PLoS ONE: PCTAIRE1-Knockdown sensibiliserer Cancer Cells til TNF Family Cytokiner

Abstrakt

Mens PCTAIRE1 /PCTK1 /Cdk16 er overudtrykt i maligne celler og er afgørende i tumorigenese, dens funktion i apoptose er fortsat uklart. Her undersøgte vi rolle PCTAIRE1 i apoptose, især i den ydre celledød pathway. Gene-knockdown af

PCTAIRE1

sensibiliseret prostatakræft PPC1 og DU145 celler, og brystcancer MDA-MB-468 celler til TNF-familie cytokiner, herunder TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL). I mellemtiden har PCTAIRE1-knockdown ikke sensibiliserer ikke-maligne celler, herunder diploide fibroblaster IMR-90 og den immortaliserede prostata epitelial cellelinje 267B1. PCTAIRE1-knockdown ikke opregulere død receptorekspression på celleoverfladen eller påvirker caspase-8, FADD og flip ekspressionsniveauer. PCTAIRE1-knockdown gjorde fremme caspase-8 spaltning og RIPK1 nedbrydning, mens RIPK1 mRNA knockdown sensibiliserede PPC1 celler til TNF-familie cytokiner. Endvidere kinaseinhibitor SNS-032, som hæmmer PCTAIRE1 kinaseaktivitet, sensibiliserede PPC1 celler til TRAIL-induceret apoptose. Tilsammen tyder disse resultater på, at PCTAIRE1 bidrager til modstanden af ​​cancercellelinjer til apoptose induceret af TNF-familie cytokiner, hvilket indebærer, at PCTAIRE1 inhibitorer kan have synergistiske virkninger med TNF-familie cytokiner til cytodestruction af kræftceller.

Henvisning : Yanagi T, Shi R, Aza-Blanc P, Reed JC, Matsuzawa Si (2015) PCTAIRE1-Knockdown sensitizes kræftceller til at TNF Family Cytokiner. PLoS ONE 10 (3): e0119404. doi: 10,1371 /journal.pone.0119404

Academic Redaktør: Andreas Villunger, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Oktober 1, 2014 Accepteret: 12 Januar 2015; Udgivet: 19 Mar 2015

Copyright: © 2015 Yanagi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Teruki Yanagi er støttet af JSP’er stipendier til forskning i udlandet, Kanae fundament, og Sumitomo liv social velfærd tjeneste fundament. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. John C. Reed er ansat af Roche-koncernen, AG. De andre forfattere har ingen økonomisk interessekonflikt. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

PCTAIRE familien er en gren af ​​kinaser relateret til Cdk familie, der omfatter PCTAIRE1 (også kendt som cyclinafhængige kinase 16 (Cdk16) og PCTK1), PCTAIRE2 og PCTAIRE3 [1]. PCTAIRE1 udtrykkes bredt i hele kroppen, med højeste niveauer set i hjernen og testis [2]. PCTAIRE1 har vist sig at deltage i spermatogenese [3] og regulering af intracellulære vesikler [4,5], samt translokation af glucosetransport proteiner [6] og neuritudvækst [7]. PCTAIRE1 har en central kinase domæne, der viser aminosyresekvens-lighed til Cdk’er, og denne region er flankeret af unikke N-terminale og C-terminale domæner. Mekanismerne er ansvarlige for PCTAIRE1 aktivering er ukendte, men den fandt, at sletning af N-terminale domæne ophæver kinase aktivitet

in vitro

indebærer, at denne region er vigtig, og kan binde et ukendt cofaktor eller interagere intra-molekylært med den centrale kinasedomænet fremme aktive konformationer af det katalytiske domæne [1,7]. Det N-terminale domæne af PCTAIRE1 phosphoryleres af proteinkinase A (PKA), som hæmmer dets aktivitet [3,8], mens interaktion af N-terminale domæne af PCTAIRE1 med cyclin Y blev vist at stimulere kinaseaktivitet [3]. PCTAIRE1 også interagerer med COPII kompleks involveret i eksport af udskilte proteiner fra det endoplasmatiske reticulum [5].

Vi har for nylig opdaget, at PCTAIRE1 spiller en uundværlig rolle i kræft celledeling [9,10]. Vi viste ligeledes, at PCTAIRE1-Knockdown cancerceller fremmet mitosestandsning forbundet med defekter i centrosom dynamik. Endvidere PCTAIRE1 phosphorylerer p27 på Ser10, hvilket letter p27 nedbrydning. Imidlertid har den funktion PCTAIRE1 i apoptose ikke afklaret.

