PLoS ONE: Validering af en Ion Torrent Sequencing Platform til påvisning af genmutationer i Biopsi Prøver fra patienter med ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

Behandling for patienter med fremskreden ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er ofte bestemt af tilstedeværelsen af ​​biomarkører, der forudsiger svaret på agenter rettet mod specifikke molekylære veje. Krav om multiplex analyse af de involverede i patogenesen af ​​NSCLC gener er stigende.

Metoder

Vi valideret Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) systemet ved hjælp af Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel og sammenlignet resultaterne med dem, der opnås ved anvendelse af guld standardmetoder, konventionel PCR og Sanger-sekventering. Den cycleave PCR metoden blev anvendt til at verificere resultaterne.

Resultater og konklusion

Ion Torrent PGM resulterede i et tilsvarende niveau af nøjagtighed at identificere flere genetiske mutationer i parallel, sammenlignet med konventionel PCR og Sanger sekventering; imidlertid Ion Torrent PGM var overlegen i forhold til de andre sekventeringsmetoder i form af øget brugervenlighed, selv når der tages hensyn til lille mængde DNA, som blev opnået fra formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) biopsiprøver.

Henvisning: Fujita S, Masago K, Takeshita J, Okuda C, Otsuka K, Hata A, et al. (2015) Validering af en Ion Torrent Sequencing Platform for påvisning af genmutationer i Biopsi Prøver fra patienter med ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (6): e0130219. doi: 10,1371 /journal.pone.0130219

Academic Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Modtaget: December 28, 2014 Accepteret: 17. maj 2015; Udgivet 15. juni, 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data er tilgængelige fra Ibri Institutionel data Access /etiske komité på grund af etiske begrænsninger relateret til patientens privatliv. I tilfælde af anmodning data, vil bestyrelsesmedlemmerne beslutte, om ikke at frigive oplysninger

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Behandling for patienter med fremskreden ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er ofte bestemt, som det er tilfældet for andre menneskelige kræftformer, ved tilstedeværelsen af biomarkører, der forudsiger svaret på agenter rettet mod specifikke molekylære veje i maligne celler. Gunstige respons på tyrosinkinase (TK) inhibitorer er målrettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), i tilfælde af NSCLC, hvor mutationer er til stede i EGFR-genet, illustrere betydningen af ​​identifikationen af ​​molekylære biomarkører, og flere sådanne oncogene ændringer har været rapporteret til dato [1-3]. Disse molekylære ændringer kan inddeles i to kategorier; genetiske rearrangementer der kræver RNA-baseret analyse og /eller fluorescens in situ hybridisering til deres identifikation, og genmutationer (herunder små insertion eller deletion begivenheder), der er undersøgt ved anvendelse af DNA-baseret analyse. Mutationer er opdaget i flere gener ud over

EGFR Hoteller, som er involveret i patogenesen af ​​NSCLC (dvs.

KRAS

,

NTM

,

HER2

,

Akt1

,

BRAF

,

PIC3CA

) og kravet om multiplex analyse af disse gener er stigende.

de eneste vævsprøver, der normalt til rådighed for mutationsanalyse i kliniske omgivelser er biopsiprøver opnået transbronchially eller transkutant. Disse prøver tendens til at være lille og underkastes den formalin-fiksering proces. Påvisning af mutationer ved at udføre PCR og Sanger sekventering parallelt er tidskrævende og kræver en betydelig mængde af DNA, som ofte er utilgængelige på grund af den lille stikprøve. En nyligt udviklet teknik, massivt parallelle DNA-sekventering, muliggør hurtig, følsom og meget specifik påvisning af genmutationer i en enkelt analyse, til en rimelig pris.

Her brugte vi den personlige Genome Machine (PGM) systemet Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific), sammenholdt med Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel, version 2 og sammenlignet resultaterne med dem, der opnås ved guld standardmetoder til mutationsanalyse, konventionel PCR og Sanger sekventering. Desuden er en meget følsom PCR-metode, den cycleave PCR metode blev anvendt med fokus på EGFR og KRAS genmutationer specifikt at kontrollere de resultater, som både konventionel PCR og Ion Torrent PGM-system.

