået som tidligere beskrevet [8].

I alt 1957 kontrolpersoner fra Ontario indvilliget i at deltage i undersøgelsen, og afsluttet alle tre spørgeskemaer (familie, personlige, og kost spørgeskemaer). Af de 1957, 1314 kontroller forudsat blodprøver, og 1097 af dem var hvide. Disse 1097 kontrolpersoner lykkedes genotypet og dermed udgjorde de Ontario kontroller. Ca. 21% af OFCCR tilfælde og 12% af kontrollerne har førstegradsslægtninge ramt med CRC.

periodiseret mønster efterfulgt af Newfoundland Familiær Colorectal Cancer Registry (NFCCR) var den samme som efterfulgt af OFCCR. Patienter med CRC blev identificeret gennem Newfoundland tumor registreringsdatabasen; 1144 CRC patienter blev identificeret, hvoraf 747 svarede til familien historie spørgeskema og 555 leveres blodprøver; 490 forudsat etnicitet oplysninger og blev klassificeret som hvid. Ingen relaterede sager blev anvendt i undersøgelsen. Fire CRC tilfælde med kendte germline mutationer i MSH2 blev udelukket, da var 11 ikke-MLH1 MMR IHC mangelfulde tilfælde (5 for MSH2, 5 for MSH6 og 1 for PMS2 mangel). De resterende 479 CRC patienter udgør de Newfoundland sager

Newfoundland kontroller blev rekrutteret ved hjælp af tilfældige tal opkald, og matches til tilfælde efter køn og 5-års alderen.; 1602 kontroller enige om at deltage, hvoraf 336, til denne fase, har fuldført alle tre spørgeskemaer og forudsat blodprøver. Ingen relaterede kontroller blev anvendt i undersøgelsen. Ca. 31% af NFCCR tilfælde og 18% af kontrollerne havde førstegradsslægtninge ramt med CRC.

For Seattle, blev sager og kontroller rekrutteret af Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) som tidligere beskrevet [14] . Kort fortalt blev CRC patienter, der blev diagnosticeret i alderen mellem 20 og 74 år i Washingtons Kong, Snohomish eller Pierce Amter i perioden fra januar 1998 og juni 2002 havde kontaktet. Alle CRC sager blev inkluderet uanset familiens historie. Af de 1814 tilfælde og 1531 kontroller, der afsluttede de to spørgeskemaer, 1497 tilfælde og 745 kontroller doneret en blodprøve. For denne undersøgelse, vi opnåede DNA prøver til 668 CRC tilfælde og 667 kontroller af kaukasisk etnicitet. Femten MFR IHC mangelfulde CRC sager blev udelukket (10 for MSH2, 1 for MSH6, og 4 for PMS2 mangel). Ingen relaterede sager eller kontroller blev anvendt i undersøgelsen. Ca. 14% af FHCRC tilfælde og 8% af kontrollerne havde førstegradsslægtninge ramt med CRC.

Data blev indsamlet på alder ved diagnose (for sager), alder ved afslutning af familien historie spørgeskema, tumor placering, tumor stadie, og tumor klasse, når de foreligger, gennem revision af patologisk og /eller kirurgisk rapporter. Tumorer blev iscenesat og karakter efter fremgangsmåden amerikanske Blandede kræft [15]. Blod og vævsprøver blev opnået ved informeret skriftligt samtykke til at deltage i undersøgelsen, som pr protokoller godkendt af forskning etik bestyrelser Mount Sinai Hospital, University of Toronto, Memorial University of Newfoundland, og Fred Hutchinson Cancer Research Center.

molekylærgenetiske analyser

enkeltnukleotidpolymorfi Genotypebestemmelse.

Perifere blodlymfocytter blev isoleret fra helblod ved anvendelse af Ficoll-Paque-gradient centrifugering ifølge producentens protokol (Amersham Biosciences, Baie d ‘Urfé, Quebec, Canada). Phenol-chloroform eller Qiagen DNA-ekstraktion kit (Qiagen Inc., Montgomery Co., MD) blev anvendt til at ekstrahere genomisk DNA fra lymfocytter. Det fluorogene 5’-nuklease polymerasekædereaktion assay eller TaqMan-assayet [16] blev anvendt til at genotype hver af følgende fem SNP’er:

MLH1

-93G A (rs1800734), I219V (rs1799977), IVS14-19A C (rs749072),

LBA1

intron 8 (rs4431050), og intergeniske rs13098279. Sekvenser af primere og prober samt master reaktionsblandinger for rs1800734, rs1799977, og rs9876116 blev beskrevet tidligere [8].