Apoptose induceret af TRAIL, Fas-ligand (FasL) og TNF-alfa forløber gennem en række receptor-medieret protein-interaktioner, der minimalt kræve adapteren protein FADD og cysteinproteaser såsom caspase-8 eller-10. Mens disse dødsfald receptor signalering komplekse komponenter tilbageholdes i de fleste kræftformer, modstandsdygtighed over for apoptose forbliver fælles. FADD og caspase-8 er blandt de mediatorer af den ydre vej, der vides at blive moduleret af proteinphosphorylering, hvilket tyder på en rolle for kinaser i resistens over for pro-apoptotiske TNF-familie cytokiner. Proteinkinaser er også attraktive mål for cancer drug discovery. Desuden har betydelige beviser foreslået en rolle for protein-phosphorylering i modulering proximale signaleringsbegivenheder induceret af TNF-familien dødsreceptorer [11-19], samt ændre aktiviteten af ​​godt anerkendte downstream apoptose suppressorer såsom FLIP og Bcl-2- og IAP-familie proteiner [18,20-24]. I denne henseende phosphorylering af død inducerende signalering kompleks (DISC) komponenter Fas, FADD og caspase-8, samt caspase-8 substrat Bid og anti-apoptotiske suppressorer af dødsreceptor-induceret apoptose (c-FLIP, XIAP) er blevet rapporteret i forbindelse med tumor modstand mod TRAIL eller Fas [20-22,25].

i denne undersøgelse har vi yderligere kendetegnet rolle PCTAIRE1 i kræftceller, og især dets funktion i ydre celledød pathway. Vi leverer beviser for, at PCTAIRE1 spiller en afgørende rolle for resistens over for TNF-familie cytokiner i kræftceller. Gene knockdown af

PCTAIRE1

sensibiliseret prostata og brystkræft celler til TNF-familie cytokiner, herunder TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) og Fas, men ikke bevidstgøre normale eller ikke-transformerede celler til TRAIL. PCTAIRE1-knockdown fremmet caspase-8 spaltning og nedbrydning af receptor-interagerende serin-threonin-proteinkinase 1 (RIPK1). Den siRNA-medieret knockdown af RIPK1 mRNA også sensibiliserede PPC1 celler til TNF-familie cytokiner. Vores resultater tyder på, at PCTAIRE1 kunne være et vigtigt mål for kræftbehandling, og at PCTAIRE1 hæmmere kan have synergistiske virkninger med TNF-familie cytokiner til at dræbe kræftceller.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

celleviabilitetstest kit Cell Titer Glo blev købt fra Promega. RNAiMAX blev opnået fra Life Technologies. Pre-designede kort interfererende-RNA (siRNA) rettet mod humant PCTAIRE1 (siRNA Ids: 1472, 1566, 1656), PCTAIRE2 (s10160), PCTAIRE3 (s10162), caspase-8 (s2427), RIPK1 (s16653), p27 (s2837 ) og scramble-kontrol (# 1, # 2) blev købt hos Life Technologies. Rekombinant TRAIL blev købt fra Enzo Bioscience. SNS-032 blev købt fra Selleck Chemicals. Antistoffer mod PCTAIRE1 (kanin polyklonale: HPA001366, Sigma), RIPK1 (610.458, BD transduktion Lab), caspase-8 (1C12, # 9746, Cell Signaling Technology), kløvet caspase-8 (# 9496, Cell Signaling Technology), phospho- caspase-8 (Ser387, # 710.535, Life Technologies), FADD (06-711, Millipore), phospho-FADD (# 2781, Cell Signaling Technology), Fas /CD95 (CH-11, SY-001, MBL), DR4 (H-130, Santa Cruz), DR5 (N-19, Santa Cruz), FLIP (F6550, Sigma), phospho-serin (kanin polyklonale, 61-8100, Life Technologies), p27 (mus monoklonalt G173-524: BD Pharmagen, eller kanin polyklonale C-19, Santa Cruz), HA (Rat, 3F10, Roche), HA (mus, 12CA5, Roche), Myc (mus, 9E10, Roche), beta-actin (mus monoklonalt, Sigma), alpha-tubulin (mus monoklonale, B-7, Santa Cruz) og peberrod-peroxidase-konjugerede sekundære antistoffer (GE Healthcare) blev købt fra de angivne kilder.

