PLoS ONE: Dacomitinib, en Irreversible Pan-ErbB Inhibitor Markant ophæver Vækst i hoved-halscancer Modeller, der udviser lav Response to Cetuximab

Abstrakt

Aberrant epidermal vækstfaktor (EGF) signalering er forbundet med tumorvækst i pladecellekræft i hoved og hals hos mennesker (HNSCC), og er en stor fokus på målrettet terapi. Cetuximab, et monoklonalt antistof mod EGFR, har været en succes at forlænge overlevelsen, men har kun 10% tumor krympning svarprocent i et klinisk miljø. Målet med denne undersøgelse var at sammenligne dacomitinib (PF-00.299.804), en næste generation lille molekyle tyrosinkinaseinhibitoren der irreversibelt blokerer flere Hendes familie receptorer (HER-1 (EGFR), HER-2 og HER-4 tyrosinkinaser), til cetuximab, den nuværende FDA godkendte anti-EGFR medicin for HNSCC og erlotinib, en EGFR specifikke lille molekyle tyrosinkinaseinhibitoren. Dacomitinib, erlotinib og cetuximab blev testet i et panel af 27 HNSCC cellelinier. Behandling med 100 ug /ml cetuximab eller 1 uM af erlotinib inhiberede vækst med mindst 50% i 7/27 cellelinjer, mens behandling med 1 uM af dacomitinib havde lignende vækstinhibering i 17/27 linier. Cellelinier, der repræsenterer tre niveauer af følsomhed over for dacomitinib blev yderligere undersøgt ved hjælp af Western blotting, cellecyklus og apoptose analyse. Behandling med 100 nM dacomitinib reduceret EGFR aktivitet og nedstrøms AKT og ERK veje mere effektivt end behandling med 100 ug /ml cetuximab i alle ti testede linier. Selvom begge forbindelser inducerede apoptose på samme niveau, dacomitinib forårsagede større G0 /G1 anholdelse. Følsomhed over for EGFR blokade var forbundet med niveauer af EGFR og ERK og var ikke forbundet med fælles onkogene mutationer og kopital variationer. Phosphoryleret og total EGFR og ERK-niveauer korrelerer med følsomhed over for både cetuximab og dacomitinib. Tre af de fire linjer i udsøgt følsom gruppe havde de højeste niveauer af phosphoryleret og total EGFR og ERK blandt de ti linjer valgt, mens de tre resistente linjer kollektivt havde de laveste niveauer. Hverken Pakt eller Takt var forbundet med følsomhed

Henvisning:. Ather F, Hamidi H, Fejzo MS, Letrent S, Finn RS, Kabbinavar F, et al. (2013) Dacomitinib, en Irreversible Pan-ErbB Inhibitor Markant ophæver Vækst i hoved-halscancer Modeller, der udviser lav Response to Cetuximab. PLoS ONE 8 (2): e56112. doi: 10,1371 /journal.pone.0056112

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: April 23, 2012; Accepteret: 8. januar 2013; Publiceret: 6 Feb 2013

Copyright: © 2013 Ather et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. SL er ansat i Pfizer. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Planocellulært karcinom i hoved og hals (HNSCC), som består af kræft oprindelse i den orale og nasale hulrum, strubehoved, svælg, læbe og bihuler, er den sjette mest almindelige kræftform i verden med en incidens oversteg 500.000 sager årligt [1], [2]. På trods af den udviklende model for multimodalitet management integrere kirurgisk indgreb, kemoterapi og strålebehandling, samlede overlevelse forbliver fattige med en 5-års relativ overlevelsesrate under 50% (SEER HNSCC statistik). Hoved- og halskræft ledelse har et betydeligt potentiale for udnyttelse af målrettede biologiske behandlinger, en strategi, der har gjort betydelige fremskridt i behandlingen af ​​andre histologier herunder kræft i bryst [3], kolon [4], og lungekræft [5] . Den primære forårsagende faktor for lunge- og hoved og halscancer er rygning, og både have ensartede molekylære karakteristika, som er blevet impliceret i patogenesen af ​​sygdom, såsom en nøglerolle human epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) i tumorvækst.

