PLoS ONE: Hedgehog Signaling Regulerer Telomerase revers transkriptase i Human Cancer Cells

Abstrakt

The Hedgehog (HH) signalvejen er kritisk for normal fosterudvikling, væv mønster og celledifferentiering. Afvigende HH signalering er involveret i flere kræftformer hos mennesker. HH signalering involverer en multi-protein kaskade aktivere GLI proteiner, der transskriptionelt regulerer HH målgener. Vi har tidligere rapporteret, at HH-signalering er væsentlig for human coloncancer celleoverlevelse og inhibering af dette signal inducerer DNA-ødelæggelse og omfattende celledød. Her rapporterer vi, at HH /GLI akse regulerer human telomerase revers transkriptase (hTERT), som bestemmer reproduktionspotentiale af cancerceller. Undertrykkelse af GLI1 /GLI2 funktioner ved en C-terminal afkortet GLI3 repressor mutant (GLI3R) eller ved GANT61, en farmakologisk inhibitor af GLI1 /GLI2, reduceret hTERT proteinekspression i human coloncancer, prostatacancer og glioblastoma multiforme (GBM) cellelinier . Ekspression af et N-terminus slettet konstitutivt aktiv mutant af GLI2 (GLI2ΔN) øgede hTERT mRNA og proteinekspression og hTERT-promotoren drevet luciferaseaktivitet i humane coloncancer-celler, mens GANT61 inhiberede hTERT mRNA-ekspression og hTERT-promotoren drevet luciferaseaktivitet. Chromatin immunoprecipitation med GLI1 eller GLI2 antistoffer udfældede fragmenter af hTERT-promotoren i humane coloncancer-celler, som blev reduceret ved udsættelse for GANT61. I modsætning hertil ekspression af GLI1 eller GLI2ΔN i ikke-maligne 293T-celler ikke påvirkede niveauet af hTERT mRNA og protein eller hTERT-promotor drevne luciferaseaktivitet. Endvidere ekspression af GLI2ΔN øgede telomeraseenzymaktivitet, som blev reduceret med GANT61 indgivelse i humane coloncancer, prostatacancer, og GBM celler. Disse resultater identificerer hTERT som et direkte mål for HH signalvejen, og afslører en hidtil ukendt rolle HH /GLI akse i regulering af replikation potentiale af cancerceller. Disse resultater er af betydning for forståelsen af ​​de vigtige regulatoriske mekanismer, der bestemmer funktioner HH /GLI signalering i kræftceller

Henvisning:. Mazumdar T, Sandhu R, Qadan M, DeVecchio J, Magloire V, Agyeman A, et al. (2013) Hedgehog Signaling Regulerer Telomerase revers transkriptase i humane cancerceller. PLoS ONE 8 (9): e75253. doi: 10,1371 /journal.pone.0075253

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: 29, 2013; Accepteret: August 13, 2013; Udgivet: 25 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Mazumdar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne vil gerne anerkende økonomisk støtte fra NCI award RO1 CA 87.952 (JAH), og fra Cleveland Clinic. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Klassisk HH signalering initierer, når de opløselige HH-ligander, Sonic (SHH), Desert (DHH) eller indisk (IHH) HH binder deres transmembrane receptor Patched (ptch) og derved frigøre det transmembrane protein, Smoothened (Smo) fra ptch-medieret inhibering. Smo aktiverer efterfølgende GLI-familien af ​​transkriptionsfaktorer, som regulerer HH målgener. Den GLI familie af transkriptionsfaktorer omfatter GLI1, GLI2 og GLI3. I kraft af et C-terminalt aktivator og N-terminale repressordomæner, GLI2 og GLI3 har kontekstafhængig aktivator eller repressoraktivitet. GLI1 mangler repressordomæne og fungerer hovedsageligt som en aktivator [1], [2]. GLI2 har en C-terminal aktivator og N-terminale repressordomæner [3]. GLI2 er rapporteret at være den oprindelige mediator af HH signalering begivenheder, som derefter inducerer ekspressionen GLI1, hvilket yderligere øger HH målgenekspression [4]. Når HH signalvejen er aktiv, de latente cytoplasmatiske GLI proteiner translokerer til kernen, hvor de binder de GACCACCCA-lignende elementer på fortalerne for de HH-målgener [5], [6]. HH signalering regulerer cellulære begivenheder ved at modulere specifikke målgener. Under normal fosterudvikling, HH signaleringsaktivitet er afgørende, som reguleres rumligt og tidsligt resulterer i normalt væv mønsterdannelse og differentiering. Koordineret HH signalering er også involveret i cellulær proliferation og overlevelse, vedligeholdelse af stemness og bestemmelse af celle skæbne [6]. Aberrerende aktiveret HH signalering er involveret i flere humane cancere og det regulerer cancercelleproliferation, overlevelse, cancer stamceller cellefunktioner, epitelial til mesenkymale overgang og metastase [6]. Vi har rapporteret, at HH-signalering er afgørende for overlevelsen af ​​humane coloncancer-celler, samtidig med at blokere disse signaler inducerer hurtig DNA-skader, der kulminerede i en omfattende cytotoksicitet [7], [8], [9], [10]. Ubegrænset replikationspotentiale af cancerceller er tæt forbundet med cancer celleoverlevelse imidlertid rolle HH signalering i replikation potentiale af cancerceller er ikke kendt.