Metoder

Etik

Denne undersøgelse blev godkendt af Institute of Biomedical Research og Innovation Hospitals Institutional Review Board. Alle patienter forudsat skrevet, informeret samtykke. Undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med de etiske principper i Helsinki-deklarationen.

Patientinformation

Tumor prøver anvendt i undersøgelsen blev indsamlet fra Institut for Biomedical Research og Innovation Hospital, Japan. I overensstemmelse med de gældende retningslinjer, alle FFPE tumorprøver fra patienter ikke-småcellet lungekræft med ukendt genotype (

EGFR

KRAS

) blev analyseret ved konventionel PCR og Sanger sekventering til at bestemme yderligere behandling. Til sammenligning blev der i alt 21 tumorprøver analyseret med Ion PGM systemet og cycleave PCR-metode

Analyseret gener

EGFR

:. Exon 19 sletning (herunder E746 -A750), Exon 21 L858R, Exon 21 L861Q

KRAS

: Exon 2 G12X

vævsprøver og DNA-isoleringer

Kun de biopsiprøver som afslørede NSCLC patologisk blev analyseret. I alle tilfælde blev bronkoskopisk biopsi eller kerne nål biopsi udføres (Fig 1A og 1B). En dedikeret 21-gauge nål blev anvendt til opnåelse histologisk kerne. Histologiske kerner blev fikseret med formalin og anvendt til patologisk diagnose. Efter histopatologisk diagnose, blev FFPE prøver (1 til 3 prøver af 5-um-tyk sektion) afparaffiniseret under anvendelse xylen. DNA blev isoleret fra de sektioner ved hjælp QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), i henhold til fabrikantens anvisninger. Vi målte DNA-koncentration med NanoDrop Lite spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific).

(A) formalinfikseret paraffin indlejrede eksemplar. (B) En prøve af 5-um-tyk sektion.

Konventionel PCR og Sanger sekventering

Exon 18 til 21 blev opformeret ved PCR og analyseret. Primere og cykling betingelser for PCR-amplifikation blev ændret fra metoder, der tidligere [4] offentliggjort. Sekventeringsreaktioner blev elektroforesebehandlet på en ABI PRISM 3100 (Thermo Fisher Scientific). Direkte sekventering af PCR-produkterne blev gennemført i både sense- og antisense retninger.

Den cycleave PCR-metoden

Vi anvendte et kimært DNA-RNA-DNA-probe er mærket med et fluorescerende farvestof og quencher på hver ende [5]. En RNA-sekvens af proberne svarer til den for vildtype og punktmutation (Exon 21 L858R, Exon 21 L861Q) mærket med FMA og ROX hhv. Når mutante molekyler er til stede i prøven og PCR-amplificeret DNA genererer en komplet hybrid med RNA-delen af ​​den mutante probe, RNase-H-fordøjelser sonden på RNA-DNA heteroduplex i to stykker, hvilket fører til en betydelig stigning i fluorescensintensitet ved separation af det fluorescerende farvestof fra quencheren.

at påvise deletion i exon 19 i EGFR-genet, blev anvendt fælles fragment analyse. Prøve-DNA blev amplificeret med en FAM-mærket primer sæt og PCR-produkter blev elektroforesebehandlet. PCR-amplificeret den kortere segment af DNA, hvilket skaber en ny top i et elektroferogram når en deletionsmutation var til stede [5].

Ion Torrent PGM Bibliotek Forberedelse og sekventering

En Ion Torrent adapter-ligeret biblioteket blev genereret efter producentens Ion AmpliSeq bibliotek Kit 2.0 protokol (Thermo Fisher Scientific, Rev. 5, MAN0006735). Kort fortalt 50-ng puljede ampliconer var ultimo repareret, og Ion Torrent adaptere P1 og A blev ligeret med DNA-ligase. Efter AMPure perle rensning (Beckman Coulter), koncentrationen og størrelsen af ​​biblioteket blev bestemt ved hjælp af Life Technologies StepOne systemet (Thermo Fisher Scientific) og Ion Bibliotek TaqMan Kvantificering Assay Kit (Thermo Fisher Scientific).

