PLoS ONE: Topoisomerase 2 Alpha Samarbejder med Androgen receptor til at bidrage til prostatakræft Progression

Abstrakt

Overekspression af TOP2A er forbundet med risiko for systemisk progression i patienter med prostatacancer, og højere niveauer af TOP2A blev fundet i hormon resistente tilfælde. At belyse den mekanisme, hvorved høje niveauer af TOP2A bidrage til tumorudvikling vi genererede TOP2A overudtrykker prostatacancercellelinjer. Vi viser, at TOP2A fremmer tumor aggressivitet ved at inducere kromosomale omlejringer af gener, der bidrager til en mere invasiv fænotype. Anti-androgen behandling alene var ineffektiv i at slå TOP2A overekspression celler på grund af aktivering af en androgen receptor-netværk. TOP2A giftstoffer dræbte tumorceller mere effektivt tidligt i progression kurset, mens senere stadier de gav større fordel, når det kombineres med anti-androgen terapi. Mekanistisk, finder vi, at TOP2A øger androgen signalering ved at lette transskription af androgen responsive gener og dermed fremme tumorcellevækst. Disse undersøgelser afslørede en sammenhæng mellem TOP2A og androgen receptor signalvej, der bidrager til prostatakræft progression og giver følsomhed over for behandlinger

Henvisning:. Schaefer-Klein JL, Murphy SJ, Johnson SH, Vasmatzis G, Kovtun IV (2015 ) Topoisomerase 2 Alpha Samarbejder med Androgen receptor til at bidrage til Prostata Cancer Progression. PLoS ONE 10 (11): e0142327. doi: 10,1371 /journal.pone.0142327

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: 10 juni, 2015; Accepteret: 19 okt 2015; Udgivet: 11. november 2015

Copyright: © 2015 Schaefer-Klein et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en Waterman Biomarkør Discovery tilskud og center for Individualiseret Medicine ved Mayo Clinic. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

DNA topoisomerase 2 alpha (TOP2A) er en væsentlig nukleare enzym, der kræves til løsning af topologisk stress i forbindelse med DNA-replikation. TOP2A introducerer forbigående dobbeltstrengede pauser (DSB) på DNA i en ATP-afhængig måde at tillade ændringer i DNA-topologi og eliminere over-vikling [1,2]. TOP2A funktion er afgørende i mange biologiske processer, herunder replikation, transkription, DNA-reparation og kromosom struktur vedligeholdelse. Det udtrykkes ved høje niveauer i delende celler som dens niveau er kendt for at blive reguleret gennem cellecyklus, og det er ofte brugt som en proliferativ markør [3,4]. Abnormaliteter af TOP2A protein er forbundet med kromosomalt ustabilitet [5]. TOP2A menes at spille en vigtig rolle i decatenation checkpoint under mitose, en mekanisme ansvarlig for korrekt kromosomal segregering [6-8]. Højt TOP2A som indikator for mere aggressiv adfærd og avancerede trin blev rapporteret i flere kræftformer [9,10]. Målretning TOP2A og efterfølgende celleproliferation, er blevet anvendt som et terapeutisk tiltag til rutinemæssigt behandle visse maligniteter [11]. Lægemidler, der tilhører klassen af ​​TOP2A giftstoffer udgør størstedelen af ​​den godkendt til klinisk brug midler. Etoposid og doxorubicin mål både top2 enzym isoformer, A og B, ved at gribe ind deres DNA spaltning /ligation cyklus, overtalelse DNA DSBs og udløser celledød [12,13]. En anden klasse af top2 målretning forbindelser, top2 katalytiske hæmmere, undgå at fremprovokere dannelsen af ​​protein-bundet DNA DSB, men fungerer som ikke-kompetitive inhibitorer af TOP2 ATPase aktivitet [12]. Effekten af ​​TOP2A giftstoffer menes at afhænge af niveauet af TOP2A protein [5] og dets enzymatiske aktivitet [14]