Mulighed for gentagelse af humane somatiske celler er begrænset af særlige heterochromatic strukturer kendt som telomerer ved enderne af lineære kromosomer [11]. Mammale telomerer er sammensat af tandemgentagelser af TTAGGG sekvenser, der udsættes for afkortning med hver DNA-replikation cyklus [12]. Konventionelle DNA-polymeraser ikke i stand til fuldt ud at replikere enderne af lineære DNA-molekyler; Derfor forventes telomere DNA at forkorte med hver DNA-replikation cyklus. Kritisk forkortede telomerer undlader at beskytte kromosomale ender resulterer i irreversibel vækst anholdelse og begrænset cellulær levetid. Derfor telomer homeostase er kritisk for celledeling og overlevelse. Telomerase, et ribonucleoprotein består af en RNA-bestanddel (TR) og en revers transkriptase-katalytiske underenhed (TERT), tilførsel af midler til telomer gentagelser og dermed regulerer cellulær replikativ potentiale [13]. I de fleste voksne celler, TR er konstitutivt til stede, men TERT udtryk undertrykkes, hvilket resulterer i begrænset spredning potentiale og cellulære levetid [14], [15]. I aktivt prolifererende celler, såsom stamceller og cancerceller, er tert-ekspression opreguleres resulterer i ubegrænset replikativ potentiale og udødelighed disse celler [16]. Menneskelig TERT (hTERT) udtryk og aktivitet er blevet påvist i 75% af humane kolorektal kræftceller, men kun 3-15% af den normale slimhinde og de omkringliggende ikke-kræftceller [17]. I koncert med dens betydning i kræft celle overlevelse, er hTERT stringent reguleres med flere aktivatorer og repressorer, hvoraf flere er blevet identificeret.

Her viser vi for første gang, at HH signalering trancriptionally opregulerer hTERT. Undertrykkelse af GLI1 /GLI2 reducerede hTERT protein niveauer i humane colon, prostata og kræft hjerne celler. Overekspression af GLI2ΔN forøgede niveauerne af hTERT mRNA, protein og hTERT-promotor-drevet luciferase (luc) aktivitet i tyktarmen kræftceller. Blokering GLI1 /2 aktivitet reduceret hTERT mRNA udtryk og den direkte interaktion mellem GLI1 /GLI2 proteiner og hTERT promotor i humane colon cancerceller. I modsætning hertil GLI1 /GLI2ΔN ekspression i ikke-kræft 293T-celler ikke ændre niveauerne af hTERT-mRNA, protein eller hTERT-promotor-luc aktivitet. Ophævelse HH signalering i cancerceller reducerede telomeraseaktivitet, som var forøget med GLI2ΔN ekspression. Disse resultater demonstrerer hTERT at være en transkriptionel mål af HH signalvejen og identificere en hidtil ukendt rolle HH /GLI akse i regulering af replikation potentiale af cancerceller. Disse resultater afslører en ny funktion af HH signalering i øge replikative evne af cancerceller. Af interesse, HH signalering regulerer hTERT i en kontekst-afhængig måde i humane cancerceller, i modsætning til ikke-maligne celler, som kan have konsekvenser i kræftmedicin.