EGFR, som er overudtrykt i et betydeligt flertal (op til 80-100%) af HNSCC, er af prototypen receptoren af ​​HER tyrosinkinase receptorfamilie, som omfatter HER1 /ErbB-1 /EGFR, HER2 /neu /ErbB-2, HER3 /ErbB-3 og HER4 /ErbB-4 [6]. Binding af en af ​​dens syv ligander (som omfatter EGF og TGF-alpha) inducerer homodimerisering og heterodimerisering med et andet familiemedlem og phosphorylering på flere tyrosinrester i det C-terminale domæne [7]. Binding af specifik ligand, såsom epidermal vækstfaktor (EGF) og transformerende vækstfaktor (TGF-alpha) til EGFR, resulterer i receptordimerisering og initiering af intracellulære signalveje. Major nedstrøms signalering er via Ras-Raf-MAPK-vejen. Aktivering af Ras initierer en flertrins phosphorylering kaskade, der fører til aktivering af MAPK’er, ERK1 og ERK2, hvilket i sidste ende regulere transkription af molekyler involveret i celleproliferation [8]. Et andet vigtigt mål i EGFR signalering er phosphatidylinositol 3-kinase (P13K) og den nedstrøms protein-serin /threonin-kinase Akt. Sidstnævnte proteinkinase transducerer molekylære signaler, som udløser afgørende skridt til cellevækst og overlevelse [8], [9].

Aberrant aktivering af EGFR og dens downstream pathways har været impliceret i flere maligniteter [10]. Overekspression af EGFR i HNSCC har været forbundet med lavere responsrater til standard kemoterapi og øget tilbagefald og resistens over for strålebehandling [11], [12], [13]. Adskillige forbindelser målrettet mod EGFR har kunnet trænge ind klinisk praksis i cancer medicin herunder små molekyler, der binder tyrosinkinasedomænet af EGFR såsom gefitinib [14] (AstraZeneca, lungekræft) og erlotinib [15] (OSI /Genentech, lunge og pancreascancer) og de monoklonale antistoffer cetuximab [16] (BMS /Imclone, kolorektal, lunge- og hoved-halskræft) og panitumumab [17] (Amgen, colorectal cancer), der binder sit ekstracellulære domæne.

potentialet i EGFR- rettet terapi til behandling af patienter med HNSCC er blevet valideret i de senere forsøg, hvor patienter, der fik cetuximab og strålebehandling påviste forbedret overlevelse og locoregional kontrol, i modsætning til behandling med stråling alene [16]. Tilsvarende forbedringer blev observeret ved tilsætning af cetuximab til platinbaseret terapi i det ekstreme forsøg [18]. Men stigningerne i overlevelse og tumor kontrol som følge af tilsætning af cetuximab i disse forsøg er stadig beskedne, ofte målt i måneder eller uger. Derfor identifikation af prædiktive markører til forbedret patient udvælgelse samt udvikling af mere effektive midler rettet mod denne vigtige vej er nødvendige for at opnå forbedrede resultater i HNSCC patienter.

En af grundene respons på EGFR-rettet terapi kan være lav er samarbejdet og signalering redundans mellem forskellige medlemmer af ErbB-receptor familien [19]. Trods inhibering af selv den mest højt udtrykt familiemedlem (som det er tilfældet, når cetuximab hæmmer EGFR), kan proliferation forblive uhindret fordi alternativ signalering fra andre receptorer fastholder aktiveringen de fælles downstream pathways deles af ErbB-receptor familiemedlemmer. Således målrette flere medlemmer af ErbB-receptor-gruppen er en rationel tilgang, især i fag, hvis sygdom har i første omgang udviklet eller har udviklet resistens over for cetuximab. Dette begreb er støtte fra brystkræft patienter, som oplevede tumor progression efter behandling med trastuzumab (Herceptin, Genentech), et monoklonalt antistof rettet mod HER2, har vist reaktioner på den dobbelte EGFR og HER2 tyrosinkinaseinhibitoren lapatinib (Tykerb, GSK) [20] .