siRNA skærm og dataanalyse

Den Ambion Silencer menneskelige Druggable Genome siRNA Bibliotek V2 blev leveret i PPC1 celler ved omvendt transfektion i 384 godt format på 10 nM siRNA hjælp RNAiMAX (Life Technologies). Efter 48 timer blev cellerne behandlet med 3 ng /ml anti-FAS antistof (CH-11) eller DMSO i yderligere 24 timer, tid, efter hvilken levedygtighed blev aflæst under anvendelse af ATP-lite (Perkin Elmer) i en Envision Plate reader (Perkin Elmer Inc.). Rå dataaflæsninger blev normaliseret til gennemsnittet af negative kontroller inkluderet i hver plade og dubletter gennemsnit. Effekten af ​​FAS aktivering blev målt ved at beregne levedygtighed nøgletal CH-11 /DMSO for hver siRNA. En robust

Z

-Score blev derefter tildelt hver siRNA. P-værdier blev også beregnet for hver siRNA anvendelse af en 2-tail t-test under forudsætning af en normal fordeling af dataene. Til frembringelse af en endelig gen score, vi gennemsnit Z værdier af de 2 eller 3 siRNAs målrettet hvert gen samt en P-værdi under anvendelse af levedygtighed nøgletal. Værdier for siRNA’er viser høj standardafvigelse ( 0,25). Blandt dubletter af enten DMSO eller CH-11 behandlede celler blev fjernet fra analysen

plasmider

Punktmutationer af PCTAIRE1 (K194M) var fremstillet med en PCR-baseret stedrettet mutagenese fremgangsmåde under anvendelse af

Pfu

polymerase (Agilent). Ekspressionsplasmider for forskellige proteiner, blev konstrueret i pcDNA3 vektor til transfektion eller pRDI292-puro vektor til lentivirus-infektion. Passende plasmidkonstruktion blev bekræftet ved restriktionsenzymfordøjelse og DNA-sekventering. Detaljerne i primersekvenserne anvendt til generering af punktmutationer er tilgængelige efter anmodning.

cellelinjer og cellekultur

PPC1, DU145, MDA-MB-468, T47D, MCF7, IMR- 90, HeLa og HEK293T celler blev indkøbt fra ATCC. 267B1 og 267B1 /K-ras celler slags gaver fra Dr. Dritschilo [26]. Alle anvendte celler havde færre end seks måneders uafbrudt passage.

Cell levedygtighed assays under anvendelse af ATP-måling

Cell Titer Glo blev brugt til cellernes levedygtighed estimering. Celler blev udpladet i 96-brønds faste hvide plader ved en densitet på 5.000 ~ 10.000 celler per brønd i 100 pi komplet medium med eller uden siRNAs og dyrket i 48 timer. Cellerne blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af cytokiner eller forbindelser i 24 timer. Celle Titer Glo opløsning blev tilsat ved 100 pi per brønd, og pladerne blev holdt i mørke i 15 minutter før måling af luminescens med et luminometer (Luminoskan Ascent; Thermo Scientific).

Analyse af apoptose

Celler blev behandlet under anvendelse af et AnnexinV-PI apoptose detektion kit ifølge producentens anvisning (Life Technologies) og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af en FACS Canto indretning (Becton Dickinson).

RNA-interferens

for forbigående knockdown blev celler transficeret med siRNA-duplexer ved en omvendt transfektion metode under anvendelse Lipofectoamine RNAiMAX ifølge producentens instruktioner (Life Technologies).

Tet-inducerbare korte hårnål RNA-konstruktioner, lentivirus og infektion

PCTAIRE1 shRNA # 1 (GCTCTCATCACTCCTTCACTT), PCTAIRE1 shRNA # 2 (GACCTACATTAAGCTGGACAA), og scramble-kontrol (CAACAAGATGAAGAGCACCAA) blev klonet ind i den inducerbare pLKO-Tet-On puromycin vektor [27]. Lentivirale supernatanter blev genereret ifølge en fastlagt protokol [27]. Celler blev selekteret med 2 ug /ml puromycin (MP Biomedicals). Induktion af shRNA blev opnået ved tilsætning af 100 ng /ml doxycyclin til mediet.

Ekstraktion af totalt RNA og kvantitativ RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev isoleret fra dyrkede celler under anvendelse af RNeasy plus mini kit (Qiagen). RNA-koncentrationen blev målt spektrofotometrisk og prøver blev opbevaret ved 80 ° C indtil anvendelse med RT-PCR. RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af Superscript III (Life Technologies) og komplementære DNA-prøver blev analyseret med SYBR green-systemet (Promega). Primere specifikke for den menneskelige PCTAIRE1, PCTAIRE2, PCTAIRE3, RIPK1 og kontrol husholdning menneskelige GAPDH er angivet nedenfor