Materialer og metoder

Cell Kultur og reagenser

HT29, SW480, HCT116 og 293T celler blev opnået fra American Type Culture Collection. C4-2, DU145, og PC3 celler slags gaver af Dr. Alexandru Almasan (Cleveland Clinic, OH). U87 celler var en slags gave fra Dr. Candece Gladson (Cleveland Clinic, OH). Cellerne blev rutinemæssigt kontrolleret ved mikroskopisk analyse af cellemorfologi, vækstkarakteristika, og reaktion på cytostatika [Annexin V /propidiumiodid (PI) farvning]. cDNA microarray gen profiler var også karakteristisk og celler blev verificeret halvårligt at være mycoplasma-fri. HT29, HCT116, SW480, c4-2, DU145 og PC3-celler blev holdt i 10% FBS-suppleret RPMI-medium, mens U87 og 293T celler blev holdt i 10% FBS-suppleret DMEM. Cellerne blev trypsiniseret og talt under anvendelse af en Z2 Coulter partikel tæller og størrelse analysator (Beckman Coulter). Til Western analyse blev antistof mod HSP90α /β indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology; anti-GLI1 og anti-hTERT antistoffer var fra Novus Biologicals, og anti-GLI2 antistof var fra Cell Signaling Technology. Anti-c-myc antistof (9E10) blev opnået fra Hybridoma Core, Lerner Research Institute. GANT61 blev købt fra Calbiochem. Dr. Graham W. Neill (Queen Mary University of London, UK) venligt forudsat GLI1 og GLI2ΔN plasmider i pBabe-Puro (PBP) pattedyrekspressionsvektor. Fuld længde hTERT-PBP-plasmidet var en gave af Dr. Robert Weinberg (Addgene plasmid # 1771).

Western blot analyse

I alt cellelysater blev fremstillet ved anvendelse af RIPA-lysepuffer (Cell Signaling Technology ). Protein (60 ug) blev opløst på 10% eller 5% SDS-PAGE geler. Adskilte proteiner blev overført til polyvinylidendifluorid-membraner og derefter blokeret i blokeringsbuffer [5% fedtfri tørmælk i 1X Tris Buffer Saline med 0,1% Tween 20 (TBS-T)] i 1 time. Membraner blev vasket i 1X TBS-T, inkuberet med primært antistof natten over ved 4 ° C, vasket og inkuberet med sekundært antistof i 1 time, og til sidst udviklet ved hjælp af Super Signal Pico substrat fra Pierce Biotechnology.

RNA-isolering og mRNA Analyse

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af Qiagen RNeasy mini kit ifølge producentens protokol. Totalt RNA blev omdannet til cDNA ved anvendelse af vilkårlige primere (iScript Select cDNA-syntese kit, BIO-RAD), og anvendes til real-time-mRNA-ekspression analyse under anvendelse 40 cykler Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR instrumentering og software. Primere blev konstrueret under anvendelse af NCBI /Primer-BLAST og anvendes til at generere PCR-produkterne. De GLI1, GLI2 og GAPDH primere blev beskrevet tidligere [9]

hTERT fremad primer:. 5′-CCTGGGTGGCACGGCTTTTGTTC-3 ‘.

hTERT revers primer: 5′-CAGCCTTGAAGCCGCGGTTGA-3′.

GLI3R og Forbigående transfektioner

myc-mærkede C-terminalen slettet konstruktion GLI3R (gave fra Dr. Ariel Ruiz i Altaba, University of Geneva Medical School, Genève, Schweiz) er tidligere blevet beskrevet (3). HT29-celler blev forbigående transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000.

(Invitrogen) med GLI3R eller den tomme vektor pCS2-MT (begavet af Dr. David Turner, på The Molecular Behavioral Neuroscience Institute, University of Michigan, Ann Arbor , MI). Cellerne blev brugt til forsøg 24 timer, 48 timer, eller 72 timer efter transfektion.

chromatin Immunfældning (chip) Analyse

De celler behandlet med GANT61 (20 uM) i 24 timer blev tværbundet i 1% formaldehyd /PBS, 10 min, 37 ° C, som blev afsluttet i glycin, 5 min. Celler blev vasket i PBS og kerneekstrakter fremstillet. Kerner blev sonikeret for at generere kromatin fragmenter (≈ 500 til 800 bp). Kromatin blev klaret med en blanding af protein A-sepharose og proteinG-sepharose, der blev blokeret med bovint serumalbumin (1 mg /ml) og laksesperm-DNA (1 mg /ml). 10% af den for-klaret kromatin blev anvendt som input kontrol. Lige mængder af de klaret kromatin-fragmenter blev immunfældet med antistoffer specifikke for GLI1 (Novus Biologicals, CO), GLI2 (Cell Signaling Technology (MA), IgG (Abcam, MA; negativ kontrol) eller histon H3 (Abcam, MA; positiv kontrol ). Fremgangsmåder blev udført som beskrevet tidligere (3, 4). de immunopræcipiterede produkter blev vasket grundigt og elueres. 30 pi af de eluerede produkter blev behandlet med RNase A og proteinase K efterfulgt af revers tværbinding og DNA-isolering. genspecifikke primere kvantificeret mængderne af hTERT og BCL-2-promotoren DNA i immunopræcipiterede fraktioner. PCR-produkter blev opløst på en 1% agarosegel, farvet med ethidiumbromid, og visualiseret under UV-lys.

