PLoS ONE: Autophagosome-medieret EGFR nedregulering induceret af CK2 Inhibitor Forbedrer Effektivitet af EGFR-TKI på EGFR-Mutant Lung Cancer Cells med Resistance af T790M

Abstrakt

Protein kinase CK2 har forskellige funktioner, der fremmer og vedligeholde kræft fænotyper. Vi undersøgte virkningen af ​​CK2 inhibering i lungecancerceller med T790M-medieret resistens mod EGFR-TK-inhibitor. Resistente underlinjer af PC-9 til gefitinib (PC-9 /GR) og erlotinib (PC-9 /ER) blev oprettet ved tidligere undersøgelse, og T790M sekundær mutation blev fundet i begge resistente underlinjer. Et fald af EGFR af siRNA behandling styres effektivt væksten af ​​resistente celler, hvilket antyder, at de stadig har EGFR-afhængighed. CX-4945, en potent og selektiv CK2-hæmmer, induceret autophagy i PC-9 /GR og PC-9 /ER, og som blev støttet af induktion af autophagic vakuoler og mikrotubuli-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3) udtryk, og stigningen i punktformig fluorescerende signaler i resistente celler præ-transficeret med grønt fluorescerende protein (GFP) -mærket LC3. Men tilbagetrækningen af ​​CX-4945 førte til inddrivelse af kræftceller med autofagi,. Vi fandt, at induktionen af ​​autophagy af CX-4945 i begge resistente celler var CK2 afhængig ved anvendelse lille interfererende RNA mod CK2. Behandlingen med CX-4945 alene inducerede en minimal væksthæmning hos resistente celler. Men kombineret behandling af CX-4945 og EGFR-TKI inhiberes effektivt cancer-celleproliferation og apoptose. CX-4945 øget translokation af EGFR fra celleoverfladen i autophagosome efterfølgende fører til fald i EGFR mens hæmning af autophagy af 3 mA eller Atg7 målrettet siRNA forbehandling reducerede faldet i EGFR af CX-4945. Følgelig apoptose ved en kombination af CX-4945 og EGFR-TKI blev undertrykt af 3mA eller Atg7 målrettet siRNA forbehandling, hvilket antyder, at autophagosome-medieret EGFR nedregulering ville have en vigtig rolle med hensyn til apoptotisk celledød ved EGFR-TKI. Kombineret behandling af CK2 hæmmer og EGFR-TKI kan være en lovende strategi for at overvinde T790M-medieret resistens

Henvisning:. Så KS, Kim CH, Rho JK, Kim SY, Choi YJ, Song JS, et al . (2014) Autophagosome-medieret EGFR nedregulering induceret af CK2 Inhibitor Forbedrer Effektivitet af EGFR-TKI på EGFR-Mutant Lung Cancer Celler med Resistance af T790M. PLoS ONE 9 (12): e114000. doi: 10,1371 /journal.pone.0114000

Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Canada

Modtaget: August 2, 2014 Accepteret: November 2, 2014; Udgivet: 8. december 2014

Copyright: © 2014 Så et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af en bevilling af den koreanske Health Technology R D Project, Sundhedsministeriet Velfærd (HI12C1146000013) og et tilskud (2011-0529) fra Asan Institut for Life Science, Seoul, Republikken Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Målretning den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) med lille-molekyle, tyrosinkinaseinhibitorer er blevet en væsentlig terapeutisk strategi for ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) med EGFR mutation. Efter bekræftelse overlevelse fordel sammenlignet med konventionel cytotoksisk kemoterapi [1], [2], EGFR-TKI’er er blevet godkendt som first-line agenter. Men på trods af den oprindeligt bemærkelsesværdige respons, erhvervet resistens i sidste ende udvikler sig, hvilket begrænser median responsvarighed på mindre end et år [3], [4]. Ca. halvdelen af ​​modstanden er forårsaget af en anden-site mutation i stilling 790, nemlig T790M [5], [6]. Den tykkere methioninrest i T790M kunne hindre binding af lægemidlet eller den forøgede ATP affinitet ved ATP-bindende lomme, og dermed minimere lægemiddeleffektivitet [5], [7].