Menneskelig PCTAIRE1

Fremad:. 5’GCAGTGACCCTGGAGAGG-3 ‘

Reverse : 5’TCAAGTCCTCGTGCACAATC-3 ‘

Menneskelig PCTAIRE2

Fremad: 5’TGTTATTGGAGGGAGCCTTG-3′

Omvendt: 5’TCTCACCATCTGATGCCATTT-3 ‘

Menneskelig PCTAIRE3

Fremad: 5’ATGGCATCCACCTCCTGA-3 ‘

Omvendt: 5’TCTGCTGACATGCGACTCTT-3′

Menneskelig RIPK1

Fremad: 5’GTGTACAAGGGGCCCAACT-3 ‘

Omvendt: 5’CGGCTGTGTCTCAGTCTGTT-3′

Menneskelig GAPDH

Fremad: 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘

Omvendt:. 5’ATGGGATTTCCATTGATGAC-3 ‘

Alle forsøg blev udført i to eksemplarer og normaliseret i forhold til GAPDH niveauer

SDS-PAGE, immunoblotting og immunopræcipitation

Celler var vasket to gange med PBS og høstet med radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer indeholdende 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 5 mM NaF og EDTA-fri COMPLETE protease cocktail tablet (Roche). Celler blev efterladt på is i 20 minutter og centrifugeret ved 14.000 x

g

i 10 minutter. Proteinkoncentrationer blev målt under anvendelse af et Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad). For Laemmli SDS-PAGE blev proteiner separeret på SDS-PAGE 4-15% gradientgeler (Life Technologies) og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). Phos-tag SDS-PAGE blev udført med færdigstøbte phostag geler (12,5% polyacrylamidgeler indeholdende 50 uM Phos-tag acrylamid, Wako). Efter elektroforese blev phos-tag acrylamidgeler vasket med rindende puffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS) indeholdende 5 mM EDTA i 10 minutter under forsigtig omrystning, og derefter vasket igen med løbebuffer uden EDTA i 10 min efter til fabrikantens protokol (Wako Chemical). Proteiner blev overført til nitrocellulosemembraner. Efter blokering i 1 time i Tris-bufret saltvand (TBS) med 0,05% Tween-20 og 5% fedtfri tørmælk blev membraner inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer fortyndet i blokeringspuffer. Membraner blev skyllet tre gange i TBS med 0,05% Tween-20 og inkuberet med sekundære HRP-konjugeret antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. En forøget kemiluminescens (ECL) -metoden (GE Healthcare) blev anvendt til detektion.

I immunpræcipitering (IP) blev celler lyseret i 1% NP40-puffer indeholdende 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl , 0,1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5 mM NaF og EDTA-fri COMPLETE protease cocktail tablet. Tre milligram protein lysat blev anvendt til immunpræcipitering med inkubering natten over ved 4 ° C, og 2 ug af det givne antistof. Den følgende dag blev 30 pi protein G-harpiks (Life Technologies) tilsat og inkuberet i 1 time ved 4 ° C. VP blev derefter vasket fire gange med lyseringsbuffer hvorefter prøvepuffer blev tilsat, og perlerne blev kogt i 10 minutter ved 100 ° C.

Klonogen assay til evaluering af Fas /TRAIL følsomhed

celler blev udsået i 35 mm skåle på 1,0 x 10

5 celler per brønd og derefter transfekteret med kontrol eller PCTAIRE1-targeting siRNA’er. Efter 2 dage agonistisk anti-Fas ab (CH-11) eller TRAIL blev tilsat, og cellerne blev dyrket i 3 dage, inden der fastsættes og farvning med 0,5% krystalviolet farvestof. Til fiksering blev celler inkuberet med methanol ved -20 ° C i 20 minutter, vasket med PBS og inkuberet med 0,5% krystalviolet farvestof i 25% methanol i 15 minutter.

FACS-analyse af Fas /DR4 /DR5 ekspression på celleoverfladen

PPC1 og MDA-MB-468 celler (1,0 x 10

5), som blev revers-transficeret med siRNA’er rettet mod PCTAIRE1 og scramble-kontrol blev podet i 6 cm skåle. Otteogfyrre timer efter revers-transfektion blev adhærerende celler vasket en gang med PBS, fritliggende hjælp TripleExpress (Gibco), og resuspenderet i iskold FACS buffer (1% FBS i PBS). Efter centrifugering blev celler resuspenderet i FACS-buffer ved 3,0 x 10

5 celler /100 pi. Cellerne blev derefter inkuberet i mørke på is med mættende koncentrationer af phycoerythrin-mærket anti-DR4, anti-DR5 (eBioscience), FITC-mærket anti-Fas (BD Pharmagen), eller immunglobulin G1 isotypekontrolantistoffer i 1 time som pr producentens anvisninger. I alt 10.000 hændelser blev analyseret ved flowcytometri for hver behandling.