de anvendte primere til chipanalyse er som følger:

hTERT-promotor frem: 5′-TGATGGGGACCGTTCCTTCCATC-3 ‘

hTERT promotor omvendt:. 5′-ACACGGCCCACCCAGGGTTTA-3′.

BCL2-promotor frem : 5′-CCGGACGCGC CCTCCC-3 ‘

BCL-2-promotor omvendt:. 5′-GGTGCCTGTCCTCTTACTTCATTCTC-3′.

Luciferase Assay

hTERT promotor fuld længde (-3337 /+ 438), og opstrøms deletionsmutanter (-1226 /+ 438 og -233 /+ 438) -driven luciferasereporteren konstruktioner blev venligst stillet til rådighed af Dr. Ralf Janknecht, University of Oklahoma Health Sciences center, OK [18] . HT29 eller 293T-celler blev transient transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) med 4 mg af luciferase reporter og 0,4 mg pRLTK (Renilla luciferase drevet af TK-promotoren). 24 timer efter transfektion blev cellerne analyseret under anvendelse af dobbelt luciferase (Promega Corporation) i overensstemmelse med producentens protokol. Luciferaseaktivitet blev detekteret under anvendelse Victor2 multilabel counter, og normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet som kontrol for transfektionseffektivitet.

Telomerase Gentag Amplifikationsprotokol (TRAP) Assay

Celler blev lyseret i 1X CHAPS lysepuffer og 0,25 ug lysaterne blev anvendt til at udføre TRAP-assay. 1 ug TS primer blev endemærket med 3 pi γ

P32ATP (Perkin Elmer) ved anvendelse af 1 pi PNK (NEB) i en 20 pi reaktion ved 37 ° C i 45 minutter og oprenset gennem en Sephadex G-25 kolonne. I hver reaktion, 2 pmol γ-32P endemærket TS-primere, og reverse primere til PCR-amplifikation blev blandet med 0,05 mM dNTP, 20 mM Tris • CI pH 8,3, 1,5 mM MgCl

2, 63 mM KCI, 0,05 % Tween 20 og 1 mM EGTA. 20 ng af RNase A blev tilsat cellelysatet i reaktioner behandlet med RNase. Telomerase-medieret primerforlængelse blev udført ved 30 ° C i 30 minutter efterfulgt af PCR-amplifikation under anvendelse af TS og reverse primere. Produkter fra TRAP-assays blev analyseret på 12,5% ikke-denaturerende PAGE. De TIFF-filer af de scannede gel billeder blev kvantificeret ved densitometri hjælp Image J software og telomerase-aktivitet blev bestemt ved hjælp af den nævnte i fabrikantens protokol for Trapeze Telomerase afsløring kit (Chemicon International Inc., MA) formel.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Resultater