. En række undersøgelser har vist, at forhøjede niveauer af TOP2A konto for højere følsomhed af cellerne til TOP2A giftstoffer etoposid og doxorubicin [15,16]. Aktivitet af TOP2A enzymet reguleres af post-translationelle modifikationer [14-22]. Phosphorylering af TOP2A på rester inden det katalytiske domæne påvirker dets enzymatiske aktivitet [17, 21]; og mutationer ved nogle af disse steder blev rapporteret at tage højde for modstand af tumorceller til TOP2A giftstoffer [14]. Selv niveauer af TOP2A protein og dets aktiviteter anses vigtige bidragydere til følsomheden af ​​tumorceller til TOP2A giftstoffer, er TOP2A også blevet vist at associere med resistens mod kemoterapi, både

in vitro

in vivo

, gennem mekanismer for ændring af intracellulær fordeling og apoptose hæmning [23,24]. Høje niveauer af protein DLX4 viste sig at stimulere reparation af DNA DSB induceret af doxorubicin gøre stoffet ineffektive [25].

Modstand mod TOP2A giftstoffer, observeret i klinisk ildfaste tumorer [26], og udvikling af sekundære kræftformer, såsom myeloid leukæmi, som et resultat af

de novo Salg omlejringer [12,27], er de største begrænsninger ved anti-TOP2A terapi. Yderligere undersøgelse fuldt ud at forstå faktorer og mekanismer bag tumor respons på TOP2A hæmmende medicin er nødvendig.

TOP2A ofte overudtrykt i aggressiv prostatakræft (PCA). Tidligere undersøgelser har vist en positiv korrelation mellem ekspressionsniveauet af TOP2A og Gleason score (GS) [28,29]. De karcinomer med det højeste udtryk for TOP2A var dårligt differentieret [28]. Forhøjede niveauer af TOP2A blev også fundet i hormon-resistent PCa af GS 8-10 [29]. Vores gruppe har fundet, at overekspression af TOP2A var signifikant forbundet med øget risiko for systemisk progression i PCA patienter [30]. Den TOP2A proteinniveau var den stærkeste prædiktor for udfaldet i forbindelse med

ERG

udtryk [31].

TMPRSS2-ERG

fusion, den mest almindelige omlejring observeret i PCa påvirker op til 60% af tilfældene [32,33]. Mekanismen underliggende generation af

ERG

fusion er blevet undersøgt [34,35]. Haffner et al. har vist, at androgen receptor (AR) og TOP2B co-rekrutteret til regulatoriske elementer af androgen responsive gener upon transkription og udløser dannelsen af ​​DNA DSB. Disse pauser menes at være særdeles rekombinogene og når repareret resultat i produktionen af ​​

de novo

fusionsgener, såsom

TMPRSS2-ERG

[35]. Tilsvarende er TOP2B rekrutteret til andre steroid receptorer: østrogen receptor målgener upon østrogen signalering [36,37]. Selv TOP2A og B-proteiner har lignende cellulære funktioner i løsningen DNA overwinding ved at indføre DSBs, ingen undersøgelse rapporteret et samarbejde af TOP2A med transskription maskiner på en måde analog med TOP2B. Trods en rapporteret korrelation mellem høje niveauer af TOP2A og dårligt resultat ved cancer, den nøjagtige mekanisme bag mere aggressiv fænotype forbundet med TOP2A er ikke kendt. Top2 giftstoffer, såsom mitoxantron og doxorubicin, er lejlighedsvis ordineret til behandling af kastrationsresistent metastaserende PCa viste sig at give kun palliative fordele [38]. På den anden side, standard adjuverende androgen deprivation terapi syntes at kun være effektiv i gruppen af ​​patienter, hvis tumorer udtrykte højt TOP2A og er positive for

ERG

fusion [30,31]. Det forbliver uklart, om disse patienter kan drage fordel af behandling med TOP2A inhibitorer i en adjuvans indstilling. I denne undersøgelse har vi udviklet en celle model til at undersøge rollen af ​​TOP2A i tumorudvikling og vurdere dets bidrag til celle følsomhed over for hormonal og kemoterapi. Vi viser, at TOP2A driver PCa retning af en mere invasiv fænotype ved at inducere DNA omlejringer. Vi giver også bevis for mekanismen af ​​tidsmæssige følsomhed prostata tumorceller til TOP2A giftstoffer. Vi viser, at mere avancerede prostata tumorceller, modstandsdygtige over for androgen ablation, kan mere effektivt elimineret ved en kombinationsterapi med anti-androgen og doxorubicin. TOP2A interfererer med anti-androgen terapi stigende følsomhed over for AR signalering ved at lette sin transkriptionsaktivitet ved androgen responsive elementer.