Anden generation EGFR-TKI’er , såsom BIBW2992 (afatinib) og PF00299804 (dacomitinib), er blevet anbefalet for at overvinde T790M-medierede resistens betragtning af, at disse potent, irreversibel EGFR-TKI’er ikke længere konkurrere med ATP når de er blevet covalent bundet til kinasedomænet [ ,,,0],8], [9]. Det er imidlertid usikkert, om irreversibel EGFR-TKI’er kan overvinde modstanden forårsaget af T790M som nogle foreløbige resultater af igangværende kliniske forsøg har været temmelig skuffende med hensyn til at overvinde modstanden, selvom kunne opnås mere vellykket, progressionsfri patient overlevelse når det anvendes som den første linje agent i forhold til reversible EGFR-TKI’er [10], [11]. Derfor vil yderligere klinisk undersøgelse være påkrævet for at tilvejebringe mere effektive overvindelse strategier.

Protein kinase CK2 er en konstitutivt aktiv og stærkt bevaret, allestedsnærværende serin /threonin-kinase, som er involveret i en række forskellige celle signalering relateret til cellecyklussen, proliferation og apoptose [12] – [14]. Afvigende CK2 udtryk og aktivitet er blevet rapporteret i mange humane sygdomme, herunder kræft [15]. Overekspressionen af ​​CK2 dæmper apoptose af cancerceller, mens dets nedregulering forbedrer celledød forårsaget af lægemiddel eller stråling, og dermed tyder vigtig regulerende rolle vedrørende bestemmelse af cancer-celle skæbne [16] – [19]. CK2-afhængig phosphorylering af Cdc37 er påkrævet for chaperoning funktion af Hsp90 på talrige klient oncoproteiner, herunder CK2, selv [20]. Fordi Hsp90 er afgørende for onkoproteinet modning og stabilitet, overlevelsen af ​​cancerceller er helt afhængig af sin rette funktion, hvilket antyder, at kontrol af HSP90 direkte eller indirekte via inhibering af CK2 ville lovende for kræftbehandling. Desuden kan CK2 regulere EGFR og dens nedstrøms signalering, især aktiviteten af ​​medlemmer af PI3K-Akt-mTOR pathway [21] – [24]. Inhiberingen af ​​denne vej er blevet vist at forstærke virkningen af ​​EGFR-inhibitorer [25].

I denne undersøgelse undersøgte vi aktiviteten af ​​CX-4945, en selektiv og potent CX-2-inhibitor, på EGFR- mutante lungecancerceller med T790M mutation fører til resistens over for EGFR-TKI’er. Det blev også undersøgt, om det kunne øge virkningen af ​​EGFR-TKI’er for at overvinde modstanden.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

Gefitinib /Erlotinib- resistente cellelinier (PC-9 /GR og PC-9 /ER) blev etableret i en tidligere undersøgelse [26]. Celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) indeholdende 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. MTT-opløsning blev købt hos Sigma (St Louis, MO, USA). Gefitinib, Erlotinib, 17-DMAG, CX-4945, og 3mA blev indkøbt fra Selleck Chemicals Co. Ltd (Houston, TX, USA).

Cell overlevelse analyser

For at udføre MTT assay blev celler udpladet i 96-brønds sterile plastplader. Celler blev udsat for varierende doser af CX-4945. Efter 72 timer, 15 pi MTT-opløsning (5 mg /ml) blev tilsat til hver brønd og pladerne blev inkuberet i 4 timer. Krystallinsk formazan blev solubiliseret med 100 pi af en 10% (w /v) SDS-opløsning i 24 timer. Absorbans ved 595 nm blev aflæst spektrofotometrisk under anvendelse af en mikropladelæser. For at validere de kombinerede virkninger af CX-4945 eller EGFR afhængighed blev celler behandlet med CX-4945, EGFR-TKI’er, en kombination af CX-4945 og gefitinib eller erlotinib, eller EGFR målrettet siRNA i de angivne tidsrum. Cellelevedygtighed blev bestemt under anvendelse af en ADAM-MC automatisk celletæller (NanoEnTek, Seoul, Korea) ifølge producentens instruktioner.

