PLoS ONE: Molekylær undertyper i fase II-III Colon Cancer Defineret ved Genomisk ustabilitet: Tidlig Gentagelse-risiko forbundet med en høj Copy-nummer Variation og Tab af RUNX3 og CDKN2A

Abstrakt

Målsætning

Vi søgte at undersøge forskellige molekylære undertyper defineret af genomisk ustabilitet, der kan være relateret til tidlig død og tilbagefald i tyktarmskræft.

Metoder

Vi søgte at undersøge forskellige molekylære undertyper defineret af ustabilitet på mikrosatellitter (MSI), ændringer i mønstre for methylering (CpG ø methylator fænotype, CIMP) eller kopiere nummer variation (CNV) i 8 gener. Trin II-III tyktarmskræft (n = 64) blev undersøgt ved methylering-specifik multipleks ligeret probe amplifikation (MS-MLPA). Korrelation af CNV, CIMP og MSI, med mutationer i KRAS og BRAFV600E blev bedømt for overlap i molekylære undertyper og tidlig recidiv risiko ved uni- og multivariate regression.

Resultater

CIMP fænotype fandt sted i 34% (22/64) og MSI i 27% (16/60) af tumorerne, med bemærkede CIMP /MSI overlap. Blandt de molekylære undertyper, en høj CNV fænotype havde en associeret odds ratio (OR) for recidiv på 3,2 (95% CI 1,1-9,3; P = 0,026). Tab af CACNA1G (OR 2,9, 95% CI 1,4-6,0; P = 0,001), IGF2 (OR 4.3, 95% CI 1,1-15,8; P = 0,007), CDKN2A (p16) (OR 2,0, 95% CI 1,1-3,6; P = 0,024), og RUNX3 (OR 3,4, 95% CI 1,3-8,7; P = 0,002) var forbundet med tidlig recidiv, mens MSI, CIMP, KRAS eller BRAF V600E mutationerne ikke var. CNV var signifikant højere i afdøde patienter (CNV i 6 af 8) sammenlignet med overlevende (CNV i 3 ud af 8). Kun scene og tab af RUNX3 og CDKN2A var betydelige i multivariable risiko-model for tidlig recidiv.

Konklusioner

Et højt kopi nummer variation fænotype er en stærk indikator for tidlig recidiv og død, og kan indikere en dosisafhængig relation mellem genetisk ustabilitet og resultat. Tab af tumorundertrykkere RUNX3 og CDKN2A var relateret til tilbagefald risiko og garanterer yderligere undersøgelse

Henvisning:. Berg M, Nordgaard O, Kørner H, Oltedal S, Småland R, Søreide JA, et al. (2015) Molekylær Undertyper i fase II-III Colon Cancer Defineret ved Genomisk ustabilitet: Tidlig Gentagelse-risiko forbundet med en høj Copy-nummer Variation og Tab af

RUNX3

CDKN2A

. PLoS ONE 10 (4): e0122391. doi: 10,1371 /journal.pone.0122391

Academic Redaktør: Robert Dante, Institut national de la santé et de la recherche médicale, FRANCE

Modtaget: 13. oktober 2014 Accepteret: Februar 20, 2015; Udgivet 16. april, 2015

Copyright: © 2015 Berg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret delvist af tilskud fra Folke Hermansens Cancer Foundation (tilskud # 424.508 til KS for MB som ph.d.-stipendiat, http: //www.folke-fondet.org/Folke_Hermansen.html) og forskningsfonden Mjaaland Cancer (tilskud # 424.506 til KS)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en stor global sundhed byrde, og udvikler gennem akkumulering af genetiske og epigenetiske ændringer [1-3]. Genetisk ustabilitet driver processen fra neoplastisk dannelse til invasiv vækst og udvikling af metastaser. Således kan identificere specifikke molekylære ændringer og deres forhold til de kliniske endpoints (sygdom fremskridt, tilbagefald eller død) give en bedre forståelse af sygdommen proces. I CRC, har tre fænotypisk forskellige undergrupper defineret gennem ustabilitet i kromosomer, mikrosatellitter eller epigenetiske forandringer [3-5].