LRRFIP2

rs749072,

LBA1

rs4431050, og intergeniske rs13098279 polymorfier blev genotype ved brug af Eurogentec qtPCR kit (Eurogentec, San Diego, CA) [8]. Sekvenser af primere og prober til rs749072, rs13098279 og rs4431050 findes i supplerende File S4.

SNPs placeret i 500 kb region af kromosom 3 omgivende

MLH1

gen blev genotypebestemmes i Ontario prøver ved hjælp af Affymetrix GeneChip Menneskelig Mapping 100K og 500K platforme som en del af Vurdering af risiko for kolorektal tumorer i Canada (ARCTIC) projekt, der tidligere er beskrevet [17]. 94 SNP’er i 500 kb region, ud over de 5 SNPs genotype af TaqMan blev genotype for Ontario prøver spænder følgende gener:

DCLK3

,

LBA1

,

EPM2AIP1

,

MLH1

,

LRRFIP2

, og

GOLGA4

. Listen over SNPs genotypede til Ontario prøverne er fastsat i supplerende File S1. De Newfoundland og Seattle prøver blev genotypebestemmes hjælp af Illumina IVælg 500K Chip platform. I alt 16 SNPs i denne region blev genotype herunder rs1800734, rs749072, og rs13098279. De Newfoundland prøver blev yderligere karakteriseret for tre polymorfier: rs1799977 og rs9876116 genotype tidligere [8], og

LBA1

rs4431050. Den rs1800734 SNP blev genotype både af Affymetrix Chips og Taqman platforme i Ontario og blev brugt til at validere genotype opkald. Ud af 1884 prøver genotypede ved begge metoder var der 11 uharmoniske opkald (0,58%, supplerende File S1).

kvalitetskontrol for genotypebestemmelse blev udført som tidligere [17] beskrevet. Kort fortalt blev SNPs udelukket fra data analyse, hvis den mindre allel frekvens var mindre end 1%, og opkaldet sats var mindre end 87% i de kontroller i hver af de tre studiecentre. Derudover blev SNPs udelukket, hvis den

P

-værdien fra en test for Hardy-Weinberg ligevægt var mindre end 10

-4 i kontrollerne. Individer blev udelukket, hvis genotype takst var mindre end 87%.

Tumor mikrosatelitter ustabilitet Analysis.

Tumor MSI-analyse blev udført som tidligere [18] beskrevet. Kort fortalt blev paraffinindlejret kolorektal tumor og matchet normal colon væv fra patienter med indfaldende tilfælde af CRC mikrodissekeres i områder med mere end 70% cellularitet. PCR på DNA fra CRC tumor og matchet normalt colon væv blev brugt til at etablere og sammenligne MSI mønstre. MSI analyse blev foretaget med mindst fem mikrosatellitmarkører fra panelet af 10 mikrosatellitmarkører, som anbefalet af National Cancer Institute [19]. MSI status blev tildelt som MSI høj (MSI-H, ≥30% ustabile markører blandt alle testede markører), MSI lav (MSI-L, 30% markører ustabile) eller mikrosatellit stabil (MSS, ingen ustabile markører) som anbefalet [19]. Til analysen blev MSI-L og MSS grupper sammen til én gruppe (i det følgende benævnt “MSS /L”). Primere blev opnået fra Applied Biosystems (Foster City, CA), og primersekvenser blev beskrevet tidligere [8].

MMR Protein immunhistokemisk farvning

formalinfikserede, paraffinindlejrede CRC væv, opsamlet til diagnostisk formål, snittet ved 4 um blev afparaffiniseret og rehydreret med alkohol og xylen til immunhistokemisk analyse af MLH1 som tidligere beskrevet [20], [21]. Efter rehydrering blev objektglassene anbragt i enten en trykkoger eller mikrobølge antigen hentning medium (10 mmol /l citratbuffer ved pH 6,0 i 3 minutter ved 115 ° C i MICROMED T /T Mega; Hacker Instrumenter og amp; Industries, Inc., Fairfield , NJ). Protein blokker (20%) med avidin blev anvendt til at forhindre ikke-specifik binding (Signet Laboratories, Inc, Dedham, MA). Efter objektglassene blev vasket i PBS blev snittene inkuberet med muse-antistof mod MLH1 (01:40; G168-728, PharMingen, San Diego, CA), MSH2 (1:100; FE 11, Oncogene Research Products, Cambridge, MA ), MSH6 (1:100, 44, BD Transduction Laboratories, Mississauga, Ontario, Canada), eller PMS2 (01:50; BD Biosciences PharMingen, Mississauga, Ontario, Canada) i 1 time. Antistofferne blev derefter detekteret under anvendelse avidin-biotin:. 3,3′-diaminobenzidin tetrachlorid blev anvendt som kromogen og hematoxylin for kontrastfarvning

MLH1 Promoter methyleringsanalyse

MLH1

promotor methylering blev analyseret ved anvendelse MethyLight [22], [23]. Tumor DNA fra de tilgængelige sager var genstand for natriumbisulfit omdannelse ved hjælp af EZ DNA-methylering Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA) pr producentens anbefalinger.