Dacomitinib (Pfizer) er en anden generation Pan-ErbB-inhibitor, der binder irreversibelt flere medlemmer af HER-familien, herunder ErbB-1, ErbB-2 og ErbB-4 [21]. Væsentlige in vitro-responser blev observeret med lave koncentrationer af dacomitinib i lungekræft cellelinier resistente over for gefitinib [22], og i brystcancercellelinier resistente over for trastuzumab og lapatinib [23]. I klinikken, et fase I dosis optrapning studie med patienter med fremskredne maligne solide tumorer viste godt tolererede doser med betydelig antitumoraktivitet [24]. Seneste fase I og II forsøg i fremskreden NSCLC har vist lovende klinisk aktivitet målt ved stabilisering sygdom og forbedret progressionsfri overlevelse hos patienter, der skred på platin terapi og var tidligere behandlet med erlotinib [25]. Med sine forbedrede farmakokinetiske egenskaber, herunder øget biotilgængelighed, halveringstid, og lavere clearance i forhold til første generation irreversible Pan-ErbB hæmmere som CI-1033, dacomitinib er et attraktivt middel til potentiel klinisk brug i HNSCC [21]. Målet med den aktuelle undersøgelse var at bestemme in vitro anti-spredning virkninger af Dacomitinib i HNSCC cellelinjer. Dette omfatter belysning af mekanismer, der forklarer aktiviteten ErbB rettet terapi i HNSCC cellelinje modeller samt benchmarking dets effektivitet mod den eneste FDA godkendt målrettet terapi til HNSCC behandling.

Resultater

cellelinier Modstandsdygtig over for cetuximab er Responsive til Dacomitinib ved lav koncentration

Et panel af 27 HNSCC cellelinjer afspejler anatomiske heterogenitet af sygdommen blev brugt til at teste de antiproliferative virkninger af dacomitinib (PF-00.299.804) og cetuximab, den eneste FDA godkendt målrettet terapi i HNSCC. (tabel 1).

Dacomitinib hæmmede væksten af ​​alle hoved og hals kræft cellelinjer i en koncentrationsafhængig måde. Der var imidlertid signifikant heterogenitet i IC50 g værdier på tværs af panelet, med en 4 log-fold forskel mellem de mest følsomme og mindst følsomme cellelinjer (figur 1A). En afskæring på 1 uM blev anvendt til at lagdele responsive cellelinier baseret på en tidligere undersøgelse i brystcancercellelinie panel [23]. 17/27 cellelinier blev defineret som dacomitinib responsiv og havde en IC50 g mindre end 1 uM. Behandling med 100 ug /ml cetuximab resulterede i mere end 50% inhibering i 7/27 cellelinjer (figur 1b). Svaret fra cellelinier til enten forbindelse korrelerede ikke med den primære tumor anatomiske sted. Salg

Celler blev talt efter fem dages behandling. SE søjler blev afledt fra forsøg gentages mindst to gange. A. Dacomitinib IC50 g-værdier er arrangeret fra laveste til højeste IC50 g på en logaritmisk skala. Cellerne blev behandlet i koncentrationer fra 0,001 til 10 uM. B. Procent væksthæmning med cetuximab behandling. Celler blev behandlet ved en fast dosis på 100 ug /ml. C. Erlotinib IC50 g-værdier er arrangeret fra laveste til højeste IC50 g på en logaritmisk skala. Cellerne blev behandlet ved koncentrationer fra 0,015 til 10 uM. Rød indikerer følsomhed cutoff. For dacomitinib og erlotinib, er følsomheden cutoff til 1 uM og for cetuximab det er sat til 50%.

Desuden det samme panel bruges til at vurdere følsomheden af ​​cetuximab og dacomitinib i HNSCC celler blev anvendt til at vurdere følsomheden af ​​erlotinib, en EGFR specifikke lille molekyle tyrosinkinaseinhibitoren. Selvom erlotinib er ikke en FDA godkendt terapi i HNSCC, er det i en lignende klasse af målrettet terapi som dacomitinib. Således at vurdere, om forskellen mellem mellem dacomitinib og cetuximab anført ovenfor er relateret til de farmakologiske forskelle mellem narkotika klasser, dvs. antistof versus lille molekyle-hæmmer, snarere end deres biologiske mål, vi også vurderet følsomheden af ​​erlotinib. Kun 25,6% (7 ud af 27) HNSCC cellelinier var erlotinib responsiv og havde en IC50 under 1 uM (fig 1C). Denne sats af meget følsomme cellelinjer (defineret som dem med IC50 mindre end 1 uM) var (udtrykket “svarprocent” bør forbeholdes en egentlig klinisk studie udnytte den sædvanlige komplet /partiel alt at generere denne værdi. Den er specifik for dette, og vi må ikke forveksle læserne i en præklinisk undersøgelse medmindre det er af tumor xenograft studie osv).