Kopier nummer variation (CNV) henviser til strukturelle og numeriske ændringer på kromosom-niveau, mens mikrosatellit ustabilitet (MSI) opstår, når gentagne basepar enheder har forskellige antal gentagelser i tumorceller sammenlignet med tilsvarende normale celler, som kan producere et skift i læserammen på DNA’et. Sidste er CpG ø methylator fænotype (CIMP), som angiver en afvigende methylering spektrum af DNA (hypo- eller hypermethylering), der ændrer genekspression uden direkte inddragelse genetiske modifikationer [6-8].

kan genetiske ændringer involverer store strukturelle ændringer på det kromosomale plan og /eller numeriske ændringer på kritiske regioner, der kan resultere i tumorfremmende genekspression. For de fleste kræftformer, er omfattende kromosomale ustabilitet (CIN) observeret enten som hele kromosom kopi nummer forandring gennem gevinster og /eller tab af kromosom regioner, eller som strukturelle ændringer skaber fusionsgener [9-11]. I modsætning til kromosomale og mikrosatellit ændringer eller DNA-mutationer, er epigenetisk forandring ikke ændre selve DNA’et men involverer kemiske modifikationer af DNA, såsom methylering og histon modifikationer [12]. Genekspression reguleres gennem forskellige mekanismer, herunder CpG-ø methylering, hvor øget methylering på cytosiner i CpG sites reducerer genekspression.

Historisk MSI og CNV (CIN) blev betragtet som gensidigt udelukker hinanden. Men for nylig en overlapning mellem de nævnte fænotyper er blevet vist, [13]. Endvidere CIMP fænotype synes at være forbundet med MSI fænotype, men er blevet rapporteret kombinationer af alle fænotyper, herunder “triple negativer” [5]. MSI og BRAF mutation status er hovedsageligt observeret i de samme prøver, og begge er foreslået at være klinisk relevant [14,15]. Patienter med tumorer i MSI type er forbundet med specifikke kliniske, molekylære og histopatologiske funktioner [4,16-19], og har en bedre prognose sammenlignet med patienter med CNV tumorer [20]. Endvidere er særlig tumor placering langs kolorektal kontinuum forbundet med stedspecifikke forskelle i den genetiske sammensætning af tumorer. For eksempel rektale cancere er mere tilbøjelige til CNV ændringer type og tyktarmskræft (især den proximale del) er mere tilbøjelige til MSI fænotypen [17]. Undersøgelse af nuværende iscenesættelse af CRC, som er i vid udstrækning baseret på lymfeknude status [21], har anerkendt mangler og uoverensstemmelser, der er debatteret [22]. Derfor flere efterforskere foreslå alternative molekylære mellemstationer strategier [5,23-26], i hvilke grupper er baseret på tilstedeværelsen af ​​CIMP, MSI, KRAS og BRAF-mutationer. Mens dette har endnu ikke nået den kliniske praksis, forestillingen om, at sub-sites inden tyktarmen kan harbor molekylære forskelle, der vedrører særlige karakteristika har betydning [17]. Vi har tidligere vist, at lymfeknude numre kan være afhængig af sub hjemmeside placering og deres relaterede molekylære ændringer, som kan være relateret til klinisk resultat [19,27]. Således yderligere udforskning af de genomiske forskelle i node-negative og lymfeknude-positiv tyktarmskræft er af interesse at øge forståelsen af ​​CRC og relateret sygdom adfærd.

Kopiér nummer varianter (CNVs) som en vigtig type genetisk variation, der ændrer menneskelige fænotyper [28,29], herunder menneskelige kræftformer. Multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA) er en stadig mere almindelig anvendt teknik til bestemmelse af relativ dosering DNA-sekvens (eller kopiere nummer variation) [29]. MLPA er en multiplex PCR-assay, der anvender op til 40 prober, der hver især er specifikke for en anden DNA-sekvens (hovedsagelig exoner af et specifikt gen af ​​interesse), at vurdere den relative kopital af hver DNA-sekvens [29]. MLPA kan også bruges til methylering status beslutsomhed, kopiere nummer analyse segmentvis duplikeres regioner, udtryk profilering og transgen genotypning. MLPA er en omkostningseffektiv alternativ i flere arbejdskraftintensive og dyre metoder, såsom vifte komparativ genomisk hybridisering (aCGH) [29,30]. Desuden MLPA giver mulighed for samtidig undersøgelse af status for methylering og CNV i tumorer, som tidligere rapporteret i retinoblastoma [31].