MethyLight analyse af

MLH1

promotor blev udført som tidligere beskrevet [23]. Alu-C4 kontrolreaktion blev anvendt til at normalisere for bisulfit omdannede indført DNA [23]. Prøverne blev klassificeret som positive for

MLH1

promotor methylering hvis procent methylerede reference (PMR) ≥10, som tidligere beskrevet [23]. Grunder og probesekvenser til

MLH1

og Alu-C4 samt real-time PCR program for MethyLight analyse er tidligere blevet beskrevet [23]. Alle analyser blev kørt i 96-brønds polypropylen plader (Axygen Scientific, Union City, CA), og resultaterne blev analyseret ved hjælp af ABI 7500HT Real-Time PCR instrument og den medfølgende software, SDS version 2.2 (Applied Biosystems, Foster City, Californien) . Uafhængig kvalitetskontrol for MLH1 promotor methylering analyse blev udført eksternt på 15% af Ontario prøver

Statistisk analyse

Hver af de følgende resultater blev testet for association med hver SNP ved hjælp af logistisk regression:. Kolon cancer (alle CRC sager versus kontrol), methylering (

MLH1

denatureret tumorer versus ikke-methylerede tumorer), IHC (MLH1 IHC-mangel versus dygtige tumorer), og MSI (MSI-H versus MSS /L tumorer) ved anvendelse af en additiv kodning af genotyper for hver SNP. Sex og alder ved eksamen, indsamlet for patienter og upåvirkede kontroller, blev brugt som kovariater da CRC var resultatet, mens køn og alder ved diagnose (kun tilgængelig for patienter) blev anvendt i modellerne med de andre resultater. Analyse af separate modeller for de tre indsamlingssteder og det kombinerede datasæt blev foretaget. I analysen af ​​de kombinerede data, blev stedet indgår som kovariat.

Flere logistiske regressionsmodeller til MSI status blev også evalueret i den delmængde af de data, hvor der ikke var nogen manglende værdier for alle variabler i modellerne (alder, MSI, IHC, methylering, og tre SNP’er). MSI status blev regresseret på kombinationer af IHC, methylering og SNP for hver af tre SNPs, der viste foreninger i de indledende logistiske regressionsmodeller. Da prøvestørrelserne er små, især i Seattle, regressionen blev udført med alle prøver tilsammen, mens du bruger en kovariat for rekruttering placering. For at tjekke for konsistens i resultaterne, blev modellerne også køre på hver prøve separat. På grund af den stærke association mellem MSI, IHC, og methylering og næsten fuldstændig separation blev maksimal straffet sandsynlighed anvendes til fremstilling af finite parameterestimater [24]. Alle statistiske analyser blev udført med R 2.7.0 (https://www.R-project.org).

For at styre for effekten af ​​multiple test, en effektiv antal tests blev anslået til Ontario , Seattle og Newfoundland, baseret på proceduren ifølge Li og Ji [25]. Denne procedure anvender spektral dekomponering af den observerede korrelation mellem SNPs at estimere antallet af helt og delvist korrelerede tests. Således at kontrollere for type I-fejl, den nominelle signifikansniveau på 0,05 justeres med det anslåede effektivt antal tests med den normale Bonferroni procedure. Den spektrale nedbrydning blev udført ved hjælp af modificerede scripts downloades fra hjemmesiden af ​​Dale Nyholt (https://gump.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD den 4. juli 2005), sammen med GOLD 1.1.0 [26] og R 2.7.0 (https://www.R-project.org).