HH Signaling opregulerer hTERT Expression i humane cancerceller

dysreguleret HH signalering er kendt for at fremme celleproliferation, cellecyklusprogression og celle overlevelse i humane cancerceller, og derfor blev det anset, at den aktiverede HH vej også kan spille en rolle i replikation potentiale af kræftceller. Telomerase, en vigtig regulator af replikation potentiale og tæt forbundet med cellulær proliferation og overlevelse, er derfor en stærk kandidat til regulering af aktiverede HH signalering i kræftceller. For at teste denne hypotese blev forholdet mellem HH /GLI signalering akse og telomerase-ekspression undersøgt i flere humane cancercellelinier. Vi ophævede HH /GLI signalering akse i flere humane kræftceller med farmakologiske hæmmere og målte telomerase udtryk. Menneskelig kolon kræftceller HT29 og SW480, udsat for GANT61 (20 uM), et lille molekyle hæmmer af GLI1 og GLI2 [9], i 72 timer viste reducerede steady state niveauer af GLI1, GLI2 og hTERT proteiner (fig. 1A). Ligeledes blokerer HH /GLI signalering i prostata kræftceller c4-2, DU145 og PC3 også påvist nedsat GLI1, GLI2 og hTERT proteinekspression (fig. 1A). Administration af GANT61 (20 uM) til GBM-cellelinjen U87 over en periode på 72 timer resulterede i reduceret GLI1, GLI2 og hTERT protein udtryk (fig. 1B). Vi yderligere valideret virkningerne af HH signalvej på hTERT udtryk ved genetisk modificering af HH /GLI signalvej. Vi ansat en C-terminus slettet mutant af GLI3 (GLI3R, myc-tagget GLI3C’DCla1 [3]), der undertrykker GLI1 og GLI2 aktivitet [8]. Følgende transient transfektion af GLI3R i HT29 (. Densitometrisk kvantificering i figur 2A) og HCT116 (. Fig 2B) tyktarmskræft cellelinjer, GLI1, GLI2 og hTERT proteinniveauer blev reduceret over en periode på 48 timer – 72 timer. En stabil ekspression af enten GLI1 eller GLI2ΔN, en N-terminal deleteret mutant af GLI2, med konstitutiv aktivator funktion i HT29-celler i 10 passager påviste øget hTERT-proteinekspression (fig. 2C).

A :

HT29, SW480 (koloncarcinomceller), c4-2, DU145 og PC3 (prostata cancer celler) blev behandlet i 72 timer med enten DMSO (køretøj kontrol) eller GANT61 (20 uM).

B:

U87 (GBM celler) blev behandlet med GANT61 (20 uM) til 0-72 timer. Steady-state niveauer af GLI1, GLI2 og hTERT protein blev bestemt ved Western-analyse. HSP90α /β blev anvendt som lastning kontrol

A:.

HT29,

B:

HCT116 celler blev forbigående transficeret med GLI3R (myc-mærket) i 48 t eller 72 timer, hhv. Steady-state niveauer af GLI1, GLI2 og hTERT blev bestemt ved Western-analyse repræsenteret densitometri af blots i

A

med en repræsentant hTERT blot (indsat). Ekspression af GLI3R blev bestemt under anvendelse af anti-myc-antistof.

C:

PBP tom vektor (V) eller fuld længde GLI1 cDNA i PBP (GLI1) eller GLI2ΔN i PBP (GLI2ΔN) blev stabilt udtrykt i HT29-celler, og celler blev dyrket i 10 passager. Steady-state niveauer af GLI1, GLI2 og hTERT blev målt ved Western blot. HSP90α /β blev anvendt som en loading kontrol. * P. 0,0001

GLI transkriptionsfaktorer Interact med hTERT arrangøren i humane cancerceller

Dernæst vi undersøgte den mekanisme, hvormed HH signaler regulerer ekspressionen af ​​hTERT i human cancer celler. Transkriptionel regulering af hTERT-ekspression er en fælles mekanisme for hTERT opregulering i cancerceller [19]. Da GLI proteiner er transkriptionsfaktorer, vi hypotese, at GLI1 og GLI2 transkriptionelt regulere hTERT-ekspression i cancerceller. hTERT-mRNA-ekspression blev forhøjet i både GLI1- og GLI2-overudtrykkende HT29-celler (fig. 3A). Når HT29 celler blev udsat for GANT61 (20 uM) blev hTERT mRNA niveauer faldt betydeligt i løbet af 24 timer og forblev undertrykt gennem 72 timer (fig. 3B). DU145-celler påvist nedsat GLI2 og hTERT-mRNA-niveauer, når de udsættes for GANT61 (20 uM), mens GLI1 transkript ekspression forblev uændret ved 48 timer efter behandling (fig. 3C). Ved udsættelse for GANT61 (20 uM), U87-celler påvist reduktioner i GLI1, GLI2 og hTERT-mRNA inden 24 timer (fig. 3D). Disse resultater bekræftede transkriptionel regulering af hTERT udtryk af HH signalvejen i humane cancerceller

A:.

HT29 celler stabilt udtrykker tom vektor (V), GLI1 (GLI1) eller GLI2ΔN (GLI2ΔN) blev analyseret for hTERT, GLI1 og GLI2 mRNA-ekspression bestemt af Real-Time PCR.