Således er formålet med denne undersøgelse var at undersøge forekomsten af ​​molekylære undertyper i trin II og III tyktarmskræft patienter ved hjælp MLPA at bestemme methylering mønster og CNVs i en defineret probe sæt, og til at vurdere forholdet til aggressiv sygdom adfærd, defineret som tidligt recidiv ( 3 år) efter operationen

Materialer og. Metoder

Patientprøver

undersøgelsen kohorte er afledt af en fortløbende serie af 213 trin i-III kirurgisk behandlet tyktarmskræft ved Stavanger Universitetshospital i en periode på 4 år med detaljer som tidligere beskrevet [ ,,,0],32]. Undersøgelsen blev godkendt af den regionale etiske komité (# 197,04), og alle patienter gav informeret samtykke forud for inklusion. Alle patienter blev opereret med helbredende hensigt. Patienter med lymfeknude positive (pn +) fase III-sygdom, der var fysiologisk fit (f.eks ECOG performance status 0-1), blev tilbudt adjuverende behandling i henhold til nationale retningslinjer på det tidspunkt.

For det aktuelle projekt, en sub -cohort af patienter med tyktarmskræft stadie II og III blev rekrutteret. Patienter, som havde enten en opfølgning på mindst 36 måneder på tidspunktet for udvælgelsen (= 3 år, på hvilket tidspunkt 90% af gentagelser forekomme), eller som var død af CRC ved påbegyndelsen af ​​det aktuelle projekt var støtteberettigede. I alt 64 patienter opfyldte disse kriterier og blev inkluderet for MLPA analyse.

Opfølgning blev udført ved hjælp af den 11-cifrede CPR-nummer og adgang til elektroniske patientjournaler for eventuelle tegn på tilbagevendende sygdom eller en alvorlig hændelse relateret til tyktarmskræft. Udvælgelsen var baseret på den tilgængelige på 3 år følge op, hvilket udelukker enhver patient med kortere opfølgning ved påbegyndelsen af ​​undersøgelsen oplysninger. Gentagelse blev defineret som enhver locoregional eller systemisk tilbagefald af sygdommen på tidspunktet for opfølgning.

DNA-ekstraktion

DNA fra de 64 patienters tumorprøver blev ekstraheret og isoleret fra frisk frosset væv ved hjælp DNeasy Mini kit eller AllPrep DNA . RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), som tidligere beskrevet [33]

multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning (MLPA)

multiplex ligation-afhængige sonde forstærkning procedure, ved hjælp af SALSA MS-MLPA kit ME042-B1 CIMP probe mix (til påvisning af methylering status i promotorregionerne af 8 forskellige gener, RUNX3, MLH1, NEUROG1, CDKN2A, IGF2, CRABP1, SOCS1 og CACNA1G) som angivet i tabel 1, blev udført i henhold til sælgerne anbefalinger (MRC-Holland, Amsterdam, Holland), og som tidligere beskrevet [34]. Som en aktiverende mutation af BRAF

V600E er tæt forbundet med CIMP positivitet [35], en mutation probe er inkluderet i SALSA MS-MLPA kit, der detekterer V600E (1799T A) somatisk mutation, hvis dette er til stede i prøve.

fra alle 64 DNA-prøver, 100 ng DNA blev varmedenatureret i et samlet volumen på 5 pi Tris-EDTA-buffer, og yderligere udført som anbefalet af leverandøren. Kort fortalt blev en blanding af probe-mix (ME042, MRC-Holland, Amsterdam, Holland) og puffer sat til det denaturerede DNA og prober fik lov til at hybridisere til DNA’et ved 60 ° C i 16 timer. Hver prøve blev delt i to rør: hvoraf den ene blev ligeret, mens den anden blev ligeret og derefter fordøjet ved hjælp af methylering-sensitive restriktionsenzym

Hhal

. Begge reaktioner blev derefter underkastet en PCR-reaktion under anvendelse af et termisk cykliseringsapparat (GeneAmp 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og fragmentet analysen foretages på en kapillær sequencer (ABI 3130

xl Salg, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

ekstraherede DNA fra normal colon mucosa blev anvendt som en normal reference (n = 12 prøver). Derudover blev de kolorektal cancer kommercielle cellelinier Caco-2 og HT-29 anvendt som kontroller kræft (se supplerende oplysninger, S1 data-fil, og S1 og S2 Fig).