Resultater

Generering af prostatakræft-cellelinier overekspression TOP2A

vi antager, at høje niveauer af TOP2A, ud over dem, der normalt findes i cykling celler, forårsage vedvarende generation af DNA DSB som efterfølgende føre til genomiske omlejringer forbundet med dannelse af en mere aggressiv fænotype (S1A fig). For at undersøge bidrag TOP2A til prostata carcinogenese og udforske fordelene ved terapeutisk målretning af dette protein for PCA patienter, vi satte os for at udvikle PCA cellelinjer stabilt overekspression TOP2A. Selvom TOP2A er stærkt udtrykt i cancer celler

in vivo

, forsøg på at ektopisk udtrykke dette protein

in vitro

har tabt sagen på grund af samtidig induktion af apoptose [39].

In vivo

, under cancer progression, celler har udviklet mekanismer til at omgå programmeret celledød forbundet med høj grad af TOP2A. F.eks CKS2 protein, forhøjede i PCa, i dyremodeller og PCA-cellelinier blev vist at beskytte celler mod apoptose [40]. Således, for at overvinde apoptose induceret af høje niveauer af TOP2A, vi først genereret PCa LNCaP stabile kloner, der overudtrykker CKS2 (S1B Fig), og kloner med reduceret niveau af caspase-3 (S1c Fig), en vigtig effektor caspase i apoptotiske vej [41] . Ekspression af caspase-3 blev anmeldt tabt eller nedsættes i PCa [42]. De katalytisk inaktive former af caspase-3, når det transficeres ind i cellerne, blev specifikt vist at inhibere celledød udløst af DNA-skade respons [43]. Forsøg på at omgå TOP2A-induceret apoptose ved overekspression CKS2 undladt at redde nogen TOP2A overekspression cellelinjer. Tre kloner med nedsat niveau af caspase-3 blev udvalgt på en integration af TOP2A cDNA og anvendt i efterfølgende eksperimenter. T14-klon viste det højeste niveau af TOP2A protein og blev brugt som TOP2A høj ekspressor, mens T25 og T33 havde et endogent niveau af TOP2A og blev brugt som negative kontroller (S1D Fig).

Højere niveauer af TOP2A øge invasionsevne af tumorceller

for at rekapitulere forandringer, der sker

in vivo

på PCa progression, vi løbende dyrkede kloner at undersøge, hvordan niveau af TOP2A påvirket cellulære funktioner. Kloner blev høstet på forskellige passager og analyseret. Som udtryk for TOP2A er kendt for at korrelere med proliferation [4] vi først undersøgt spredning satser. Ingen signifikant forskel i opformeringsrater fandtes mellem TOP2A højere expresser klon (T14) og nedre expresser kloner (T33 og T25) (Fig 1A). Opformeringsrater ikke ændre sig væsentligt med stigende passage af enten klon tyder på, at forhøjede niveauer af TOP2A ikke påvirker tumorvækst

per se

i kultur. Højere niveauer af TOP2A har dog påvirke motilitet og invasionsevne af LNCaP kloner. Forældrekontrol LNCaP celler, TOP2A høje og lave expressers af tidlige og sene passager blev sammenlignet i Boyden kammer assays. Både tidligt (p23) og sene (P46) passager i TOP2A overekspression T14 klon viste større bevægelse gennem membranen end deres matchede kontrol kloner eller forældrenes LNCaP-celler (Fig 1B). Tilsvarende celler med højt TOP2A demonstreret mere invasive egenskaber end deres modstykker med endogen niveau af proteinet. Morfologien af ​​cellerne migrerede gennem den belagte membran afveg mellem T14 og T33 kloner. De TOP2A overudtrykkende T14 celler spreder med uregelmæssige strittende former og længere processer ligner mesenkymale fænotype, mens de T33 celler optrådte fladere og rundere, med korte processer (Fig 1C).