Sample emulsion PCR, emulsionsbrydning og berigelse blev udført under anvendelse af Ion PGM IC 200 Kit (Thermo Fisher Scientific), ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet et input koncentration af en DNA-template copy /Ion Sphere Partikler (ISP) blev tilsat til emulsionen PCR mastermix, og emulsionen blev dannet ved anvendelse af Ion Chef (Thermo Fisher Scientific). Template-positive internetudbydere blev beriget og sekventering blev foretaget ved hjælp af 314 BC chips på Ion Torrent PGM for 65 cykler og stregkodesystem blev udført ved hjælp af Ion DNA Barcoding kit (Thermo Fisher Scientific).

Variant kalder

data fra PGM kørsler blev oprindeligt behandlet ved hjælp af Ion Torrent platform-specifikke rørledning software, Torrent Suite, til at generere sekvens læser, trim adapter sekvenser, filter og fjerne dårligt signal-profil læser. Indledende variant ringer fra Ion AmpliSeq sekventering data blev genereret ved hjælp af Torrent Suite Software v4.0 med en plug-in ” variant, der ringer “program. For at eliminere fejlagtige basis kald blev tre filtrering trin bruges til at generere den endelige variant kald. Det første filter blev fastsat til en gennemsnitlig dybde af den samlede dækning af 100, en hver variant dækning af 20, og P-værdi 0,01. Det andet filter blev ansat ved visuelt at undersøge mutationer ved hjælp Integrativ Genomics Viewer software (https://www.broadinstitute.org/igv) eller CLC Genomics Workbench-version 7.5.1 (Qiagen), samt ved at frafiltrere mulige streng-specifikke fejl ; dvs., en mutation blev kun detekteret i enten ” plus “eller ” minus” -strengen, men ikke i begge strenge af DNA.

Resultater og Diskussion

I alt 21 tumorprøver (10 fra bronkoskopisk transbronkial biopsi, 6 CT-vejledt tumor biopsi og 5 kerne-nål overfladisk lymfeknude biopsi) blev analyseret. En medianværdien af ​​ekstraheret DNA-koncentration var 115,2 ng /pl (minimum 29,3, maksimum 786,1) og en passende mængde DNA blev anvendt til analyse. Som vist i tabel 1 og figur 2, analyser resultaterne af genmutation opnået ved Sanger-sekventering var identiske i alle tilfælde til sådanne afledt af beregninger med den Ion PGM systemet. Med hensyn til EGFR, analytiske resultater opnået ved Sanger sekventering helt matchede dem, der opnås ved cycleave metode og Ion PGM-systemet. Ingen af ​​de undersøgte tumorer havde mutationer i både EGFR TK-domænet og KRAS-genet.

(A) KRAS mutation (G12V) identificeret ved cycleave teknologi. (B) EGFR mutation (exon 19 udgår) identificeret ved fragmentet analyse (C) KRAS mutation (G12V) blev påvist med Ion PGM teknologi. C til A transversion blev identificeret. (D) EGFR-mutation (exon 19 udgår) blev påvist med Ion PGM teknologi.

En anden EGFR mutation, hvor methionin er stedet for threonin ved position 790 (T790M) korrelerer med erhvervet resistens til EGFR tyrosinkinaseinhibitorer [6]. I vores serie, 3 patienter gennemgik en anden biopsi efter progression på behandling af EGFR tyrosinkinaseinhibitorer. DNA-sekvensen af ​​disse biopsiprøver ved traditionel Sanger sekventering viste T790M mutation i to tilfælde. Sekventering ved hjælp af Ion PGM afslørede T790M mutation også i to tilfælde. Ud blandt 900 læser opnået, blev observeret i 53, den T790M-mutationen læser (5,9%) i den tredje patient. Selvom det detekterede antal læser var under tærskelværdien, er det muligt, at fremkomsten af ​​T790M er den primære årsag til resistens over for EGFR tyrosinkinasehæmmer behandling i dette tilfælde.

På trods af det lille antal sager analyserede, de resultater antyder, at Ion Torrent PGM er en praktisk og følsom fremgangsmåde, der ville være egnet i klinisk praksis, når kun en lille mængde af malignt væv er tilgængelig og multiplex-analyser af gener er nødvendige til behandling planlægning. Ud over den undersøgelse af genmutationer, der udføres her, yderligere information om genetiske omlejringer bør integreres i den nuværende viden til at forbedre behandlingen af ​​NSCLC og lette yderligere undersøgelse.