De rå data fra analysen var analyseret med Coffalyser.NET (betaversion, MRC-Holland, Amsterdam, Holland).

Definitioner

CIMP.

Kriterier for scoring af CIMP fænotype var mere end 20 % methylering af mindst en tredjedel af proberne inden for mindst tre af de fem gener i Weisenberger panelet [35], som tidligere beskrevet [34].

CNV.

i CNV fænotype scoring blev alle otte gener undersøgte brugt. Kopiér nummer variation (CNV) blev anvendt som proxy for i undersøgelsen kromosomale ustabilitet (CIN). Tab og gevinst blev defineret ved hjælp af relative forhold mellem prøve vs reference for en sonde var mindre end 0,7 eller højere end 1,3, hhv. For region analyse blev aberration i en eller flere sonder defineret som CNV i regionen, og en høj CNV fænotype, hvis fem eller flere af de otte regioner (1p36.11, 3p22.2, 5q31.1, 9p21.3, 11p15. 5, 15q24.2, 16p13.13 og 17q21.33) var unormal.

MSI.

MSI fænotype blev undersøgt på grundlag af Bethesda panel af gener ved hjælp af fragment analyse, som tidligere beskrevet [36]. Endvidere blev status for methylering af MLH1-genet under anvendelse MLPA anvendes til at korrelere status for methylering i forhold til MSI. I det følgende MSI status refererer til resultaterne fra Bethesda panelet, mens MLH1 undersøgt af MLPA metode omtales som MLH1 methylering.

mutationsanalyser

KRAS mutationsanalyser blev udført som tidligere beskrevet i [37]. BRAF mutation status blev bestemt på grundlag af to forskellige metoder. En, den MLPA metoden [34], hvori BRAF mutation probe genereret et signal, hvis V600E mutation var til stede, og; sekunder, ved hjælp af konventionel PCR og sekventering analyse, som tidligere beskrevet [38].

Etik

Etisk godkendelse til undersøgelsen blev opnået fra den regionale etiske komité, og alle patienter samtykke til optagelse i undersøgelsen, som tidligere beskrevet [19].

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af

Statistisk Package for Social Sciences

(IBM SPSS v. 20). Beskrivende data præsenteres som tal og satser (%) eller medianer med interkvartile intervaller (IQR), hvis ikke andet er anført. Mann-Whitney U-test blev anvendt til at sammenligne løbende data mellem grupper, når data ikke har en normalfordeling. Fishers eksakte test blev anvendt til 2×2 tabeller til at sammenligne kategoriske data, og odds ratio (OR) præsenteret med 95% konfidensinterval (95% CI) for væsentlige risikofaktorer. En multipel logistisk regressionsanalyse ved hjælp af både ind og frem modellering blev udført for at evaluere uafhængige risikofaktorer for tidlig recidiv (ja /nej) som et dikotomisk variabel. Køn og alder blev inkluderet i modellen, og modeller blev kontrolleret for CIMP, CNV og MSI samt KRAS, BRAF mutation status. Væsentlige faktorer findes på univariate risiko-analyser indgik i forudsigelsen model. En Hosmer-Lemeshow Goodness-of-fit test blev udført for at indikere stabiliteten af ​​modellen [39], og bidrag til den model variation evalueret af R-square statistik for logistisk regressionsanalyse. Alle tests var to-sidet og en P 0,050 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Klinisk information om tilbagefald og overlevelse