A) spredning af kloner stabilt overeksprimerer TOP2A (T14) og matches kontrolceller med endogen niveau af TOP2A (T25 og T33). Proliferation blev bestemt ved 96 timer efter celleudpladning. B) motiliteten af ​​TOP2A kloner af forskellige passage og parentale LNCaP-celler bestemt under anvendelse Boyden kammer assay. C) Billeder af celler med invasiv fænotype efter 72 timers spredning. P betegner passage nummer, OD, er au målt optisk tæthed i vilkårlige enheder. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD, på grundlag af 3 uafhængige forsøg. * P 0,00001, og ** p 0,0001, n = 3.

følsomhed af celler overeksprimerer TOP2A til behandlinger ændringer efter længere tids spredning

Høj kvalitet prostata tumorer

in vivo

er kendt for at udvikle resistens over for androgen deprivation terapi med tiden [44]. Der findes ingen målrettet behandling for disse patienter. Vi har derfor undersøgt, hvorledes følsomhed genererede TOP2A overudtrykker kloner til anti-androgener, TOP2A giftstoffer og kombination af to lægemidler ændret sig med tiden. Ved tidlige passager høje TOP2A-ekspressor T14 celler var meget mere følsomme over for doxorubicin end deres modstykke T25-celler (Fig 2A). Forskellen forsvandt ved højere passager som celler blev opformeret i kultur, med T14-celler bliver mere resistente over for anti-TOP2A behandling (Fig 2B). Lignende tendens blev observeret for behandlinger med anti-androgen Casodex (fig 2A og 2B, bundpaneler). Der var en konsekvent signifikant forskel i følsomhed over for bicalutamid mellem T14 og T25 kloner af tidlige passager. Selv om små (ca. 10-15%) ved de valgte doser, blev denne forskel ikke observeret ved de højere passager, svarende til mønster af følsomhed vist for doxorubicin (Fig 2B, top panel). Forskellene i respons var ikke forbundet med ændringer i niveauet af TOP2A protein som disse celler efter formering i kultur tilbageholdes højere niveauer af TOP2A (fig 2C). Således viser disse data, at celler fra tidlige passager overudtrykker TOP2A er mere følsomme over behandlinger, både anti-TOP2A narkotika og anti-androgener. En nylig undersøgelse har identificeret at DLX4, ofte overudtrykkes i bryst- og ovariecancer, stimulerer reparation af DNA DSB-induceret af TOP2A giftstoffer og dermed mindske celle følsomhed over for behandlingen [25]. Vi har derfor, sammenlignet niveau af DLX4 i normale prostata epitelceller og tumorceller fra kræft i forskellige GS (S2 Fig). Microarray udtryk analyse [30] viste, at der er ingen induktion af DLX4 i PCa, hvilket indikerer, at DLX4 ikke vil være en medvirkende faktor til modstand mod TOP2A giftstoffer i PSA.

A) Overlevelse af TOP2A kloner af tidlig passage som respons på behandling med doxorubicin (øverste panel) og Casodex (nederste panel). B) Overlevelse af TOP2A kloner af sen passage i respons på behandling med doxorubicin (øverste panel) og Casodex (nederste panel). C) Western blot viser niveauer af TOP2A i genererede stabile kloner af tidlige og sene passager. Påvisning af protein TBP nukleare blev anvendt til at verificere lig belastning. D) Kvantificering af TOP2A ekspression baseret på Western blot i C. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD, på grundlag af 3 uafhængige forsøg. P-værdier er som angivet, N.S. er ikke signifikant.