Synkronisering

For at arrestere HeLa-celler i den tidlige S-fase, blev anvendt dobbelt thymidin blok metoden [10]. Kort fortalt, thymidin (2,5 mM) blev tilsat til kulturen i 14 timer, og celler blev frigjort fra blokken ved vask tre gange med PBS. Efter 8 timer blev thymidin igen tilsat. Efter en anden behandling i 14 timer, blev cellerne frigjort fra blokken.

kvantitativ måling og statistisk analyse

Midler og standardafvigelse (SD) blev beregnet statistisk fra tre bestemmelser. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans af forskelle mellem forskellige prøver blev bestemt ved t-test. P 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Identifikation af PCTAIRE1 kinase af siRNA bibliotek screening

For at identificere kandidat undertrykkere eller forstærkere af Fas-induceret apoptose i tumorceller, vi optimeret to typer af screening med højt gennemløb (HTS) assays for siRNA biblioteksscreening. Brug PPC1 prostatacancerceller, vi bestemt, at stimulation med lav dosis anti-Fas antistof CH11 (3 ng /ml) resulterede ikke i cytotoksicitet, mens stimulation med høj dosis anti-Fas-antistof (25 ng /ml) dræbte disse tumorceller. Brug kontrol siRNA’er til validering af analysen, vi konstateret, at 3 af 3 siRNAs målrettet FLIP sensibiliserede PPC1 celler til lav-dosis (3 ng /ml) anti-Fas antistof mens 3 af 3 siRNAs målrettet FADD hæmmede PPC1 drab fremkaldt af højdosis ( 25 ng /ml) anti-Fas-antistof. Efter at have brugt disse kontrol siRNA’er at optimere HTS analyser til en Z ‘faktor 0,5, derefter sigtet vi et bibliotek med 16.800 siRNAs målretning 5.600 gener (3-fold dækning), som udgør den såkaldte “druggable genom”. PPC1 celler i 384 brønds plader blev “reverse” transficeret med siRNAs, derefter 2 dage senere CH11 antistof blev tilsat, og cellelevedygtighed som vurderes ved anvendelse af en bioluminescensassay at bestemme ATP-niveauer en dag senere (S1 Fig., S1 datasæt). Virkningen af ​​FAS aktivering blev målt ved at beregne levedygtighed nøgletal Fas /DMSO for hver siRNA. Til frembringelse af en endelig gen score, vi gennemsnit Z værdier af de 2 eller 3 siRNAs målrettet hvert gen. For den lave dosis (3 ng /ml) skærm, blev PCTAIRE1 kinase identificeret som en suppressor af Fas-induceret apoptose.

Gene knockdown af PCTAIRE1 sensibiliserer cancerceller til TNF-familie cytokiner

for yderligere at vurdere, hvilken rolle PCTAIRE1 på TNF-familie cytokiner i prostatakræft PPC1 celler, vi brugte siRNAs rettet PCTAIRE1. Immunoblotting blev først udført for at bekræfte knockdown på proteinniveauet (Fig. 1A). Ved hjælp af 3 siRNAs der med succes bankede ned PCTAIRE1 ekspression observerede vi sensibilisering af PPC1 celler til anti-Fas-antistof (CH-11), TRAIL, og TNF-alfa (fig. 1B og C, og S2A Fig.). AnnexinV farvning eksperimenter uafhængigt bekræftet disse resultater, og dokumenteret, at en apoptotisk mekanisme var involveret (fig. 1D). I modsætning til Fas (CH-11), TRAIL og TNF, havde PCTAIRE1 knockdown ikke sensibiliserer PPC1 celler til andre celledødsveje, herunder stimuli som initierer apoptoseveje fra det endoplasmatiske reticulum (thapsigargin) og mitochondrier (staurosporin) (S2B Fig. Og data ikke vist). Ensartede konklusioner når klonogen overlevelse blev vurderet, med alle 3 siRNAs målrettet PCTAIRE1 sensibiliserende PPC1 celler til Fas (CH-11) og TRAIL (fig. 1E og F). I modsætning hertil siRNA-medieret knockdown af PCTAIRE2 eller PCTAIRE3 ikke sensibiliserer PPC1 celler til Fas, TRAIL eller TNF (S2C-H Fig.). Vi vurderede også virkningen af ​​PCTAIRE1-knockdown på kemosensitivitet af celler til cisplatin og paclitaxel. PPC1 celler med PCTAIRE1-knockdown blev inkuberet med forskellige koncentrationer af cisplatin og paclitaxel, og vurdering af cellelevedygtighed viste ingen signifikante synergistiske cytotoksiske virkninger i PPC1 celler (S2I-N Fig.). Vi vurderes yderligere siRNA-medieret PCTAIRE1-knockdown i andre cellelinier, og fandt, at PCTAIRE1-knockdown i brystcancer MDA-MB-468 celler var effektivt til at genoprette følsomhed over for Fas eller TRAIL (S3A-F Fig.). Men som det ville forventes for heterogenitet ses i humane cancere, virkningen af ​​PCTAIRE1 knockdown var ikke ensartet ved, at mindre robuste virkninger blev observeret med human brystcancer MCF7-celler (S3G-I Fig.).