Af de 64 patienter, 58% var kvinder. , og median alder var 76 år på tidspunktet for kirurgi. Klinisk-patologisk og molekylære data for de inkluderede emner er præsenteret i tabel 2. Tidlig gentagelser blev observeret i 26 patienter (41%), heraf 16 havde systemisk recidiv, 7 havde loco-regional tilbagefald, og tre havde både loco-regionalt og systemiske gentagelser . Blandt de 26 patienter med tilbagevendende sygdom, 15 (58%) var døde af sygdommen (23% af undersøgelsen kohorte) på tidspunktet for undersøgelsen integration. Som forventet 66% af fase III (node ​​positive) patienter oplevede tilbagefald sammenlignet med 23% i fase II, for en OR på 6,9 (95% CI 2,2-21,3; p 0,001).

mikrosatellit ustabilitet og mutationsmønstre data

MLPA analyser fra tumor prøver var teknisk succes i alle 64 inkluderede patienter, med hensyn til methylering analyse kromosomanalyse, og BRAF

V600E mutation analyse. Derudover KRAS mutation analyser var vellykkede for alle 64 patienter, og 60 (94%) havde en vellykket MSI status.

Hyppigheden af ​​mutationer i KRAS, BRAF

V600E og tilstedeværelse af MSI pr antal methylerede gener eller pr antal kromosomafvigelser er vist i fig 1A og 1B, henholdsvis.

(A) Fordeling vs antal methylerede gener (ingen havde methylering i alle gener, således 8 vises ikke). (B) Fordeling vs antallet af gener med kromosomafvigelser

MSI blev fundet i 16 (27%) af prøverne. Methylering af MLH1 blev påvist i 17 (28%) prøver, og methylering af MLH1 og MSI blev samtidigt set hos 14 (23%) af patienterne (p 0,001, Fishers eksakte test). MSI og CIMP fænotype, samt BRAF

V600E mutation, og MLH1 methylering var signifikant statistisk forbundet med højresidig tumor placering (p 0,01, p 0,01, p 0,01 og p = 0,01 for MSI, CIMP , BRAF

V600E og MLH1 meth henholdsvis ved hjælp af Fishers eksakte test)

Det mediane antal denatureret gener afveg betydeligt mellem MSI og MSS (mikrosatellitmarkørerne stabil) prøver, (7 og 2, henholdsvis; p. 0,01), BRAF vildtype og muterede prøver (2 og 7; p 0,01), større tumor størrelse og mindre end 5 cm (3 og 2; p = 0,04), og mandlige og kvindelige køn (2 og 4; p = 0,03)

BRAF

V600E mutation blev observeret i 15 (23%) prøver, 11 i MSI-gruppen, hvilket indikerer en signifikant samvariation mellem de to afvigelser, (p. 0,01). Endvidere blev BRAF

V600E mutationer signifikant associeret hunkøn (p = 0,02), methylering af MLH1 (p 0,01), og CIMP fænotype (p 0,01). BRAF resultater blev valideret ved at vise, BRAF-wt i hver (n = 12) normale prøver og i Caco-2-cellelinje, men med BRAF

V600E mutation til stede i HT-29 cellelinien, som forventet.

Mutationer i KRAS blev påvist i 20 prøver (33%), hvoraf otte prøver var negative for CNV, CIMP og MSI. Mutationer i både KRAS og BRAF levede i to prøver, og i tre tilfælde KRAS mutation og MSI blev samtidigt observeret.

Genom kompleksitet

Prøverne blev kategoriseret for alle fænotyper, og grupperes på grundlag af deres kombinerede molekylære fænotyper. Overlapninger mellem alle fænotypiske undergrupper blev observeret. De kombinerede tumor fænotyper for alle patienter døde og levende er vist i tabel 3, og fig 1A og 1B og fig 2A-2C, henholdsvis.

(A) Den samlede undersøgte population, (B) Patienter live uden recidiv (overlevende for 3 år), (C) Patienter med tidlig recidiv eller død (inden for 3 år efter operationen)

Sammenligning frekvenser af kombineret fænotyper viste statistisk signifikant forskel for. overlevende gruppen sammenlignet med den afdøde (p = 0,037, binær logistisk regression). Af note, den tredobbelte negative og den eneste CNV fænotypen var forskellig mellem de afdøde patienter og de overlevende: 13% vs. 41% og 40% vs. 18%, (fig 2B og 2C). Isoleret MSI og CNV sameksisteret i kun én prøve (2%), mens 4 yderligere patienter havde også CIMP (tredobbelt positiv, 6%). MSI og CIMP var til stede i de samme prøver i 10 (16%) tilfælde, hvorimod der ikke blev observeret CIMP og CNV til fem (8%) prøver. MSI og CIMP fænotyper hyppigst præsenteret i kombination med andre fænotyper, og som fælles fænotype for kun én (2%) og to (3%) tilfælde hhv. I modsætning hertil fandtes CNV fænotype som eneste fænotype for 15 (23%) af prøverne.