Western blot-analyse

Helcellelysater blev fremstillet ved anvendelse EBC lysepuffer ( 50 mM Tris-HCI [pH 8,0], 120 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0,3 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 0,2 mM natriumorthovanadat, 0,5% NP40, og 5 U /ml aprotinin) og blev derefter centrifugeret. Den resulterende supernatant (20 ug) blev separeret på 8% til 12% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Invitrogen). Membranerne blev blokeret ved anvendelse af 5% skummetmælk-PBS-0,1% Tween 20 i en time ved stuetemperatur før den blev inkuberet natten over med primære antistoffer specifikke for p-CK2α som blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA) og CK2α som blev købt fra Abcam (Cambridge, UK). p-EGFR (Tyr1173), EGFR, caspase-3, Akt, p-Erk, Erk, og β-actin blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). P-Akt (Ser473), spaltet PARP (Asp214), Atg7 og LC3 blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Berverly, MA, USA). Peberrodsperoxidase-konjugerede antistoffer blev anvendt som sekundære antistoffer. Membraner blev udviklet ved anvendelse af ECL kits (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Acridin Orange farvning

Autophagy blev analyseret ved farvning af celler med den vitale farvestof, acridinorange (Sigma, St. Louis, MO). Celler blev trypsinbehandlet og blev inkuberet med acridinorange i en endelig koncentration på 5 ug /ml i 30 min ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære. Analyser blev udført på en FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Dataene blev analyseret ved anvendelse af CellQuest-software (Becton Dickinson). Resultaterne er repræsentative for mindst tre, uafhængige forsøg, og fejlen barer tilkendegiver standardafvigelser (SDS).

LC3-GFP udtryk

Celler blev transficeret med et plasmid, pEGFP-LC3 vektor (Addgene Inc., Cambridge, MA, USA) og blev dyrket i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med CX-4945 i 24 timer. De punktformede mønstre af LC3 i transficerede celler blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi.

Apoptose assay

Apoptose blev kvantificeret under anvendelse af Annexin V-FITC apoptosis kit (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kort fortalt blev celler trypsinbehandlet, pelleteret ved centrifugering og resuspenderet i Annexin V-bindingsbuffer (150 mM NaCl, 18 mM CaCI

2, 10 nM HEPES, 5 mM KCI, 1 mM MgCl

2). FITC-konjugeret Annexin V (1 ug /ml) og propidiumiodid (50 ug /ml) tilsat til cellerne som blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Analyser blev udført på en FACScan (Becton Dickinson). Dataene blev analyseret ved anvendelse af CellQuest-software (Becton Dickinson). Resultaterne er repræsentative for mindst tre, uafhængige forsøg, og fejlen barer betyde standardafvigelser (SDS).

Små interfererende RNA transfektion

Små interfererende RNA (siRNA) oligonukleotider specifikke for EGFR, Atg7, CK2α og siRNA kontrol blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). Celler blev podet i en 60 mm skål, som derefter blev efterladt i 24 timer. En 2 pi alikvot af siRNA-opløsning (10 uM) og 5 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen) blev hver blandet med 100 pi serumfrit RPMI 1640 medium. De blev inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur efter kombination af de to blandinger, og dette blev derefter tilsat til cellerne, der var blevet podet på skålen. Efter 24 timer blev høstede celler underkastet Western blot analyse. Celler blev også behandlet for cellelevedygtighed og apoptose-analyse.

Konfokal mikroskopi

Cellerne blev dyrket i et kammer slide i nærvær eller fravær af CX-4945 i 48 timer. De blev fikseret i 10 minutter med kold methanol og derefter vasket tre gange med PBS. Cellerne blev inkuberet med anti-EGFR (Santa Cruz, 01:50) og LC3 (cellesignalering, 1:100) natten over ved 4 ° C. Sekundært antistof inkubation inkluderet 1:100 fortynding af enten Alexa Fluor 488 anti-muse eller Alexa Fluor 568 anti-kanin-antistoffer. Kerner blev farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og blev derefter vasket og dække-sled. Slides blev set under en LSM710 konfokal laser scanning mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland), og billederne blev fotograferet.