Svarende til den af ​​cetuximab sådan, at kun 7 ud af 27 HNSCC cellelinjer havde også mere end 50% hæmning med 100 ug /ml cetuximab behandling. Dette står i skarp kontrast til dacomitinib der opnåede en meget følsom på 62,9% med samme en uM følsomhed cutoff. Af de syv HNSCC linjer følsomme overfor erlotinib (IC50 1 uM), fem havde mere end 50% inhibering efter behandling med 100 ug /ml cetuximab. De to andre cellelinier (UMSCC-25 og UMSCC-38), som havde en IC50 g 0,367 og 0,508 uM havde henholdsvis 25,9% og 41,2% hæmning med 100 ug /ml cetuximab behandling. Der var to cellelinjer, som havde mere end 50% hæmning efter behandling med cetuximab, men ikke har mindre en uM IC50 g med erlotinib. De cellelinier UMSCC-4 og FADU som havde en 75,6% og 56,4% hæmning med cetuximab behandling, havde IC50 g 1,19 og 1,192 uM henholdsvis efter behandling med erlotinib. Alle syv af de erlotinib responsive cellelinjer var også dacomitinib lydhør. Af de resterende 20 cellelinjer, 16 havde IC50 g mellem en uM og 10 uM og 4 cellelinjer opnåede ikke IC50 g ved den maksimale testede koncentration på 10 uM.

HNSCC følsomhed over for erlotinib lignede cetuximab følsomhed sådan, at kun 25,6% (7/27) af panelet var lydhøre over for erlontinib og cetuximab mens 62,9% (17/27 HNSCC havde IC50 g 1 uM) var lydhøre over for dacomitinib. Da cetuximab har vist klinisk værdi og er således en standard for pleje af hoved og halscancer, blev resten af ​​sammenligningen udført mellem dacomitinib og cetuximab.

Fælles Oncogene Mutationer og Amplifikationer er sjældne i HNSCC og ikke Sammenhold med følsomhed til Cetuximab eller Dacomitinib

Mutationer i EGFR, K-Ras og PI3K har vist sig at påvirke respons på målrettede behandlinger [4], [26]. Disse mutationer er ikke rigelige i hoved og hals tumorprøver [27], [28]. Vi ønskede at vurdere, om en) vores cellelinje panel var reflekterende af den samme tendens og 2) hvis mutationer i disse gener var forbundet med følsomhed over for cetuximab og dacomitinib. Vi udførte mutation analyse på panelet af hoved og hals kræft cellelinjer anvendt i spredning analyse og fandt, at mutationer var sjældne og kunne ikke bruges til at forklare følsomhed over for cetuximab og dacomitinib (tabel 1). Ingen af ​​cellelinierne nærede EGFR mutationer i exon 19 eller 21. Kun CAL-33 cellelinien udviste en mutation i exon 9 eller 20 i PI3K (en heterozygot H1047R mutant) og kun UMSCC-74A udviste en KRAS mutation (en heterozygot G12D mutant). Begge disse cellelinjer havde en lavere følsomhed over for dacomitinib selvom CAL33 var noget reagerer på cetuximab.

Amplifikation af receptortyrosinkinaser er blevet forbundet med følsomhed over for terapier rettet mod disse receptorer [29]. Tidligere undersøgelser har fundet op til 20% af HNSCC er EGFR amplificeres, men den prognostiske og prædiktive værdi af denne afvigelse er blevet blandet [30]. Udførte vi FISH-analyse til vurdering af kopiantallet af EGFR i 19 ud af de 27 cellelinier. Ingen af ​​cellelinierne blev amplificeret for EGFR og kun 4/19 cellelinjer (UMSCC-5, UMSCC-11A, CAL-27 og CAL-33) viste forøget kopital af EGFR (tabel 1). Interessant nok blev forøget kopital af EGFR ikke forbundet med følsomhed over for dacomitinib; en af ​​de mest følsomhed linjer (CAL-27), og en af ​​de mest resistente linjer (CAL-33) var blandt de fire linjer med gevinster ved EGFR.