Resultater

Vi genotype 901 tilfælde og 1097 kontroller fra Ontario for 99 SNPs i en 500 kb region af kromosom 3 omgivende

MLH1

gen (figur 2).

i alt 99 polymorfier blev undersøgt i Ontario prøverne på tværs af en 500 kb region af kromosom 3 omgiver

MLH1

gen. Gener i denne region er skitseret (toppanel) sammen med deres transkriptionelle retningsvirkning (nederste panel). De tre polymorfier af interesse er angivet. Modificeret fra Ensembl (www.ensembl.org)

Vi fjernede 25 SNPs grund kvalitetskontrol spørgsmål:. Mindre allel frekvens 1% (22), kalder sats 87% (1) eller Hardy-Weinberg

P

-værdi 10

-4 (2), hvilket resulterer i 74 analyserede SNPs. Vi derefter screenet Newfoundland (479 tilfælde og 336 kontroller) og Seattle (591 tilfælde og 629 kontroller) prøver i 19 og 16 SNP’er af interesse, hhv. Alle markører i Newfoundland og Seattle prøver bestået kvalitetskontrol filtre. Tumor mikrosatellit instabilitet blev evalueret for 744 Ontario, 463 Newfoundland, og 487 Seattle tilfælde. MLH1 IHC-farvning blev foretaget på 709 Ontario, 462 Newfoundland, og 517 Seattle tilfælde, og

MLH1

promotor methylering analyse blev udført på 569 Ontario, 468 Newfoundland, og 210 Seattle tilfælde. Karakteristik af alle tre prøvepopulationer er opsummeret i tabel 1. Generelle kliniske og patologiske træk ved CRC af vores samlede case populationer lignede dem af case populationer anvendes i de multiple logistiske regressionsmodeller, med undtagelse af Seattle, hvor der var en bias dybt MSI-H-tumorer (og tilsvarende IHC-deficiente tumorer). Listen over alle polymorfier genotypede findes i supplerende File S1. Spectral nedbrydning viste, at teste de 74 SNPs i Ontario prøver svarede til 28 effektive tests; dermed blev foreningen

P

-værdier i forhold til en kritisk grænse på

P

= 0,0018, at kontrollere eksperimentet-wise signifikansniveau på 5%. For Newfoundland data, analyse af de 19 SNPs udgjorde 8 effektive tests (

P

-værdi tærskel = 0,0063), og for Seattle data de 16 SNPs var svarende til 6 effektive tests (

P

-værdi tærskel = 0,0083).

Vi først testet for association mellem hver SNP og risikoen for CRC (vs. kontroller), MSI-H CRC’er (vs. MSS /L CRC’er), MLH1 IHC-mangelfulde CRC’er (vs. MLH1 IHC-positiv), og med

MLH1

promotor methylering (vs. umethyleret

MLH1

promotor) (Supplerende File S2). To SNPs var statistisk signifikant associeret med øget risiko for CRC i Ontario:. Rs931913 (

P

= 0,001) og rs4624519 (

P

= 0,005)

Tre yderligere SNPs var signifikant associeret med øget risiko for MSI-H CRC’er, MLH1 IHC-mangelfulde CRC’er, og med

MLH1

promoter methylerede CRC’er i Ontario (for rs1800734

P

= 0,005,

P

= 0,04, og

P

= 0,018 henholdsvis, for rs749072

P

= 3,0 × 10

-4,

P

= 0,011, og

P

= 0,003 henholdsvis, og for rs13098279

P

= 0,017,

P

= 0,090, og

P

= 0,037 henholdsvis; Supplerende File S2). Vi undersøgte disse resultater i de to andre prøver: til rs1800734 i Newfoundland,

P

= 8,53 × 10

-5, 1,92 × 10

-5, og 8,95 × 10

-7 til MSI-H, MLH1 IHC-mangel, og

MLH1

promotor methylering henholdsvis og, for Seattle,

P

= 0,08,

P

= 0,02, og

P

= 0,04 henholdsvis; for rs749072 i Newfoundland,

P

= 0,001,

P

= 2,4 × 10

-4,

P

= 6,65 × 10

-6 henholdsvis og for Seattle,

P

= 0,03,

P

= 0,004, og

P

= 0,014 henholdsvis; for rs13098279 i Newfoundland,

P

= 4,5 × 10

-4,

P

= 4,30 × 10

-5, og 1,98 × 10

-6 henholdsvis og for Seattle,

P

= 0,24,

P

= 0,07, og

P

= 0,14 hhv. Se Supplerende File S2. Ingen af ​​de tre sidstnævnte SNPs var signifikant associeret med generelle risiko for CRC i de tre undersøgte prøver (Supplerende File S2). Disse tre SNPs spænder over et 197,5 kb region med rs1800734 placeret i

MLH1

promotor, 93 nukleotider opstrøms for translationsstartsted; rs749072 placeret i intron 26 i

LRRFIP2

(IVS26-18T C); og rs13098279 placeret mellem

LRRFIP2

GOLGA4

(figur 2). Alle tre SNP’er er i stærk koblingsuligevægt i Ontario kontroller (parvis

r

2

0,73,

D

‘ 0,98). Parvis

D

‘og

r

2

for alle SNPs genotypede i Ontario kontrolpersoner er vist i supplerende figurer S1 og S2.