( A) PPC1 celler blev transficeret med scrambled RNA eller tre forskellige siRNAs målrettet PCTAIRE1 (siRNAs 1472, 1566, 1656). Lysater fra celler ved 48 timer efter siRNA transfektion blev fremstillet, normaliseret for samlet proteinindhold, og portioner blev analyseret ved immunoblotting under anvendelse af anti-PCTAIRE1 (øverst) eller anti-a-tubulin (nederst) antistoffer. (B, C) PPC1 celler blev transficeret med kontrol-RNA (lilla “x”) eller forskellige siRNA’er rettet mod PCTAIRE1 (blå diamanter, 1472, røde firkanter, 1566, grønne trekanter, 1656). Efter 48 timer blev cellerne stimuleret med enten anti-Fas-antistof (CH-11) (B) eller TRAIL (C) ved forskellige koncentrationer som vist. Efter 24 timer blev cellulære ATP-niveauer målt som en surrogat indikator for cellelevedygtighed under anvendelse Cell Titer Glo reagenser, og dataene udtrykkes som forholdet mellem celler dyrket med og uden anti-Fas (B), og TRAIL (C). (D) Apoptosis analyser blev udført ved anvendelse af en annexinV kit. PPC1 celler blev transficeret med scramble RNA af siRNA’er rettet mod PCTAIRE1. Efter 48 timer blev celler behandlet med anti-Fas-antistof (100 ng /ml) eller TRAIL (50 ng /ml) i 4 timer. * P 0,05, *** P 0,001 ved t-test. Alle data repræsenterer middel ± SD (n = 3). (E, F) Klonogene overlevelse assays. PPC1 celler blev podet i 6 brønd (35 mm) retter på 1,0 x 10

5 celler per brønd og derefter reverse-transficeret med scramble-kontrol eller PCTAIRE1 målretning siRNA’er som angivet. Efter 48 timer, anti-Fas-antistof (E, 10 ng /ml) eller TRAIL (F, 20 ng /ml) blev tilsat og celler blev dyrket i 3 dage, inden der fastsættes og farvning med 0,5% krystalviolet farvestof. (G, H) PPC1 celler blev transficeret med kontrol-RNA eller tre forskellige siRNAs målrettet PCTAIRE1. Efter 48 timer blev cellerne stimuleret med Fas (G, 10 ng /ml) eller TRAIL (H, 10 ng /ml). Efter 3 timer blev cellelysater fremstillet, normaliseret for samlet proteinindhold og analyseret ved immunoblotting under anvendelse af et antistof specifikt for spaltet caspase-8. Den delvist spaltede 43/41 kDa bands og fuldt spaltet 18 kDa bånd er angivet, som er molekylvægtmarkører (kDa). Blottet blev probet igen med beta-actin antistof som en loading kontrol. (I) PPC1 celler blev transficeret med scramble-kontrol eller siRNA målrettet PCTAIRE1 (si-1472). Efter 48 timer blev celler eller ikke blev stimuleret med anti-Fas-antistof (CH-11, 10 ng /ml). Efter 3 timer blev cellelysater høstet og immunudfældet med anti-caspase 8-antistof, efterfulgt af immunoblotting med de angivne antistoffer. De røde pilespidser indikerer ikke-specifikke bånd.

Aktiveringen af ​​caspase-8 induceret af TNF-familie dødsreceptorer ledsages af proteolytisk behandling af ~ 50 kDa pro-caspase-8-molekylet i første omgang at give ~ 43/41 kDa delvist bearbejdede molekyler og endelig at producere de ~ 18 og ~ 10 kDa underenheder af det katalytisk aktive protease. Vi anvendte immunoblotting at overvåge virkningerne af siRNA-medieret knockdown af PCTAIRE1 på den proteolytiske behandling af pro-caspase-8. SiRNA-medieret inaktivering af PCTAIRE1 i PPC1 celler faktisk forøget Fas- og TRAIL-induceret behandling af caspase-8 sammenlignet med kontrol-RNA (fig. 1G og H). Vi observerede også samlingen af ​​FADD /caspase-8-kompleks (død-fremkaldende signaler kompleks: DISC) i Fas-behandlede PPC1 celler med PCTAIRE1 knockdown (Fig 1I.). Omvendt knockdown af caspase-8 confered Fas-resistens på PPC1 celler med PCTAIRE1-knockdown (data ikke vist).