Resultater

CX-4945 inducerer autophagy i gefitinib /erlotinib-resistent PC -9 celler

Nogle undersøgelser har rapporteret, at CX-4945 førte til en hæmning af proliferation i humane cancerceller [15], [24]. For at undersøge om CX-4945 kan hæmme væksten af ​​lungecancerceller med T790M-medieret resistens over for EGFR-TKI’er blev celler behandlet med CX-4945 i en dosis-afhængig måde. Som vist i fig. 1A, har CX-4945 behandling ikke viser en signifikant væksthæmning i gefitinib /erlotinib-resistente celler. Vi fandt imidlertid, at CX-4945 behandling udløste ophobning af autophagic vakuoler (AV), mens disse celler blev gendannet til deres tidligere tilstand efter narkotika tilbagetrækning (fig. 1B). For yderligere at bekræfte induktion af autophagy af CX-4945, analyserede vi ekspressionen af ​​autophagy markering, LC3-II, og antallet af celler farvet med acridinorange ved at udføre Western-blotting og FACS-analyse. I overensstemmelse med induktion af autophagic vaculoles viste CX-4945 behandling en kraftig stigning i mængden af ​​endogene LC3-II og i den procentdel af acridinorange-positive celler (Fig. 1C og D). Desuden CX-4945 behandling udviste karakteristiske punktformet mønster af LC3, hvorimod vehikelbehandlede celler viste diffus og svag LC3-associeret grøn fluorescens (fig. E). Dette CX-4945-induceret autofagi blev også observeret i parentale PC-9 celler (data ikke vist). Disse resultater viste, at CX-4945 er i stand til at udløse induktionen af ​​autofagi i parentale celler samt gefitinib /erlotinib-resistent PC-9-celler.

A, blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af CX-4945 i 72 timer, og graden af ​​inhibering blev bestemt ved MTT-assayet. B, Celler blev behandlet med eller uden CX-4945 (5 uM) i 48 timer og blev derefter inkuberet i 24 timer med et lægemiddelfrit medium indeholdende 10% FBS. Billeder viser autophagic vakuolen dannelse (AVOS) blev taget ved × 20 forstørrelse. C og D blev celler behandlet med CX-4945 i 48 timer. Cellelysater blev underkastet Western blot-analyse. Kvantitativ påvisning af sure vesikulære organeller ved acridinorange-farvning af celler blev bestemt ved FACS-analyse. * P 0,01 og ** p 0,001 sammenlignet med kontrollen. E, Celler blev transficeret med et plasmid til at udtrykke LC3-GFP. Efter 24 timer transfektion blev celler behandlet med CX-4945 (5 uM) i 24 timer. Punktformet mønster af LC3 lokalisering analyseret ved immunfluorescens mikroskopi. F og G, blev celler inkuberet med CX-4945 (5 uM), 17-DMAG (100 nM) eller rapamycin (20 uM) i 48 timer. Billeder blev taget ved × 20 forstørrelse. Induktionen af ​​LC3-I /II blev vist ved Western blot-analyse.

Hsp90 er afgørende for mange oncoproteiner modning og stabilitet, herunder CK2α [20]. Desuden chaperoning funktion af Hsp90 krævede phosphorylering af Cdc37 af CK2α [27], [28]. For yderligere at vurdere, om Hsp90 var involveret i CX-4945-induceret autofagi blev celler behandlet med 17-DMAG, Hsp90 hæmmer. Som vist i fig. 1F og G, har inhibering af Hsp90 ikke viser induktionen af ​​autofagi. Selvom celler blev behandlet med de samme doser af hvert lægemiddel, CX-4945-induceret autophagy var mere potent end rapamycin, en mTOR-inhibitor.

Selvom CX-4945 har selektivitet for CK2, kan det inhibere andre kinaser, såsom FLT3, PIM1, og CDK1. Vi undersøgte derfor, om CX-4945-induceret autofagi er afhængig af CK-2. I overensstemmelse med resultatet af CX-4945 behandling, undertrykkelse af CK2α inducerede kun en minimal væksthæmning, det resulterede i en forøgelse af autophagic vaculoles og endogene LC3-II (fig. 2). Disse resultat antydede, at CX-4945-induceret autophagy kan være CK2-afhængig.

A og B, blev celler transficeret med kontrol eller CK2α siRNA (100 nM) i 48 timer. Celletal blev bestemt med en ADAM-MC automatisk celletæller. Billeder viser autophagic vakuolen dannelse (AVOS) blev taget ved × 20 forstørrelse. * P 0,01 sammenlignet med kontrollen. C, Efter 48 timers transfektion, CK2α og LC3-I /II blev vist ved Western blot analyse.