B:

Eksponering af HT29-celler til GANT61 (20 uM, 0-72 timer) reduceret ekspression af hTERT mRNA, bestemmes af Real-Time PCR.

C:

DU145,

D:

U87 celler blev udsat for GANT61 (20 uM, 48 timer eller 24 timer henholdsvis) og GLI1, GLI2 og hTERT mRNA blev målt ved Real-time PCR. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af 3 bestemmelser. * P. 0,05

For at dissekere mekanismen for transkriptionel regulering af hTERT udtryk af HH signalvej, vi øje med følgerne af HH-signalering på hTERT promotor-aktivitet i HT29-celler. Den fuld-længde hTERT-promotor-drevet luciferase (FL hTERT prom-luc) reporter og pRL-TK var transient co-transficeret ind i HT29-afledte stabile cellelinjer overudtrykker GLI1 eller GLI2 eller hTERT. Både GLI1 og GLI2ΔN udtrykkende celler demonstrerede en 4 gange stigning i hTERT-promotoraktivitet inden 24 timer af transfektion (fig. 4A). For at identificere den minimale promotor nødvendige længde for HH-afhængige effekter på hTERT-promotor-aktivitet, FL hTERT promotor (-3337 /+ 438), og opstrøms deletionsmutanter (-1226 /+ 438 og -233 /+ 438) -driven luciferase reportere blev co-transficeret ind HT29-celler efterfulgt af eksponering for enten vehikel kontrol eller GANT61 (20 uM) i 24 timer. Data viser, at -1226 /+ 438 region er den minimale krav til hTERT-promotor aktivering HH-afhængig selv, virkningerne er mindre end den FL hTERT-promotoren (fig. 4B). FL hTERT-promotor-aktivitet blev reduceret signifikant ved blokering GLI aktivitet med GANT61 (20 uM) (fig. 4B). Dernæst undersøgte vi, om de GLI transkriptionsfaktorer direkte interageret med hTERT-promotoren i cancerceller.

I silico

analyse af hTERT-promotoren afslørede 7 formodede bindingssteder for GLI familien af ​​transkriptionsfaktorer. Både GLI1 og GLI2 antistoffer udfældede fragmenter af hTERT-promotoren i chip analyser (fig. 4C). PCR amplifikation af kromatin fragmenter under anvendelse af primere specifikke for hTERT promotorregioner resulterede i amplikoner, som indeholdt mindst kernen (-226 /+ 360) hTERT-promotor verificeret ved sekventering af PCR amplikoner. Binding af GLI1 og GLI2 til hTERT-promotoren blev reduceret i nærvær af GANT61 (20 uM) i 24 timer (fig. 4D). BCL-2, tidligere rapporteret som et mål for både GLI1 og GLI2, blev anvendt som positiv kontrol (Fig 4C og 4D.)

A:.

Stabile produkter af HT29-celler (beskrevet i fig. 2C) blev co-transficeret med en fuld-længde hTERT-promotor drevne luciferase (-3337 /+ 438) reporter og Renilla luciferase (pRL-TK) konstruktioner i 24 timer. Lysater blev fremstillet, og luciferaseaktivitet bestemmes som beskrevet i Materialer og Metoder. hTERT-promotor-luciferase-aktivitet blev normaliseret mod Renilla luciferaseaktivitet og præsenteres som gennemsnit ± SD, n = 3.

B:

HT29-celler blev co-transficeret med enten den fulde længde (-3337 /+ 438) eller opstrøms slettede mutanter (-1226 /+ 438 eller -233 /+ 438) af hTERT prom-luc reportere og pRL-TK efterfulgt af udsættelse for GANT61 (20 uM, 24 timer) og bestemmelse af luciferaseaktivitet. hTERT promotor luciferaseaktiviteten blev normaliseret mod Renilla luciferaseaktivitet og præsenteres som gennemsnit ± SD, n = 3.

C:

HT29 celler blev anvendt til chip analyse ved hjælp af antistoffer specifikke for GLI1, GLI2 eller histon H3 (positiv kontrol, der anvendes til normalisering).