siRNA-medieret PCTAIRE1-knockdown virkninger på extrinsiske celledød pathway blev også reproduceret under anvendelse tetracycline- inducerbare shRNA vektorer indført ved lentivirus infektion [27]. I PPC1 celler, som blev stabilt inficeret med to forskellige shRNAs målrettet PCTAIRE1 (shRNA # 1 og # 2), dyrkning med tetracyclin-analog doxycyclin resulterede i reducerede PCTAIRE1 proteinniveauer (Fig. 2A). Korrelerer med disse reduktioner i PCTAIRE1 proteinet, doxycyclin gendannet også PPC1 følsomhed over for Fas og TRAIL, som angivet ved cellelevedygtighed analyseresultater (fig. 2B-E). Lignende resultater blev opnået med to andre tumorcellelinier (MDA-MB-468 og DU145 celler), der blev stabilt transduceret med tetracyclin-inducerbare PCTAIRE1 shRNA vektorer (S4 og S5 fig.). Ud fra disse resultater konkluderer vi, at PCTAIRE1 giver Fas /TRAIL modstand epitel kræftceller.

(A) PPC1 celler stabilt indeholder inducerbare shRNAs målrettet forskellige steder på PCTAIRE1 mRNA (shRNA # 1, # 2) eller scramble- kontrol blev dyrket i 48 timer med doxycyclin (Dox, 100 ng /ml). Proteinlysater blev genereret, normaliseret til total proteinkoncentration, og analyseret ved SDS-PAGE /immunoblotting under anvendelse af antistoffer for PCTAIRE1 (øverst) og beta-actin (bottom). (B, C) PPC1 celler blev dyrket med (ON) eller uden (OFF) 100 ng /ml Dox i 48 timer, derefter stimuleret med forskellige koncentrationer af enten anti-Fas-antistof CH-11 (B) eller TRAIL (C). Efter 24 timer blev cellulære ATP-niveauer målt, og dataene udtrykt som et forhold i forhold til celler dyrket uden anti-Fas eller TRAIL (gennemsnit ± SD, n = 3). (D, E) Klonogene overlevelse analyser. PPC1 celler, der stabilt indeholder inducerbar shRNAs (scramble eller shRNA # 2) blev dyrket med (ON) eller uden (OFF) 100 ng /ml Dox i 48 timer og derefter stimuleret med anti-Fas-antistof (CH-11, 10 ng /ml) eller TRAIL (20 ng /ml). Celler blev dyrket i 3 dage før fastsættelse og farvning med 0,5% krystalviolet farvestof.

Transformerede celler er fortrinsvis afhængige PCTAIRE1 for resistens over for spor

Blandt de TNF-familie cytokiner, TRAIL betragtes som den mest lovende våben til bekæmpelse af kræftceller, fordi TRAIL følsomhed observeres overvejende tumor, men ikke normale celler [28,29]. Desuden histopatologiske analyser af primære prostata og bryst væv afslørede, at PCTAIRE1 immunfarvning var meget lav i normale væv, men markant højere i kræft [10]. Disse iagttagelser antyder, at PCTAIRE1-knockdown ikke ville påvirke den ydre celledød pathway i normale celler. For at understøtte denne mulighed undersøgte vi knockdown af PCTAIRE1 i den humane diploide fibroblast line IMR-90. I disse celler havde siRNA-medieret PCTAIRE1-knockdown ikke påvirke TRAIL følsomhed som vurderet ved måling ATP-niveauer (fig. 3A og D). For yderligere at undersøge, hvilken rolle PCTAIRE1 i normal versus transformerede celler, vi anvendte PCTAIRE1-siRNA’er til udødeliggjort 267B1 normale prostata epitelceller og deres K-ras (V12) forvandlet isogene modstykke, 267B1 /K-ras celler [26], efterfulgt af bekræftelse af siRNA virkningsfuldhed ved anvendelse immunoblotting (fig. 3B og C). Følsomhed over for TRAIL blev vurderet ved ATP-niveauer, som er angivet, at 267B1 /K-ras celler med PCTAIRE1 knockdown var bemærkelsesværdigt følsomme over for Trail i forhold til at styre 267B1 /K-ras celler med scramble-siRNA (Fig. 3F). I modsætning hertil ikke-transformerede 267B1 celler med PCTAIRE1-knockdown viste ingen signifikant ændring i TRAIL følsomhed sammenlignet med scramble-kontrolceller (fig. 3e). Disse resultater antyder, at de transformerede celler er fortrinsvis afhængig af PCTAIRE1 for resistens over for TRAIL. Salg