CX-4945 forstærker effekten af ​​EGFR-TKI’er i gefitinib /erlotinib-resistente celler

forholdet mellem induktion af autophagy og følsomheden over for EGFR-TKI’er har kontroversielt forblevet [29] – [32]. Bestemmelse af, om CX-4945-induceret autophagy kan påvirke følsomheden over for EGFR-TKI’er blev celler behandlet med CX-4945, EGFR-TKI eller en kombination af begge i 48 timer. Kombinationen af ​​CX-4945 og gefitinib eller erlotinib førte til en betydelig vækst hæmning, mens CX-4945-induceret autofagi blev nedsat i kombineret behandling (fig. 3A). Endvidere kombineret behandling med EGFR-TKI’er og CX-4945 induceret caspase-3 og PARP-1-spaltning, hvilket fører til øget celledød (fig. 3B og C).

Celler blev behandlet med CX-4945 ( 5 uM), gefitinib (1 uM), og erlotinib (1 uM) eller en kombination af CX-4945 og gefitinib eller CX-4945 og erlotinib i 48 timer. A, Cell blev bestemt ved anvendelse af en celletæller (øvre panel). Kvantitativ påvisning af sure vesikulære organeller ved acridinorange-farvning af celler blev bestemt ved FACS-analyse (nederste panel). † p 0,01 sammenlignet med CX-4945 alene. B, Apoptose blev vurderet ved Annexin V-FITC /propidiumiodid-farvning og flowcytometri. Diagrammer over Annexin V-FITC /propidiumiodid flowcytometri i et repræsentativt forsøg er præsenteret i venstre panel. Resultaterne er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg, og fejlen barer tilkendegiver standardafvigelser (± SDS). C, Spaltning af PARP-1 og caspase-3 blev vist ved Western blot-analyse. * P 0,01 og ** p. 0,001 sammenlignet med kontrolgruppen

For at undersøge den mekanisme, hvormed CX-4945 restaureret antitumor aktiviteter af EGFR-TKI i resistente celler, vi først undersøgt afhængigheden af EGFR signalering i begge typer af resistente celler. Selv om effektiviteten at nedregulere EGFR afveg blev væksten af ​​både resistente celler signifikant inhiberet af siRNA behandling, og hvilket antyder den fortsatte EGFR afhængighed trods T790M-medieret resistens (fig. 4A og B). Dernæst observerede aktiviteter EGFR og dens downstream molekyler, når celler blev udsat for hvert lægemiddel. Den hæmmende effekt af en enkelt behandling med CX-4945, gefitinib eller erlotinib på EGFR og AKT aktiviteter var beskeden, mens kombinationen af ​​CX-4945 og gefitinib eller erlotinib fuldstændig undertrykt EGFR og Akt aktivitet (fig. 4C). Behandling med CX-4945 inducerede nedregulering af det totale EGFR som det ses i siRNA behandling. Disse resultater antyder, at tilsætningen af ​​CX-4945 til EGFR-TKI kan overvinde T790M-medieret resistens gennem øget aktivitet af EGFR-TKI at undertrykke EGFR signaler ved nedregulering af EGFR.

A og B, kontrol og EGFR siRNA’er (100 nM) blev indført i parentale eller resistente celler, og EGFR suppression blev bekræftet ved Western blot analyse. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af en celletæller 72 timer senere. * P 0,01 og ** p 0,001 sammenlignet med kontrollen. C, Celler blev behandlet med lægemidler, som i fig. 2. Celler blev høstet, og modulation af EGFR-signalering i de angivne cellelinjer blev detekteret ved Western blot analyse.

Hæmningen af ​​CX-4945-induceret autofagi dæmper apoptose i gefitinib /erlotinib-resistent celler

Vi observerede, CX-4945 behandling førte til nedregulering af EGFR. For at bestemme om induktionen af ​​autofagi er forbundet med nedregulering af EGFR blev ændringerne i EGFR lokalisering bekræftet ved konfokal mikroskopi under anvendelse af anti-EGFR og anti-LC3 antistof konjugeret til fluoroforen. Som vist i fig. 5A viste CX-4945 behandling en stigning inLC3 /EGFR co-lokalisering. Disse resultater viser, at CX-4945-induceret autophagy kan indeslutte EGFR fra plasmamembranen ind i autophagosome og at fanget proteiner kan nedbrydes ved lysosom.