Baseline Phosphorylerede og Total EGFR Niveauer med og uden EGF Atimulation korreleret med Følsomhed over for EGFR-rettet Therapy

for at vurdere, i hvilken grad dacomitinib og cetuximab blok EGFR-signalering i hoved og halscancer cellelinjer og afgøre, om dens effektivitet i at blokere EGFR er forbundet med deres evne til at hæmme væksten, udførte vi Western blot-analyse for at vurdere proteinniveauer og phosphorylering status nøglemolekyler i EGFR-signalvejen.

vi udførte Western blot-analyse på en delmængde af cellelinier repræsentative for forskellen respons på dacomitinib behandling. Fire linjer blev udvalgt fra den mest følsomme gruppe (IC50 10 nM), tre linjer fra den moderate gruppe (1 uM IC50 10 nM) og tre linjer fra resistente gruppe (IC50 1 uM). Den gennemsnitlige dacomitinib IC50 g af de udvalgte cellelinjer i hver gruppe er vist i figur 2. Cellerne blev behandlet med enten 100 nM dacomitinib eller 100 ug /mL cetuximab i begge EGF-stimuleret og ustimulerede tilstande. Både total og phosphoryleret EGFR (tEGFR og pEGFR) protein niveauer blev vurderet (figur 3a). Total EGFR niveau var forbundet med følsomhed over for dacomitinib; tre af de fire linjer i den meget følsomme gruppe havde de højeste niveauer af phosphoryleret og total EGFR blandt de ti linjer valgt, mens de tre resistente linjer kollektivt havde de laveste niveauer (figur 3a). Cellelinier i den moderate gruppe havde intermediære niveauer af phosphoryleret og total EGFR. At sammenligne pEGFR niveauer mellem de følsomme, moderate og resistente grupper blev Western blot billeder, kvantificeres og det gennemsnitlige niveau for pEGR for hver følsomhed gruppe blev beregnet og normalisere. Behandling med enten forbindelse blokeret betydeligt niveauer af EGF-stimuleret pEGFR i de meget følsomme og moderate grupper, men ikke i den resistente gruppe (figur 3b).

Fire cellelinjer blev valgt fra yderst sensitiv gruppe (IC50 g 10 nM), tre fra den moderate gruppe (IC50 g10 nM – 1 uM) og tre fra den resistente gruppe (IC50 g 1 uM). Disse ti linier anvendes i Western blot og flowcytometri eksperimenter. Gennemsnitlige IC50 g af de udvalgte sensitive linjer er 5 nM; moderat 75 nM; resistente 2186 nM.

Celler blev dyrket til log-fase og behandlet med 100 nM dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i 1 time, med eller uden behandling med 10 ng /ml rekombinant EGF ligand. Celler lysater blev derefter høstet, og protein blev løst under anvendelse af Western blot-analyse. B. Western blot billeder blev kvantificeret ved anvendelse ImageJ software. Proteinniveauer blev kvantificeret for hver cellelinie og blev midlet efter gruppe. Phosphoryleret EGFR blev normaliseret til total EGFR. *. p. 0,05, t-test

Behandling med enten stof ikke reducere det samlede EGFR niveauer (figur 3a). Der var imidlertid en bemærkelsesværdig reduktion i total EGFR i kontrolcellerne med EGF-stimulering. Det vides, at EGFR internaliseres og ofte nedbrydes efter stimulering med EGF eller andre ligander, hvilket kan forklare vores observation [31]. Tilsætning af enten narkotika, men negeret denne virkning, som tilføjer beviser for, at forbindelser, som binder EGFR kan hæmme internalisering og nedbrydning.

Dacomitinib men ikke hæmmer cetuximab EGF stimuleret EGFR Downstream Pathways

PI3K- AKT-mTOR og Ras-Raf-MAPK signalveje er nedstrømseffektorer af EGFR-signalering [8]. Vi ønskede at evaluere effekten af ​​dacomitinib og cetuximab på disse veje. Først, vi vurderet protein niveauer af total AKT (takt) og phosphoryleret AKT (Pakt) ved behandling med enten dacomitinib eller cetuximab. I kontrolforsøg betingelser blev hverken Pakt eller Takt niveauer forbundet med følsomhed (figur 4A) i enten basislinje eller EGF stimuleret tilstand. EGF-stimulering signifikant forøget Pakt i alle cellelinjer. Salg