(AC) humane diploide fibroblaster IMR-90 (A), 267B1 immortaliserede normale prostata-epitelceller (B), og K-ras transformeret 267B1 (267B1 /K-ras) celler (C) blev transficeret med røræg RNA eller tre forskellige siRNAs målrettet PCTAIRE1 (siRNA’er: si-1472, si-1566, si-1656). Lysater af celler 72 timer efter transfektion blev fremstillet og analyseret ved immunoblotting ved anvendelse af kanin-anti-PCTAIRE1 (øverst) eller anti-beta-actin (nederst) antistoffer. (D-F) IMR-90, blev 267B1 og 267B1 /K-ras-celler transficeret med siRNA’er. Efter 48 timer blev celler stimuleret med TRAIL ved forskellige koncentrationer som vist. Efter 24 timer blev cellulære ATP niveauer målt, og dataene udtrykkes som et forhold mellem celler dyrket med og uden TRAIL (gennemsnit ± SD, n = 3)

PCTAIRE1-knockdown modulerer RIPK1 proteinekspression.

at udforske den mekanisme, hvormed PCTAIRE1 undertrykker apoptose induceret af TRAIL /Fas undersøgte vi virkningen af ​​PCTAIRE1 knockdown på ekspressionen af ​​forskellige proteiner, der har været impliceret i TNF-familien cytokinreceptor signalvejen. Fordi PCTAIRE1-knockdown sensibiliserede PPC1 celler ihjel receptor stimuli (Fas, TRAIL), men ikke midler, der udløser andre celledød veje, vi mistanke om, at PCTAIRE1 kan blokere en proksimal skridt i Fas og TRAIL receptor signalering. Den kritiske begivenhed for at indlede apoptose pathway induceret af TNF-familie cytokiner er aktiveringen af ​​caspase-8, som kræver adapter protein FADD, og ​​modsætter FLIP. Som vist ovenfor PCTAIRE1-knockdown aktiverede caspase-8 behandling (fig. 4A), men PCTAIRE1-knockdown påvirkede ikke ekspressionsniveauerne af FADD, procaspase-8 eller c-flip (S6A Fig.). Måling af celleoverflade niveauer (ved FACS) eller total cellulære niveauer (ved immunoblotting) af Fas, TRAIL-receptor 1 (død receptor 4, DR4) eller TRAIL-receptor 2 (dødsreceptor 5, DR5) viste heller ingen reproducerbar forskel mellem kontrol- og PCTAIRE1-knockdown celler (S6A og B fig., og data ikke vist). Desuden mens fosforylering af caspase-8 og FADD er angiveligt involveret i resistens mod TNF familie cytokiner [11,12,30], vi har registreret nogen bemærkelsesværdig ændring i phosphoryleringsniveauerne af caspase-8 (Ser387) eller FADD (Ser194) i PCTAIRE1 overudtrykker /knockdown PPC1 celler (S6c-F fig.).

(A) PPC1 celler blev transficeret med kontrol-RNA eller tre forskellige siRNAs målrettet PCTAIRE1. Efter 48 timer blev cellelysater fremstillet med RIPA-buffer, normaliseret for totalt proteinindhold og analyseret ved immunoblotting under anvendelse af de angivne antistoffer. (B) PPC1 celler blev transficeret med angivne siRNA’er i 48 timer, hvorefter cellelysater blev opsamlet i 1 x Laemmli-buffer og underkastet immunblotting analyse for RIPK1 (øverst) og beta-actin (midten). (C, D) PPC1 celler blev transficeret med de anførte siRNA’er. Efter 48 timer blev celler behandlet med proteasominhibitor MG-132 (10 uM) i 5 timer før fremstillingen af ​​cellelysater (C: 1x Laemmli-buffer, D: RIPA buffer). (E) PPC1 celler blev transficeret med kontrol-RNA eller siRNA målretning RIPK1. Efter 48 timer blev cellelysater fremstillet i RIPA-buffer, normaliseret for totalt proteinindhold og analyseret ved immunoblotting under anvendelse af de angivne antistoffer. (F, G) PPC1 celler blev transficeret med kontrol-RNA eller siRNA målretning RIPK1. Efter 48 timer blev cellerne stimuleret med enten anti-Fas-antistof (CH-11) (F) eller TRAIL (G) ved forskellige koncentrationer som vist.