Vi næste testet, om celledrab ville være mere effektivt, hvis en kombination af disse to lægemidler blev anvendt. I det første sæt, behandling med konstant dosis af doxorubicin og stigende koncentrationer af bicalutamid viste ingen fordel i at dræbe celler med højt TOP2A sammenlignet med endogen kontrol (Fig 3A og 3B, toppaneler). Faktisk viste tidlig passage T14-klon mere modstand mod denne regiment forhold til T25 (Fig 3A, top panel). I modsætning hertil behandling med konstant dosis på 50 uM af bicalutamid, hvis anvendelse alene resulterede i 90% celleoverlevelse (fig 2), viste mere effektiv aflivning af sene passage celler, der overudtrykker TOP2A forhold til den tidlige passage og lav udtrykkende kontrol T33-klon ( fig 3B, nederste panel). Kollektivt, disse resultater tyder på, at kombinationsbehandling målrettet AR og TOP2A i TOP2A stærkt udtrykkende celler kan være gavnligt for avancerede tumorer

A) Overlevelse af TOP2A kloner af tidlig passage som respons på kombinationsbehandling:. Top XLRF konstant dosis af doxorubicin og stigende koncentrationer af bicalutamid; bundpanelet-konstant dosis af bicalutamid og stigende koncentrationer af doxorubicin. B) Overlevelse af TOP2A kloner af sen passage som respons på kombinationsbehandling, narkotika og koncentrationer er som i et. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD, på grundlag af 3 uafhængige forsøg. P-værdier er som angivet, N.S. er ikke signifikant.

For at få indsigt i mulige samspil mellem TOP2A handlinger og androgen signalering netværk vi næste sammenlignet niveauer af AR i kloner overekspression TOP2A til dem i kloner med endogen niveau af TOP2A. Celler blev dyrket i medier med ikke-strippet serum indeholdende basisniveau af androgener uden yderligere tilskud. De samlede AR proteinniveauer blev sammenlignet mellem T14 og T25 kloner af tidlige og sene passager (Fig 4A). T14-celler fra begge passager udviste signifikant højere niveauer af AR end tilsvarende kontrol T25-celler (hævede 3 og 8 gange henholdsvis), hvilket antyder en involvering af TOP2A i induktion af AR-ekspression på transkriptionsniveauet. Niveauerne af TOP2A protein forblev højere i T14 celler ved hver passage taget i forsøg (Fig 2C, S3C og S3E Fig). For at sikre at TOP2A protein var funktionelle, blev assayet under anvendelse TOP2A specifik DNA-template udføres. Enzymatisk aktivitet målt i proteinekstrakt fremstillet af T14 celler var højere end for T25-celler (S3 Fig). Når justeret til mængden af ​​totalt protein, det var 6 gange større (S3B Fig), i overensstemmelse med højere niveauer af TOP2A i T14 sammenlignet med T25-celler. Total enzymatisk aktivitet forblev forhøjede i overensstemmelse med højere niveauer af TOP2A protein, i senere passager af T14 celler (S3D Fig), bekræfter, at TOP2A forblev funktionelle, og der var ingen mutationer i aktive sted indføres efter opformering af denne klon.

Western blot, der viser totalindholdet af AR i TOP2A kloner af forskellige passager (som angivet), toppanelet. Kvantificering af AR udtryk normaliseret til beta actin niveau, nederste panel. B) Western blot, der viser induktion af AR niveau (øverst) ved behandling af TOP2A clones.with 5 nM R1881. Tilsvarende kvantificering af TOP2A niveauer normaliseret til TBP lastning kontrol er vist (nederst); nt er ubehandlet, t behandles; cellepassager er som anført. C) Skematisk viser promoter område for

KLK3

(PSA) gen anvendt i CHIP assay. DtFw og DtRv skildrer holdninger frem og reverse primere henholdsvis distale promoter region; PxFw og PxRv stillingerne for frem og bak primere med proksimal promotor. D) CHIP analyse af TOP2A kloner stimuleret med 5 nM R1881 i 3 timer. Berigelse af AR og TOP2A på distale og proximale promotorregioner af KLK3 genet (øverste og midterste paneler) og deres fravær på kodende region af GAPDH-genet (nederste panel) er vist. M er DNA størrelse markering, HG-er humant genomisk DNA anvendt som en positiv kontrol for PCR-amplifikation, EL1 og EL2 er konsekutive elueringsfraktioner (puffere gives i Methods).