Celler blev dyrket til log-fase og behandlet med 100 nM dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i 1 time, med eller uden behandling med 10 ng /ml rekombinant EGF ligand. Celler lysater blev derefter høstet og protein blev løst under anvendelse af Western blot-analyse. B. Western blot billeder blev kvantificeret ved anvendelse ImageJ software. Proteinniveauer blev kvantificeret for hver cellelinie og blev midlet efter gruppe. Phosphoryleret AKT blev normaliseret til total AKT. *. p. 0,05, t-test

Dacomitinib reducerede Pakt niveauer i alle syv cellelinjer i de følsomme og moderate grupper og én cellelinje i den resistente gruppe (UMSCC-1) i både baseline og EGF stimulerede betingelser (figur 4A). Dacomitinib var i stand til at reducere Pakt niveauer i resistent cellelinje UMSCC-17B i EGF kun stimulerede betingelser. I den resistente cellelinje (UMSCC-74A) Pakt niveauer blev lidt reduceret i EGF stimulerede tilstand. Cetuximab behandling var mindre potent at reducere Pakt. Behandling med cetuximab forårsagede reduktion i Pakt i kun fem ud af ti cellelinier (2/4 sensitive linjer, 3/3 moderat linjer og 0/3 resistente linjer), og niveauet for reduktionen var betydeligt mindre end dem, der forårsages af behandling med dacomitinib uanset stimulation EGF (figur 4a).

Som med EGFR, blev Western blots kvantificeret og gruppe specifikke niveauer af Pakt normalisere til takt blev bestemt og sammenlignet (figur 4b). Uden EGF stimulering, begge forbindelser væsentligt reduceret Pakt niveauer i den meget følsomme gruppe og ikke de moderate eller resistente grupper. I EGF stimulerede betingelser, dacomitinib var i stand til at reducere Pakt niveauer i alle tre grupper. I alle testede scenarier, dacomitinib forårsagede større reduktioner i Pakt niveauer end cetuximab.

Aktivering af Ras ved EGFR-signalering initierer en flertrins fosforylering kaskade, der fører til aktivering af MAPK’er, ERK1 og ERK2, og i sidste ende regulerer transkription af gener involveret i celleproliferation. Total og phosphoryleret ERK (ERK1 og 2) protein (Terk og Perk) niveauer blev analyseret ved behandling med enten dacomitinib eller cetuximab. I kontrol- betingelser, Terk og Perk protein niveauer var lavere i den meget følsomme gruppe og højere i den resistente gruppe (figur 5a og 5b), uanset EGF stimulering. Behandling med enten forbindelse signifikant reducerede niveauer af pERK i de syv cellelinjer i de meget følsomme og moderate grupper, og kun 1 (UMSCC-1) ud af tre cellelinier i den resistente gruppe i den hidtidige tilstand (figur 5a). Ved stimulering med EGF, Perk niveauer steget betydeligt på tværs af alle cellelinjer. Under denne betingelse, Dacomitinib stadig blokeret phosphorylering af ERK-niveauer i alle syv cellelinier i det følsomme og moderat gruppe. Ud over at reducere frynsegode niveauer i resistente linje UMSCC-1, under EGF stimuleret tilstand, dacomitinib reduceret også kvikke niveauer i resistente linje UMSCC-74A. Cetuximab var kun i stand til at reducere frynsegode niveauer i en følsom (SCC-9), en moderat (FaDu) og en resistent (UMSCC-74A) linje. I alle scenarier dacomitinib forårsaget større reduktioner i Perk niveauer end cetuximab. Salg

Celler blev dyrket til log-fase og behandlet med 100 nM dacomitinib eller 100 ug /ml cetuximab i 1 time, med eller uden behandling med 10 ng /ml rekombinant EGF ligand. Celler lysater blev derefter høstet og protein blev løst under anvendelse af Western blot-analyse. B. Western blot billeder blev kvantificeret ved anvendelse ImageJ software. Proteinniveauer blev kvantificeret for hver cellelinie og blev midlet efter gruppe. Phosphoryleret ERK blev normaliseret til total ERK. *. p 0,05, **. p. 0,01, t-test

Western blots blev kvantificeret og gruppe specifikke niveauer af pERK normalisere til Terk blev bestemt og sammenlignet (figur 5b). Uden EGF stimulering, begge forbindelser væsentligt reduceret kvikke niveauer i den meget følsomme gruppe og moderate grupper, men ikke resistente gruppe. I EGF stimulerede betingelser, kun dacomitinib var i stand til at reducere frynsegode niveauer. I alle testede scenarier, dacomitinib forårsagede større reduktioner i Perk niveauer end cetuximab.