Blandt de forskellige fænotyper, den tredobbelte positive og den tredobbelte negative blev de to grupper viser færrest gentagelser, 0 /4 (0%) og 4/22 (18%), henholdsvis. For de øvrige fænotypiske grupper, de gentagelser varierede fra 40 til 100%. Endvidere blev hyppigheden af ​​tredobbelt negativer i en undergruppe af patienter uden gentagelser (18/35) fundet at være signifikant forskellig fra den gentagelse undergruppe (4/25), p = 0,007.

Afvigelser og risiko for tidlig recidiv

for CIMP fænotype, en statistisk signifikant sammenhæng blev observeret med kvindelige køn (p = 0,001), højresidig placering af tumor (p = 0,001), og i tumorer viser MSI fænotype (p 0,01 ).

Den høje CNV fænotype blev observeret i 25 (39%) af 64 prøver, og var forbundet med tilbagevendende sygdom. High CNV fænotype blev fundet i 14 ud af 25 (56%) gentagelser, men kun 11 af 39 (28%) af dem i live, for en tilhørende odds ratio på 3,2 (95% CI 1,1-9,3; P = 0,026)

Statistisk signifikans blev også observeret i antallet af kromosomalt afvigende gener mellem afdøde patienter og efterladte (CNV median 6, IQR 3-7 vs CNV median 3, IQR 1-5; P = 0,001)., figur 2A

Der var flere afvigelser i den tidlige gentagelse gruppen samlet når særskilt sammenligning af antallet af afvigende prober til hvert gen mellem patienter uden tilbagefald og dem med tidlig recidiv, Fig 3. forskellen i antallet af afvigende positioner mellem overlevende og døde for CDKN2A, IGF2 og CACNA1G var statistisk signifikant, fig 4B. Når du bruger dikotomiseret status (afvigende /normal) for hvert gen, afvigelser i CACNA1G (p = 0,007), CDKN2A (p = 0,003) og RUNX3 (p = 0,032) var signifikant associeret med sygdom dødsfald.

(A) Boxplot der viser antallet af afvigende gener i afdøde patienter (højre) og efterladte (til venstre). (B) Boxplot der viser antallet af afvigende kromosom positioner i hver af de gener, undersøgte, i tilbagevendende (eller afdød) patienter (til højre) og patienter uden tidlig recidiv (til venstre).

Røde søjler repræsenterer mistede regioner og blå søjler repræsenterer gevinster. Linjer illustrerer gevinster og tab i patienter i live 3 år (blå og lilla, henholdsvis), og patienter afdøde af sygdom (grøn og rød, henholdsvis)

Mere specifikt tab af CACNA1G tillægges en OR på 2,9 (95% CI 1,4-6,0; P = 0,001) for tilbagefald, som 18 af 30 (60%) af patienterne med dette CNV gentog sammenlignet med kun 7 af 34 (21%) med normal status. Tab af IGF2 blev forbundet med en OR på 4,3 (95% CI 1,1-15,8; P = 0,007), som 23 af 47 (49%) gik igen, sammenlignet med 2 af 17 (12%) med normal status. Tab af CDKN2A havde en OR på 2,0 (95% CI 1,1-3,6; P = 0,024), med 61% recidiv for dem med tab i forhold til 30% for dem med normal status. Endelig blev tab af RUNX3 forbundet med en OR på 3,4 (95% CI 1,3-8,7; P = 0,002). Med tilbagefald forekommer i 64% med tab i forhold til 16% af dem med normal status

Der var ingen signifikant forskel mellem trin II og III med hensyn til hyppigheden af ​​de tre forskellige molekylære fænotyper (MSI, CNV og CIMP), og de kombinerede fænotyper, samt BRAF og KRAS-mutationer. Inaktivering af CACNA1G grundet methylering blev observeret hyppigst i BRAF muteret og MSI tumorer (p≤0.01), og oftest i tumorer placeret i den proksimale colon.