A blev PC-9 /ER-celler behandlet med CX-4945 ( 5 uM) i 48 timer og derefter blev fikseret med methanol, immunfarvet med anti-LC3 (rød), anti-EGFR (grøn), og DAPI (blå), og analyseret ved konfokal mikroskopi for at bestemme den intracellulære lokalisering af EGFR. B blev Undertrykkelsen af ​​Atg7 af siRNA behandling detekteret ved Western blot analyse. PC-9 /ER-celler blev behandlet med CX-4945 (5 uM) i 48 timer i nærvær eller fravær af 3 mA (2 mM) og Atg7 siRNA (100 nM). Modulering af EGFR blev påvist ved Western blot analyse. C og D, Celler blev behandlet med lægemidler, som i fig. 2 i nærvær eller fravær af 3 mA og Atg7 siRNA. Spaltning af PARP-1 og caspase-3 blev vist ved Western blot-analyse. Apoptose blev vurderet ved Annexin V-FITC /propidiumiodid-farvning og flowcytometri. Resultaterne er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg, og fejlen barer tilkendegiver standardafvigelser (± SDS). * P 0,01 og ** p. 0,001 sammenlignet med kombinationen af ​​CX-4945 og gefitinib eller erlotinib

For yderligere at undersøge, om CX-4945-induceret autofagi fører direkte til nedregulering af EGFR, vi evaluerede niveauet af EGFR i nærvær eller fravær af autophagic inhibitor (3-methyladenin, 3 mA) og Atg7 siRNA behandling. Antallet af autophagosomes signifikant lavere hos forbehandlede celler med 3mA (data ikke vist), og 3mA eller Atg7 siRNA behandling gendannet aktiviteterne samt det totale niveau af EGFR (fig. 5B). Endvidere inhibering af autophagy af 3 mA eller undertrykkelse af Atg7 faldt caspase-3 og PARP-1-spaltning og førte til en reduktion af apoptotisk celledød (fig. 5C og D). Tilsammen indikerer disse resultater, at induktion af autophagy af CX-4945 kan spille en vigtig rolle i at overvinde T790M-medieret resistens over for EGFR-TKI’er.

Diskussion

Undersøgelser for at give effektive strategier for overvinde T790M-medieret resistens er meget vigtige, da de fleste af de patienter, der blev behandlet med EGFR-TKI’er erhvervet resistens og T790M var årsag til modstanden i halvdelen af ​​disse patienter [5], [6]. Som den anden generation, irreversibel EGFR-TKI’er, såsom afatinib og dacomitinib, undlod at overvinde modstanden forårsaget af T790M [33], [34], andre foranstaltninger, såsom EGFR dual målrettet med cetuximab og afatinib [35] og tredje -geneneration, mutant-selektiv EGFR-TKI’er [36] – [38] bliver aktivt evalueret. De foreløbige rapporter angående effekten af ​​mutant-selektive EGF-TKI’er er ganske lovende [39]. Disse hidtil ukendte lægemidler forventes at være klinisk tilgængelig i den nærmeste fremtid for patienter med T790M-medieret resistens. på grund af tumor heterogenitet og genomisk ustabilitet, fremkomsten af ​​resistens over for disse stoffer synes dog at være uundgåelig kræver andre terapeutiske strategier.

Chen et al. påvist, at EGFR-specifikke siRNA’er inhiberes kraftigt cellevækst og apoptose i H1975 celler indeholdende både L858R og T790M [40]. Selv knock-down af T790M transkript af siRNA’er, når det kombineres med afatinib, var effektiv i at kontrollere T790M-mutant, lungecancerceller. I tråd med dette, vi bekræftede også den fortsatte EGFR afhængighed T790M-mutant, lunge kræftceller. Dette er teoretisk plausibel i betragtning af at T790M reducerer kun begræd affinitet af EGFR-TKI’er, men aktiverer ikke redundante mekanisme for kræft-celle overlevelse, undtagen i sjældne tilfælde har anden samtidig, resistente mekanismer. Derfor kunne nedregulering af EGFR udøve anti-cancer effekt på kræftceller med EGFR afhængighed samt forbedre effektiviteten af ​​EGFR-TKI’er i fastsættelsen af ​​et nedsat niveau af EGFR. Vores undersøgelse først påvist, at EGFR nedregulering forårsaget af CX-4945 forbedret effektiviteten af ​​EGFR-TKI på EGFR-mutant lungecancerceller med T790M-medieret resistens.