Dacomitinib Årsager Større G0 /G1 Anholdelse end Cetuximab

Dacomitinib og cetuximab kan have antiproliferativ aktivitet ved at inducere cellecyklus og apoptose . De samme ti cellelinier udvalgt til Western blot-analyser, der repræsenterer de forskellige spredning svar på de to forbindelser, blev brugt til at analysere effekter på cellecyklus og apoptose.

Dacomitinib forårsagede større cellecyklusstop end cetuximab. Efter behandling med 100 nM af dacomitinib eller 100 ug /mL cetuximab i fem dage, var der en signifikant stigning i procentdelen af ​​celler i G0 /G1-fasen i følsomme og moderate grupper med dacomitinib men ikke med cetuximab sammenlignet med kontrol (figur 6a ). Selvom cetuximab foranledigede nogle G0 /G1 arrest, denne effekt var ikke signifikant sammenlignet med kontrol og signifikant lavere end effekten af ​​dacomitinib i både de sensitive og moderate grupper. Der var mindre end fem procent nedgang i S-fasen i alle betingelser bortset fra dacomitinib behandlede moderat gruppe, som havde et signifikant fald (figur 6b). Den generelle tendens af virkningerne på S-fasen efterlignede virkningerne på G0 /G1 fasen. Konsekvent, dacomitinib behandling af følsomme og moderate grupper forårsagede et større fald i G2 end cetuximab behandling (figur 6c).

Celler blev behandlet med 100 nM dacomitinib eller 100 ug /mL cetuximab i fem dage før analyse ved anvendelse af flow cytometri. De viste data er gennemsnitlige procentdel af celler i gruppe opgaver fra figur 2. A. Ændring i procent af celler i G0 /G1 fasen. B. Ændring i procentdelen af ​​celler i S-fase. C. Ændring i procentdelen af ​​celler i G2 fase. *. p. 0,05, t-test

Dacomitinib var lige så effektivt som cetuximab ved at inducere apoptose. I de følsomme og moderate grupper, begge forbindelser forårsagede et fald i procentdelen af ​​celler, som blev levende (figur 7A). Der var en ledsagende stigning i procentdelen af ​​celler, som var i en tidlig eller sen apoptotisk tilstand (figur 7B, 7C). Mindre end 6% af cellerne var døde i nogen af ​​forsøgene (fig 7d). Ingen af ​​lægemidlerne forårsaget betydelig apoptose i den resistente gruppe. Der var ikke en signifikant forskel mellem forbindelserne i inducere apoptose.

A. Ændringer i% levende celler. B. Ændringer i celle i begyndelsen apoptose. C. Ændringer i celler i sene apoptose. D. Ændringer i% døde celler.

Dacomitinib er mere effektiv til at blokere EGFR Signalering end Small Molecule tyrosinkinaseinhibitoren Erlotinib

Som nævnt tidligere, svar på meget specifikke EGFR-rettet terapi kan være lav, fordi der måske samarbejde og signaler redundans mellem forskellige medlemmer af ErbB-receptor familien. Således vurderede vi dacomitinib, en panHER inhibitor med bred specificitet, i et panel af 27 HNSCC og viste HNSCC cellelinier er mere følsomme over for det, end den lille molekyle-anti-EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren erlotinib og anti-EGFR-antistof cetuximab i proliferationsassays (se figur 1) og under anvendelse af en delmængde af ti cellelinier viste vi, at dacomitinib var mere effektiv til at blokere EGFR-signalering end cetuximab. Karakteriseringen af ​​dacomitinib blev udført i sammenligning med cetuximab, den eneste FDA godkendte anti-EGFR middel til behandling af HNSCC. Imidlertid erlotinib og dacomitinib er begge småmolekylære inhibitorer i modsætning cetuximab som er et antistof, og dermed erlotinib evne til at blokere EGFR-signalering blev vurderet ved anvendelse af Western blotting.