Multivariable modellering af tidlig-recidiv risiko

i en multipel logistisk regressionsmodel med variablerne CNV, CIMP, MSI, KRAS, BRAF, stage, tumor lokalisering og køn, den eneste variabel, der blev tilbageholdt i modellen for tilbagefald risiko var scenen. Analysere kræft-død som et resultat ved hjælp af de samme variabler blev CNV status inkluderet sammen med trin i modellen, men med brede konfidensintervaller for de justerede RYP’erne.

Introduktion de uafhængige gen afvigelser signifikant associeret med tidlig recidiv risiko (tab af RUNX3, CDKNA2A, CACNA1G og IGF2) og kontrollere for de ovennævnte molekylære undertyper og alder, køn, scene og tumor placering, afslørede en endelige model, der omfattede kun RUNX3 og CDKN2A sammen med scenen som prædiktorer for tidlig recidiv (tabel 4 ). En Hosmer-Lemeshow goodness of fit test (Chi-square 3,844; p = 0,572) viste en robust model. De R-square statistik (Cox Snell og Nagelkerke) blev rapporteret mellem 0,316 og 0,427, hvilket indikerer, at modellen forklarede mellem 31,6% og 42,7% af variationen i risikovurderingen

Diskussion

.

i den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi interaktion og overlapper mellem molekylære undertyper i tyktarmskræft med udvikling af tidlig tilbagefald efter operation. Som beskrevet, er der overlap mellem flere molekylære funktioner, der komplicerer klar skelnen mellem grupper for molekylær og klinisk relevans. Brug af MLPA for et panel af 8 gener, demonstrerede vi, at genet doseringseffekt af methylering og kromosomforandringer er delvist forbundet med molekylært underskrift og tilstedeværelse af mutationer, og angår også risiko for tidlig recidiv. Udover fase III, blev tidlig tilbagefald i forbindelse med tab af RUNX3 og CDKN2A, som begge er kendte tumorsuppressorgener i CRC og tidligere rapporteret at være associeret med kliniske resultater i CRC [40-43]. Dette kan potentielt anvendes som prognostisk information ud over den nuværende TNM-staging system for at undgå fejltarifering, som lymfeknude status (definition af node negativ eller positiv sygdom) har adskillige mangler, som er blevet diskuteret i detaljer andetsteds [21,22] . Også, der definerer patienter med risiko for tidlig recidiv kan lette målrettet og bedre skræddersyet overvågning efter kirurgi [44].

For kolorektal cancer, er tre brede molekylære fænotyper beskrevet, herunder CNV, MSI og epigenetiske ændringer [3,7 , 8]. Forskere har foreslået præcis klassifikation af 3, 4 og 5 grupper i fortiden [14,24-26], men ingen har endnu nået klinisk praksis. Omfanget af overlap mellem disse fænotypiske grupper er blevet undersøgt [5,14,16,25,45-47], men de kliniske implikationer af de molekylære fænotyper er hidtil vage. Brugen af ​​forskellige metoder, definitioner, scoring kriterier, og forskelle i type patient materiale undersøgte foretage sammenligninger vanskelige, hvilket understreges af overlapningen fundet i denne undersøgelse. Derudover og som vi har dokumenteret nylig, anvendelse af forskellige kriterier for CIMP-status kan varierer med brug af inkluderet gener og sonder [34], og dermed skaber forskellige resultater mellem studier, som hindrer sammenligning.

i alt blev der MSI observeret i 27% af tyktarmskræft. Dette er i overensstemmelse med andre undersøgelser, hvor rektal kræft ikke er inkluderet, som tyktarmskræft har en højere forekomst af MSI. Både MSI fænotype og MLH1 methylering blev fundet i 14/60 prøver (23%). To prøver viste MSI fænotype uden MLH1 methylering, og tre prøver viste MLH1 methylering uden MSI. Den omfattende overlap mellem disse funktioner understøtter det faktum, at MLH1 inaktivering forårsager MSI. Imidlertid har en afvigelse i MLH1 methylering og MSI også blevet observeret af andre [48,49], og illustrerer, at adskillige DNA fejlparringsreparationsgener herunder MLH1 årsag MSI. Tværtimod betyder methylering af MLH1 ikke nødvendigvis føre til forringelse af mismatch repair maskiner.