TOP2A modulerer AR signalering

Der blev observeret højere niveauer af AR i TOP2A overekspression celler (fig 4A). For at belyse den mekanisme, hvormed TOP2A kan bidrage til regulering af transskription, vi behandlede celler med syntetisk androgen R1881 og sammenlignet nukleare niveauer af AR. AR translokerer til cellekernen ved ligandbinding til at regulere transkription af responsive gener [45]. Vi observerede signifikant højere niveau af nuklear AR som respons på androgen stimulering i TOP2A overudtrykkende T14 celler af tidligt (s.24) passage sammenlignet med T25-celler (Fig 4B). Den nukleare AR i disse celler steg 5 gange efter behandlingen. Sen passage (s.55) celler, der overudtrykker TOP2A viste en lidt forhøjet niveau af AR, ikke så dramatisk som deres forstadier ved passage 24. Aktiveret AR genkender og binder til palindromiske androgen responselement (ARE) sekvenser ved den proximale gener til inducerer deres transkription [45,46]. Vore data antyder, at TOP2A virker med AR at aktivere transkription af responsive gener. Til formelt teste denne udførte vi kromatin immunofældning under anvendelse af en region svarende til den proximale og distale er i promotoren for prostata-specifikt antigen (PSA) (KLK3 genet, Fig 4C), en velkarakteriseret transkriptionel mål for AR [46]. Antistoffer, at TOP2A og AR, var i stand til at indfange DNA-fragmenter indeholdende ER på KLK3 promotor efter behandling med R1881 (fig 4D). Der var ingen forskel i binding af TOP2A eller AR til ARE’er mellem T14 og T25-kloner. Bindingen blev bestemt som ingen rekruttering af enten TOP2A eller AR til ubeslægtet sekvens blev observeret (kodende region af GAPDH-genet blev anvendt som kontrol. Dette resultat indikerer, som gør sit homolog TOP2B, er TOP2A rekrutteret til steroid regulatoriske elementer til at stimulere transkription og foreslår synergistiske handlinger med androgen signalering i prostata tumorceller.

TOP2A fremmer produktionen af ​​DNA rearrangementer i PCA celler

Store kromosomale rearrangementer er almindeligt observeret i PCa [47,48], og menes at spille en rolle i tumor initiering og progression. Vi viser her, at på en måde svarende til TOP2B, er TOP2A rekrutteres til ARE’er at stimulere transkription. Hvorvidt gentagelse af denne proces resulterer i progressiv akkumulering af DNA-omlejringer blev ikke undersøgt. for at teste dette mate par breakpoint sekventering blev udført [49,50] på forskellige passager af høj og lav udtrykke TOP2A kloner. Forældrekontrol LNCaP celler huser en række genomiske forandringer, der omfatter translokationer, og eksemplarnummer ændringer (S4A Fig). De valgte efter integration af vektorer, som bærer siRNA til caspase-3 og cDNA for TOP2A celler viste signifikant højere antal kromosomale forandringer (s4b Fig). Dette er ikke overraskende, da de manipulationer sandsynligvis førte til selektion af celler med nedsat evne til at undergå apoptose. T25 kloner, der udtrykker endogent niveau af TOP2A viste ikke ændring i antallet af genomiske omlejringer med proliferation (fig 5A og 6A). Det samlede antal ændringer i T25 celler af forskellige passager var den samme som i precursorceller huser reduceret niveau af caspase-3 (Fig 6A). I modsætning hertil T14 celler, der overudtrykker TOP2A demonstrerede gradvise ophobning af omlejringer med stigende passage (figurerne 5B og 6B). Den TOP2A gen selv blev også påvirket i T14 for sent passage (tabel 1). Men afbrydelsen af ​​en allel ikke resultere i betydelige fald i ekspressionen af ​​proteinet, hvilket antyder, at eksogen integreret kopi af genet hovedsageligt kørte udtryk.