Indtil nu er det blevet kontroversielt forblev hvorvidt autofagi er forbundet med følsomhed eller resistens over for EGFR-TKI’er. Men nogle papirer nylig foreslået, at induktionen af ​​autofagi er nødvendig for den cytotoksiske virkning af EGFR-TKI’er i primære og resistente celler med mutant EGFR [29], [32], [41]. De viste også, at øget autofagi kræves for overlevelse i EGFR-uafhængig EGFR-mutant lungecancer celle [41]. I vores undersøgelse, både resistente celler stadig havde EGFR-afhængighed og inhibering af autofagi førte til en reduktion af celledød. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, vores resultater viste, at induktionen af ​​autofagi har en vigtig rolle at overvinde erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er selvom mekanismerne til at inducere autofagi kan være anderledes.

EGFR på celleoverfladen styres stramt af en kompleks, endocytisk mekanisme [42]. Efter ligand-medieret aktivering og internalisering, er EGFR enten recirkuleres tilbage til celleoverfladen eller transporteres til lysosomal nedbrydning [42] – [44]. Ændring af dette fine balance kan ændre niveauet af EGFR på celleoverfladen. Øget autophagosomes i cytoplasma kunne fusionere med endosomer indeholdende EGFR, og dermed forårsager dannelsen af ​​amphisomes. Efterfølgende kan autolysomes udviklet af fusion med lysosomer føre til EGFR nedbrydning (fig. 6). I vores undersøgelse CX-4945 induceret autophagosomes mere potent end rapamycin, en velkendt mTOR inhibitor i EGFR-mutant, lungecancerceller med T790M. Nedsat EGFR i disse celler ved CX-4945 ville være forårsaget af den tidligere nævnte fremgangsmåde. Dette understøttes af resultaterne viser, at øget internaliseret EGFR på autophagosomes af CX-4945 kunne visualiseres i fluorescerende cytokemisk farvning og hæmning af autophagy af 3 mA eller Atg7 siRNA behandling restaureret EGFR-niveau. Derfor induktion af autofagi fører til forøget EGFR nedbrydning, når det kombineres med EGFR-TKI’er, kunne være en af ​​de lovende terapeutiske muligheder for EGFR TKI-resistente cancerceller med EGFR afhængighed.

EGFR leveres fra plasmamembranen til tidlige endosomer i endocytiske vesikler. Disse vesikler er tilbage til plasmamembranen via genanvendelse pathway. Dog kan vesikler også fusionere med authophagosomes, og derefter direkte med lysosomer fører til forringelse af EGFR.

CX-4945-induceret autophagy kan ikke medieres ved inhibering af chaperoning funktion af Hsp90 fordi 17-DMAG kunne fremprovokere autofagi. Tidligere undersøgelser har vist, at undertrykkelse af CK2 inducerer autophagic celledød gennem modulation af mTOR og MAPK signalering i humane glioblastom celler [45]. I tråd med dette, fandt vi, at nedregulering eller hæmning af CK2α kunne føre til induktion af autophagy i lungekræft celler med EGFR mutation. Men celledød ikke forekomme, når resistente celler blev behandlet med CX-4945 eller CK2α siRNA. Dette resultat kan skyldes den karakteristiske af EGFR-mutant cancerceller. Downstream signalings (PI3K /AKT og MAPK) af celler med EGFR-mutation er meget afhængige af EGFR aktivitet. Således kan inhibering af kun CK2 ikke være tilstrækkelig til modulering af mTOR og MAPK signalering i disse celler. Yderligere detaljerede mekanismer bør undersøges ved følgende studier.

Ikke desto mindre, vi foreslog, at CX-4945 kan være nyttige til behandling af EGFR-mutant lungekræft med T790M-medieret resistens. for den kliniske anvendelse, synes dog sikkerheden spørgsmål i forbindelse med denne nye lægemiddel, der skal løses, fordi det kunne inhibere funktionen af ​​Hsp90 som er vigtigt i modning og stabilitet af både normale proteiner og oncoproteiner. Derfor er det usikkert, om det kan nå effektiv serumkoncentration uden signifikante bivirkninger betragtning af at vi for det meste brugt 5um af CX-4945 i vores undersøgelse. Derfor er yderligere undersøgelser nødvendige for at løse den passende dosis af CX-4945 og sikkerhedsprofil.

Sammenfattende autophagosome-medieret EGFR nedregulering fremkaldt af CX-4945, en potent og selektiv CK2 inhibitor, forbedrer effekt af EGFR-TKI på EGFR-mutant lunge-cancerceller med resistens ved T790M.