Tre cellelinier, der repræsenterer de tre klasser af følsomhed beskrevet før blev undersøgt . I den følsomme linje HN5 dacomitinib var mere effektiv til at blokere EGFR-signalering end både cetuximab eller erlotinib (figur 8A). Kun HN5 celler behandlet med 100 nM dacomitinib havde betydeligt lavere niveauer eller pEGFR forhold til kontrol. EGFR signalering i moderat følsomme linje, UMSCC-38 og UMSCC-17B var lav. Salg

Celler blev dyrket til log-fase og behandlet med 100 nM dacomitinib, 100 nM erlotinib eller 100 ug /mL cetuximab i én time . Celler lysater blev derefter høstet og protein blev løst under anvendelse af Western blot-analyse. B. Western blot billeder blev kvantificeret ved anvendelse ImageJ software. Proteinniveauer blev kvantificeret for hver cellelinje. Phosphoryleret ERK og AKT blev normaliseret til alfa tubulin og præsenteret som en% af kontrollen.

Flere signifikante ændringer blev bemærket i nedstrøms PI3K-AKT-mTOR og Ras-Raf-MAPK pathway, som dacomitinib var signifikant mere effektiv til at blokere både phosphorylering af AKT og ERK (figur 8A). Western blots blev kvantificeret og Pakt og kvikke niveauer blev præsenteret som procent af kontrol, efter at normalisere til alfa tubulin til kontrol for total protein (figur 8B). HN5 celle behandlet med 100 nM af erlotinib havde dobbelt så meget Pakt som dem behandlet med 100 nM dacomitinib. UMSCC-38 celle behandlet med 100 nM af erlotinib havde 17 gange mere Pakt end dem behandlet med den samme koncentration af dacomitinib. Ligeledes selv om alle tre stoffer var effektive et blokerende phospho ERK i følsomme linje HN5, UMSCC-38 behandlet med 100 nM af erlotinib havde 4 gange mere pERK signal end UMSCC-38 celler behandlet med den samme koncentration af dacomitinib. Erlotinib var mindre effektiv til at blokere både phospho ERK og AKT i UMSCC-38 sammenlignet med cetuximab og dacomitinib. I den resistente linje UMSCC-17B, hverken erlotinib eller dacomitinib havde signifikant effekt på Pakt men dacomitinib var mere effektiv til at blokere pERK niveau end erlotinib (figur 8B).

For at vurdere, om en dosis afhængighed kan ses ved hjælp af en højere koncentration af dacomitinib (1 uM) blev testet ved at blokere ERK og AKT-medieret signalering i den resistente linje, UMSCC-17B. I forhold til 100 nM behandling, UMSCC-17B celler behandlet med en uM dacomitinib havde en 25% reduktion i Pakt og 21% reduktion i pERK (figur 8A og 8B).

Diskussion

Den irreversible pan-ErbB inhibitor dacomitinib er i øjeblikket i kliniske fase III-forsøg til behandling af patienter med lungekræft og har vist lovende aktivitet i behandling af denne malignitet (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01000025). Vi søgte at sammenligne virkningerne af dacomitinib med cetuximab, en EGFR-inhibitor, der er i øjeblikket den eneste FDA-godkendte målrettet terapi til HNSCC behandling og at erlotinib et lille molekyle EGFR-inhibitor endnu ikke FDA godkendt i HNSCC. Vi leverer dokumentation for, at behandling med en pan-HER-hæmmer sådan dacomitinib er mere effektivt end at bruge EGFR specifikke hæmmere cetuximab og erlotinib.

Vores data viser effektiviteten af ​​dacomitinib i ophævelse vækst i HNSCC cellelinier in vitro. Vores data viser, at cellelinier udviser dramatisk væksthæmning med cetuximab udviste også betydelig vækst hæmning med dacomitinib, hvilket viser, i det mindste, manglen på underlegenhed i dacomitinib forhold til cetuximab. Af klinisk interesse er, at 3/27 cellelinjer, 11% af panelet, oplevede mere end 90% væksthæmning med cetuximab, der minder om den kliniske observation af en svarprocent på 10% hos patienter, der får cetuximab. Disse tre cellelinier var stærkt følsomt overfor dacomitinib såvel med IC50 g værdier mindre end 10 nM. Hvis dette prækliniske observation holder klinisk, ville vi forudsige de patienter, der reagerer på cetuximab vil også reagere på dacomitinib.