D:

HT29 celler behandlet med GANT61 (20 uM, 24 timer) blev ligeledes evalueret af Chip analyse. Efterfølgende Real-Time PCR anvendte primere, der flankerede promotorregionerne af hTERT eller GLI målgenet, BCL-2 (positiv kontrol). * P. 0,05

HH /GLI Signaling regulerer ikke hTERT Expression i ikke-maligne 293T Celler

Vi yderligere undersøgt, om HH signalering transkriptionelt regulerer hTERT i ikke-maligne celler. 293T-celler eksperimentelt transformeres men mangler evnen til let at danne tumorer i nøgne mus [20] og demonstrere en inducerbar HH /GLI signalering akse [21]. Vi transient transficeret 293T-celler med, enten GLI1 eller GLI2ΔN ekspressionsplasmider, og målt hTERT-ekspression ved Western-analyse. Selvom GLI1 og GLI2 protein udtryk var signifikant forhøjet i de transfekterede 293T-celler, hTERT proteinekspression forblev uændret på 48 timer og 72 timer (fig. 5A). hTERT over-udtrykkende HT29-celler blev anvendt som en positiv kontrol for hTERT proteinanalyse (fig. 5A). Vi målte hTERT transkript efter transient transfektion af GLI2ΔN i 293T-celler. Inden 48 timer af transfektion, demonstrerede 293T celler robust stigning i GLI2 mRNA og 5 gange stigning i GLI1 mRNA-niveauer, men ingen signifikant forhøjelse i hTERT mRNA-niveau (fig 5B.). Endvidere havde forbigående co-transfektion af FL hTERT prom-luc reporter og enten GLI1 eller GLI2ΔN ekspressionsplasmider ikke øge luciferaseaktiviteten i 293T-celler (fig. 5C). Disse resultater understreger de kontekstafhængige funktioner HH signalvej som selektivt opregulerer hTERT udtryk i maligne celler i modsætning til ikke-maligne celler

A:.

293T-celler var ubehandlede (UT), transient transficeret med tom vektor (V) eller GFP-mærkede GLI1 (GLI1) eller GFP-mærkede GLI2ΔN (GLI2ΔN). Angivelse af GLI1, GLI2 og hTERT blev bestemt for 48 og 72 timer ved Western-analyse. HSP90α /β blev anvendt som ladningskontrol og GFP blev anvendt til at markere eksogent udtrykte GFP-mærkede GLI proteiner. Total cellelysat fra HT29-celler, der stabilt udtrykker hTERT (HT29 + hTERT) tjente som positiv kontrol.

B:

293T celler forbigående transficeret med vektor eller GLI2 (som beskrevet i figur 5A) blev analyseret for GLI1, GLI2 og hTERT mRNA-ekspression via qPCR. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af 3 bestemmelser.

C:

293T celler forbigående cotransficeret med FL-hTERT prom-luc, renilla luceferase journalister og vektor, GLI1 eller GLI2 (som beskrevet i figur 5A). 24 timer efter transfektion blev cellerne analyseret for luciferaseaktivitet. hTERT-promotor-drevet luciferaseaktivitet blev normaliseret mod Renilla luciferaseaktivitet og er repræsenteret som gennemsnit ± SD, n = 3. * p. 0,05

HH /GLI Signaling Regulerer hTERT Enzymatisk aktivitet i humane cancerceller

Aberrant opregulering af hTERT-ekspression er forbundet med øget telomerase revers transkriptase enzymaktivitet i cancerceller. Derfor testede vi den funktionelle betydning af HH /GLI /hTERT akse ved måling telomeraseenzymaktivitet i cancerceller. TRAP-assay blev anvendt til at bestemme aktiviteten af ​​hTERT ved ændring af HH /GLI signaleringskaskade. GANT61 (20 uM) administration førte til reduceret telomeraseaktivitet med 48 timer, som blev opretholdt i op til 72 timer i HT29-celler (fig. 6A, kvantificeret i fig. S1). Omvendt stabile produkter af HT29-celler, der udtrykker GLI2ΔN vist øget telomeraseaktivitet i sammenligning med vektorkontrol, mens GLI1 over-udtrykkende celler havde en beskeden stigning i telomeraseaktivitet (fig. 6B, kvantificeret i fig. S1). hTERT over-udtrykkende celler med forhøjet telomeraseaktivitet tjente som en positiv kontrol (fig. 6B). Telomeraseaktivitet blev reduceret i DU145 celler udsat for GANT61 (0-30 uM) i 48 timer (fig. 6C). U87-celler viste også nedsættelser i telomeraseaktivitet inden 48 timer af udsættelsen for GANT61 (20 uM), som blev opretholdt indtil 72 timer (fig. 6D). Disse observationer viser, at HH signalering opregulerer både hTERT udtryk og telomerase-aktivitet i humane cancerceller

A:.