BRAF

V600E mutation status blev forudsagt ved hjælp af både konventionel DNA-sekventering og MLPA med specifikke prober til det punkt mutation. Begge resultater var i 100% konkordans, og vise MLPA metoden for at være pålidelige.

Mutationer i BRAF

V600E og KRAS var oprindeligt rapporteret som gensidigt udelukkende [50]. En dobbelt aktivering af MAPK-vejen er blevet foreslået at føre til differentiering og celleældning, snarere end som vækstfremmer som er resultatet af en enkelt mutation [51]. Men for to patienter i vores prøveserie blev mutationerne fundet, at sameksistere, omend med tal for lavt til at tillade enhver klinisk fortolkning.

Patienter med tidlig recidiv viste numerisk mere kromosomafvigelser (fig 3 og 4) . Dette understøtter forslaget om, at CNV kunne forudsige en dårligere prognose [52], som angivet ved en høj CNV i den aktuelle undersøgelse. For stadie II patienter, den numeriske forskel i kromosomafvigelser mellem gentagelse og ingen gentagelse var statistisk signifikant (p = 0,022), som var den numeriske forskel for afdøde eller overlevende patienter (p = 0,007). Denne forskel kunne ikke observeres for stadie III patienter. Som stadie II patienter normalt behandles med kirurgi alene, kan dette anvendes som en prognostisk markør for tilbagefald, og potentielt som en hjælp, når du vælger stadie II patienter, der vil have gavn af adjuverende behandling. Dog skal resultaterne tolkes med forsigtighed baseret på stikprøvestørrelsen og valideret i større patientgruppe serie at blive bekræftet.

En interessant observation er, at kromosomafvigelser, snarere end methylering selv, af gener indgår i CIMP panelet synes at være de vigtigste for kliniske resultat af sygdom. Dette indebærer, at generne i CIMP panelet har tumorsuppressoraktivitet, og at deres mekanistiske funktion er vigtig med hensyn til tyktarmskræft, og ikke kun for methylering. Faktisk er både RUNX3 og CDKN2A (også kendt som p16), kendt tumorsuppressorgener. Afvigelser i RUNX3 er blevet rapporteret som en tidlig begivenhed i kolorektal cancer progression [40]. Den normale aktivitet af CDKN2A (også kendt som p16) genet er som en tumorsuppressor, forhindrer ukontrolleret celleproliferation ved at initiere cellecyklusstop og apoptose. Den prognostiske betydning af CDKN2A inaktivering i kolorektal cancer er blevet undersøgt, men er blevet fundet klare associationer [43]. Endvidere normal funktion af CACNA1G påvirker celledeling og apoptose, og forstyrre denne calcium signalering kan være vigtigt i kræft, da disse processer vejlede yderligere fremskridt i cellulær liv. Dette indikerer dens instrumentale betydning, og at nonfunctional CACNA1G skifter cellerne over til en mere aggressiv funktion [53]. Desuden er det protein hormon IGF2 involveret i udvikling og vækst af cellen, og er involveret i carcinogenese [54,55].

Ved undersøgelse af antallet af denatureret positioner, der var betydeligt mere methylering i MSI tumorer sammenlignede til MSS, og i BRAF muterede prøver sammenlignet med vildtype. Dette er sandsynligvis fordi methylering af CRC-kritiske gener forårsager MSI i ikke-familiær colorectal cancer [56]. Antallet af denatureret positioner var imidlertid også statistisk signifikant større i store tumorer i forhold til mindre, og i tumorer fra kvinder i forhold til mænd.

Patienter

Konklusioner

Trin II-III tyktarmskræft, der oplever tidlige kræft gentagelser efter operationen havde signifikant flere kromosomafvigelser (median 6 vs. median på 3 for levende patienter) end patienter uden tegn på sygdom på 3 år opfølgning. Tab af tumorsuppressorgener RUNX3 og CDKN2A (p16) ser ud til at holde vigtige kliniske oplysninger ud over node-status (fase III node positive sygdom).