A) Late passage af T25-klon udtrykker endogene niveau af TOP2A . B) Efter passage af klon T14 overudtrykker TOP2A. Grå prikker (tæller) viser hyppigheden af ​​distributionen af ​​læser i 30KB vinduer og breakpoints for alle kromosomer (tal er angivet). X-aksen spænder over længden af ​​kromosomet, Y-aksen viser antallet af læser for hvert vindue. Window tællinger er vist i overensstemmelse med den forudsigelse af CNV algoritme. Grå punkter er normale, røde punkter svarer til sletninger og blå punkter viser gevinster. Linjer forbinde bioinformatically identificerede breakpoints. Bredderne af streger korrelerer med antallet af tilknyttede mate-pair læser. Farve af de forbindende linjer angiver polariteten af ​​den tilsluttede kromosom. For inden for kromosomal begivenheder rød shows fremadrettet i begge stykker, grøn indikerer inversion for en partner og blå shows inversion for begge. For inter-kromosomale begivenheder, rød forbinder p-sidestykket fra den større kromosomet til Q-sidestykke af den mindre kromosomet i fremadgående retning, grøn forbinder q-sidestykket fra den større kromosomet til p-sidestykket af mindre kromosom i fremadgående retning, blå forbinder p-sidestykket fra den større kromosomet til p-sidestykke af den mindre kromosomet i modsat retning og magenta forbinder q-sidestykket fra den større kromosomet til Q-sidestykket af mindre kromosom i omvendt retning. Sort indikerer afbalancerede translokationer. Blå pilespidser peger på udvalgte DNA rearrangementer, som er anskaffet på proliferation (fraværende i tilsvarende celler af tidligere passage.

A) Samlet antal breakpoints til stede i T25 celler i forskellige passager. LNCaP /Casp er et derivat af LNCaP-cellelinje stabilt udtrykker siRNA at vælte caspase 3. B) DNA-ændringer opnås ved TOP2A overekspression T14 celler efter spredning. Tal repræsenterer ændringer observeret i tillæg til de tilstedeværende i kontrol T25-klon. C) Skematisk viser foreslåede rolle TOP2A i prostatakræft progression og modstandsdygtighed over for androgen ablation terapi.

Tilsammen udgør disse resultater viser, at genomiske forandringer som følge af høje niveauer af TOP2A fører til erhvervelse af mere aggressive fænotype og kan også bidrage til at udvikle resistens behandlinger enkeltstof.

diskussion

Selvom radikal prostatektomi hærder de fleste af GS 7-10 patienter, risikoen for systemisk progression og død efter operation fortsat højere end 15%. En undergruppe af disse patienter udvikler dissemineret sygdom [44], og nogle, efter indledende bedring med androgen deprivation terapi, fremskridt kastrationsresistent tilstand [51]. Trods fremskridt i behandlingen af ​​patienter med kastrationsresistent sygdom [52, 53], opnåelse af overlevelse på lang sigt er fortsat et problem. Forståelse af mekanismerne bag resistens over for ablation er kritisk. En af de foreslåede mekanismer er udvikling af øget følsomhed over for lave niveauer af androgener efter ablation grund AR forstærkning eller udvidelse af dens udtryk [54,55]. I overensstemmelse med dette, vores undersøgelse viste, at TOP2A ofte overudtrykt i PCA tilfælde med høj risiko for progression, driver udtryk for AR. Vore data antyder, at androgen ablation terapi kan være mindre effektiv under tilstedeværelse af høje TOP2A protein (figur 6C). Yderligere, behandling eksperimenter understøtter den opfattelse, at behandling med en kombination af anti-androgen og TOP2A gift tilvejebringer en stærkere fordel. Vi viser også, at målrette TOP2A med gift alene er effektiv, kun på tidligere stadier, før TOP2A-drevet DNA er sket ændringer (Fig 6C). Efter aftale med disse resultater en nylig undersøgelse bruger en anden model for PCa har identificeret TOP2A som en gentagelse-specifik tumor antigen [56]. Mus prostata tumorer når de udsættes for suboptimal immunterapi udviklet sig til en drastisk anderledes fænotype, viser høj ekspression af TOP2A og svar til anti-TOP2A behandling. På dette stadium af minimal residual sygdom, TOP2A-positive celler vises stamcelle-lignende fænotype og viste øget invasionsevne [56], en egenskab, er karakteristisk for TOP2A-overekspression celler i vores model. I en anden undersøgelse ved anvendelse af syngene murine model af spontan PCa metastase [57] forfattere viste, at høje niveauer af TOP2A korrelerede med høje niveauer af methyltransferase EZH2 og målretning af begge proteiner i kombination resulterede i effektiv celledød.