HT29 celler blev behandlet med GANT61 (20 uM) for 0-72 timer, og lysater blev ekstraheret med mellemrum for TRAP analyse. 100 bp DNA-stige blev anvendt som en molekylær markør (M).

B:

HT29 celler, der stabilt udtrykker vektor (V), GLI1 eller GLI2 (GLI2ΔN) (beskrevet i figur 3A) blev evalueret for telomeraseaktivitet ved TRAP-assay. hTERT over-udtrykkende celler blev anvendt som positiv kontrol.

C:

U87 og

D:. Salg DU145-celler blev behandlet med GANT61 (0-30 uM; 0-72 timer) og telomeraseaktivitet blev analyseret af TRAP-assay

diskussion

HH signaleringsaktivitet er essentiel for normal embryonisk udvikling, hvor det regulerer celledifferentiering og dannelse organ i en gradient-afhængig måde [22]. HH signalering regulerer celleproliferation ved transkriptionelt modulerende gener, der styrer cellecyklusprogression såsom cyclin D, cyklin E og også af ptch-medieret beslaglæggelse af cyklin B i cyctoplasm [23], [24], [25]. I den voksne stadium, aktiv HH signalering fortsætter i en lille delmængde af celler, der bibringer regenerativ potentiale for de modne organer [26]. Dysregulering af HH-signalering er blevet rapporteret i flere humane cancere, herunder basalcellecarcinom [27], [28], medulloblastom [1], [29], rhabdomyosarcom [30], gliom [1], pancreas adenocarcinom [31], [ ,,,0],32], [33], prostatacancer [34] og coloncarcinom [7], [8], [9], [10]. I kræftceller, autokrine ligand-afhængige og onkogen-drevne ligand-uafhængig mekanismer opretholde en aktiv HH signaleringskaskade. Afvigende HH aktivitet driver tumordannelse og tumor vedligeholdelse ved at inducere pro-overlevelse signaler og blokering apoptotiske signaler i kræftceller [9], [35]. En anden kendetegnende for kræft er ubegrænset spredning potentiale af cancerceller resulterer i udødelighed, men et link til dysreguleret HH signalering var ikke kendt.

Telomerer er specialiserede nukleoprotein- strukturer på de kromosomale ender, der er vigtige for kromosomal stabilitet og udødelighed celler. Normale somatiske celler støder på en gradvis nedslidning af telomer længder med hver DNA-replikation cyklus derved begrænse cellulær levetid. Normale stamceller og kræftceller undslippe denne kontrol og genopbygge deres telomer længder ved øget telomerase-aktivitet. Telomerase er et ribonukleoprotein bestående af human telomerase revers transkriptase-enzym, hTERT og telomerase RNA, hTR [36], [37]. I kræftceller, er hTERT udtryk afvigende restaureret fører til øget telomerase aktivitet, der vedligeholder telomer længde og giver ubegrænset replikation potentiale. hTERT udtryk og telomerase aktivitet har en tæt tilknytning [33] med menneskelige kræftformer [17], [38]. Transformation af telomerase-negative normale celler in vitro kræver hTERT udtryk [39], afgrænse hTERT udtryk som en hastighedsbegrænsende trin i telomer længde homeostase og cellulær transformation. Reguleringen af ​​hTERT-ekspression er blevet grundigt undersøgt og er blevet identificeret talrige positive og negative regulatorer [40], [41].

I denne undersøgelse har vi vist for første gang, at HH signalvejen sikrer ubegrænset replikation potentiale af kræftceller ved at regulere hTERT udtryk og aktivitet. I multiple humane cancercellelinier, herunder tyktarms-, prostata- og hjerne, undertrykkelse af GLI1 og GLI2 ekspression under anvendelse GANT61, et lille molekyle inhibitor resulterede i reduceret ekspression af hTERT-mRNA, protein og enzymaktivitet. Dette fund angivet en regulerende akse mellem HH signalering og hTERT i humane cancerceller. Ved hjælp af en genetisk tilgang til at undertrykke GLI1 og GLI2 hjælp GLI3R, kunne hTERT udtryk også inhiberes i tyktarmen kræftceller. Tvunget udtryk for GLI1 eller et grundlæggende aktiv mutant af GLI2 udtryk øget hTERT mRNA og protein i humane colon cancerceller demonstrerer HH /GLI-medieret regulering af hTERT udtryk.