Analyse af alle tre prøver kombineret afslørede stærke associationer mellem rs749072 og nedsat risiko for

MLH1

-promoter-methylerede CRC (

P

= 3,80 × 10

-6, OR for den fælles allel = 0,45, CI = 0,34 -0,60); øget risiko for MLH1-protein-udtrykkende CRC som målt ved IHC-farvning (

P

= 3.99 × 10

-7, OR for den fælles allel = 1,87, CI = 1,47-2,39); og nedsat risiko for MSI-H CRC (

P

= 2,50 × 10

-7, OR for den fælles allel = 0,55, CI = 0,44-0,69). Da de to andre SNPs (rs1800734 og rs13098279) er i stærk bindingsuligevægt med rs749072, analyser af disse SNPs gav tilsvarende resultater (Tabel 2).

For at undersøge, om disse SNPs var forbundet med den pathway, som vi hypotese (figur 1), vi næste skabte logistiske regressionsmodeller til MSI-H versus ikke-MSI-H CRCs for den kombinerede datasæt (Supplerende File S3). Vi modelleret MSI-H som funktion af hver af de opstrøms prædiktorer, samt kombinationer af prædiktorer: første MLH1 IHC status; derefter

MLH1

-promoter-methylering status; en SNP; både MLH1 IHC status og

MLH1

promotor methylering status; og endelig MLH1 IHC status,

MLH1

-promoter-methylering status og hver SNP (tabel 3). MLH1 IHC status alene var en stærk prædiktor for MSI-H CRC’er (

P

= 2,08 × 10

-30) som var den

MLH1

-promoter-methylering status (

P

= 1,33 × 10

-44) for SNP’er af interesse (for rs1800734,

P

= 2,30 × 10

-4, for rs749072

P

= 1,36 × 10

-5, og for rs13098279

P

= 5.10 × 10

-3). Modellen med MLH1 IHC status og

MLH1

-promoter-methylering status gav den mindste Akaike s Information Criterion (AIC) (225,12) og tilsætning af rs13098279 resulterede i den anden mest påholdende model (AIC = 225,94) (tabel 3 ). I modellen med MLH1 IHC status og

MLH1

-promoter-methylering status, begge variabler var statistisk signifikante, som det var SNP i modellen, hvor det var den eneste prædiktor. Men når SNP af interesse blev tilføjet til modellen med MLH1 IHC status og

MLH1

-promoter-methylering status, SNP ikke længere forblev statistisk signifikant:

P

-værdi fra test af betydning for rs1800734 ændret fra 2,30 × 10

-4, da det var den eneste prædiktor, til 0,72 når SNP,

MLH1

promotor methylering status og MLH1 IHC status var prædiktorer; for rs749072, fra 1,36 × 10

-5 til 0,98; og for rs13098279 fra 0,005 til 0,29 (tabel 3). I den mest påholdende model, gjorde rekruttering center ikke har en væsentlig indvirkning på modellen (

P

≥0.26, Supplerende File S3).

Vi evaluerede de samme modeller på den placering -specifikke datasæt og resultaterne var i overensstemmelse med de kombinerede resultater (Supplerende File S3). MLH1 IHC status,

MLH1

promotor methylering status, og SNP’er af interesse var alle stærke prædiktorer for tumor MSI-H status. Den model, der omfattede MLH1 IHC status og

MLH1

-promoter-methylering status gav den mindste AIC i alle tre prøver. Tilføjelsen af ​​en hvilken som helst af de tre SNPs ikke resulterede i en væsentligt bedre model fit (Supplerende File S3).

Diskussion

Denne store multicenter studie undersøgte kimlinie DNA-markører og deres bidrag til somatiske begivenheder, især modtagelighed for methylering af DNA i CRC. I tre uafhængige stikprøver, tre polymorfier, rs1800734, rs749072 og rs13098279 var associeret med

MLH1

-promoter-methylering status resulterer i tab af MLH1 protein og mikrosatellit ustabilitet. Selv om disse tre markører ikke er forbundet med en stigning i risikoen for CRC samlet, de spiller en rolle i colorektal tumorigenese i delmængden af ​​CRCs der viser hele genomet mikrosatellit ustabilitet. Blandt sager i hver enkelt prøve befolkning og i en analyse af alle tre kombineret, statistisk signifikante associationer blev observeret mellem hvert af disse tre polymorfier og

MLH1

promotor methylering, MLH1 IHC-mangel, og MSI-H tumor status. I flere logistiske regressionsmodeller, blev hver SNP forbundet med tumor MSI-H status;