Udover niveauet og funktionaliteten af ​​TOP2A, blev cellulære respons på sine inhibitorer også rapporteret at afhænge af aktiviteten af ​​andre faktorer. DLX4, et homeobox gen, overudtrykt i flere kræftformer [58], har vist at nedsætte følsomheden af ​​tumorceller til TOP2A giftstoffer ved at stimulere reparation af DSB ved non-homolog ende sammenføjning [25]. Vores data viser, at dette ikke er tilfældet i PCa, som niveauet af DLX4 ikke stiger med tumorklassificering men forbliver den samme som i normale epitelceller (S2 Fig).

Kollektivt antyder disse undersøgelser, at der er et tidsvindue i løbet af PCa progression hvor anti-TOP2A terapi kan være særlig effektiv. Hvorvidt TOP2A giftstoffer /inhibitorer eller immunterapi skal være valg af behandling i klinikken er endnu ikke fastslået.

Endelig viser vi her, at TOP2A samarbejder med AR at fremkalde transskription af målgener (figur 6C). Niveauet af AR selv er signifikant højere i TOP2A overudtrykkende celler efter stimulering med androgen agonist. Svarende til sin isoform TOP2B, TOP2A er co-rekrutteret til ER med AR, og vil sandsynligvis aktivere transkription. Tidligere TOP2B blev også vist at inducere DNA DSB ved regulatoriske regioner af østrogen og AR målgener [35,36]. Selv i vores undersøgelse vi ikke løse denne mulighed direkte, vi observerer en stigning i en række DNA-rearrangementer i TOP2A overekspression celler efter spredning. Uanset om de er resultatet af mangelfuld reparation af DNA DSB’er, der forekommer på det transskriptionelle regulatoriske elementer eller en konsekvens af overskud af TOP2A funktion under replikation mangler at blive undersøgt nærmere. Vi identificerede et par omarrangerede gener, som vi anser som “TOP2A afhængig” (tabel 1). Baseret på de tidligere observationer i forbindelse med funktionen af ​​disse gener, kan ændringerne i egenskaber af TOP2A overudtrykker celler og deres følsomhed over for behandlinger tilskrives ændringerne i de DNA-regioner. F.eks Emi1 (FBOX5) (tabel 1) påvirkes i T14 celler af den seneste passage er en kendt regulator af mitotisk progression [59,60]. Det har været impliceret i at bestemme følsomhed over for doxorubicin [61]. I denne undersøgelse udtømning af Emi1 førte til stigning i følsomhed, i overensstemmelse med denne, vores data tyder på, at dobbeltarbejde observeret i T14 celler i senere passage kan tegne sig for et fald på følsomhed over for doxorubicin (Fig 2B). Afbrydelse af PARD3B genet, vist at styre tight junctions [62], kan være ansvarlig for stigning i motilitet og invasion kapacitet T14-celler. Reduktion i udtryk eller tab af Tango, en homolog af Tango6, forstyrret i TOP2A overekspression celler, blev også tidligere vist sig at øge migrationen [63]. Funktionen af ​​Tango6 er ikke blevet undersøgt endnu, om dens tab kan have lignende effekt på PCA cellers egenskaber kræver yderligere undersøgelser. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at uddybe præcis funktionel bidrag erhvervede genomiske forandringer.

Materialer og metoder

Cell kultur og behandlinger

Cellekulturer blev opretholdt efter ATCC anbefalinger. LNCaP (ATCC) og LNCaP stabile derivater blev dyrket i RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies) kultur suppleret med 100 enheder /ml penicillin, 1 mg /ml streptomycin og 10% FBS. For androgen behandling eksperimenter celler blev dyrket i det samme medium, men erstatte 10% FBS med 5% trækul-filtreret FBS (One Shot, Life Technologies) i 48 timer før tilsætning af 5nM R1881 (metribolone, RM10, TSZCHEM), og efter at blev inkuberet i yderligere 48 timer. Cellerne blev opsamlet ved skrabning og protein blev isoleret (kerneekstrakt kit, Active Motif) til Western blot analyse.