PLoS ONE: miRNA Expression i Colon Polypper Giver Beviser for en multihit Model of Colon Cancer

Abstrakt

Ændringer i miRNA udtryk er et fælles træk i tyktarmskræft. Disse forandringer i overgangen fra normal til adenom og fra adenom til karcinom har dog ikke været veldefineret. Derudover miRNA ændringer blandt tumor undergrupper af tyktarmskræft er også ikke blevet tilstrækkeligt undersøgt. I denne undersøgelse undersøgte vi den globale miRNA-ekspression i 315 prøver, der omfattede 52 normal colon mucosa, 41 tubulovillous adenomer, 158 adenocarcinomer med dygtige DNA mismatch repair (pMMR) udvalgt til fase og alder debut, og 64 adenocarcinomer med defekt DNA mismatch repair (dMMR) udvalgt for sporadisk (n = 53) og nedarvede coloncancer (n = 11). Sporadiske dMMR tumorer havde alle

MLH1

inaktivering grundet promotor hypermethylering. Unsupervised PCA og cluster analyse viste, at den normale colon væv, adenomer, pMMR carcinomer og dMMR karcinomer var alle tydeligt mærkbare. Størstedelen af ​​miRNA, der var differentielt udtrykte mellem normal og polyp blev også differentielt udtrykt med en tilsvarende størrelse ved sammenligningen af ​​normal til både pMMR og dMMR tumor grupper, hvilket tyder på en trinvis progression til transformation fra normal colon til carcinom. Blandt de miRNA demonstrerer den største fold op- eller ned-regulerede ændringer (≥4), fire roman (miR-31, miR-1, miR-9 og miR-99a) og to tidligere rapporteret (miR-137 og miR-135b ) miRNA blev identificeret i den normale /adenom sammenligning. Alle undtagen en af ​​disse (MIR-99a) viste lignende ekspressionssystemer forskelle i de to normal /carcinoma sammenligninger, hvilket antyder, at disse tidlige tumor ændringer er vigtige i både pMMR- og dMMR-afledte cancere. Sammenligningen mellem pMMR og dMMR tumorer identificeret fire miRNA (MIR-31, MIR-552, miR-592 og MIR-224) med statistisk signifikante udtryk forskelle (≥2 gange skift)

Henvisning:. Oberg AL , Fransk AJ, Sarver aL, Subramanian S, Morlan BW, Riska SM, et al. (2011) miRNA Expression i Colon Polypper Giver Beviser for en multihit Model for tyktarmskræft. PLoS ONE 6 (6): e20465. doi: 10,1371 /journal.pone.0020465

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: Marts 4, 2011; Accepteret: April 26, 2011; Udgivet: 9 juni 2011

Copyright: © 2011 Oberg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Minnesota partnerskab for Bioteknologi og Medicinsk Genomics [Medical Foundation 2006-100412]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft (CC) er en af ​​de førende årsager til kræftdødsfald i hele verden, med cirka 148.000 nye tilfælde rapporteret i USA i 2009 [1]. Progressionen til CC betragtes som en trinvis proces med ophobning af forskellige genetiske og epigenetiske ændringer, der fører til en transformation fra en normal celle til en præmalign tumor og endelig til en ondartet og potentielt metastatisk tumor (normal til adenom til carcinom-sekvensen). Aktuelle data viser tydeligt tilstedeværelsen af ​​heterogenitet i denne sekvens af begivenheder. Disse omfatter: (i) udvikling af forskellige typer af forstadier til kræft såsom villøs adenom, rørformet adenom, tubulovillous adenom, og savtakket polyp med formodede forskelle i molekylære defekter; (Ii) overgang til invasiv cancer demonstrerer meget forskellige molekylære anormaliteter (fx tumorer med og uden defekt DNA mismatch reparation); og endelig (iii) udvikling af sporadisk versus forskellige former for arvelig CC. De underliggende faktorer, der er ansvarlige for denne heterogenitet er dog stadig stort set ukendt.

Et af de tydeligste forskelle demonstreret så langt for sporadisk CC er baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af funktionel DNA mismatch repair (MMR) [2] [3], [4]. Tumorer med defekt MMR (dMMR) er blevet identificeret i ca. 20% af sporadisk CC og er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​en bestemt tumor fænotype, betegnet mikrosatellit instabilitet (MSI). Sporadisk CC, har tre distinkte MSI fænotyper blevet beskrevet: MSS, MSI-L og MSI-H [5]. MSI-H fænotype er forbundet med forskellige clinicopathologic funktioner [2], [3], [4], herunder et gunstigere resultat [6]. Blandt sporadisk CC, at størstedelen af ​​MSI-H sager resultater fra inaktivering af

MLH1

grund promotor hypermethylering (~ 95%) [2], [3], [4]. De resterende -80% af CC med dygtige MMR (pMMR), på den anden side, følge en kromosomal ustabilitet (CIN) pathway og er forbundet med en høj frekvens af aneuploidi og allele ubalance [7].

Selvom størstedelen af ​​CC synes at være sporadisk med en gennemsnitsalder ved diagnose i midten af ​​60 s, opstår ca. 15-20% af tilfældene inden familiære aggregater, med kendte genetiske forhold kun udgør en mindre del af disse. Mens arvelig CC har været anerkendt i nogen tid, har identiteten af ​​gener involveret i sygdomsprocessen først for nylig blevet identificeret for mange af de arvelige tilstande. Den mest udbredte arvelige form for CC er arvelig ikke-polypose tyktarmskræft (HNPCC), der tegner sig for ~2-3% af alle tilfælde [8].

For HNPCC, germline mutationer i DNA MMR gener er også ansvarlig for denne tilstand, med

MLH1

MSH2

tegner sig for størstedelen af ​​tilfældene (~ 40% hver) og

MSH6

PMS2

regnskab for en mindre procentdel, ~ 10% og 5%, henholdsvis [2], [8]. Tumorer fra disse patienter er også karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​MSI-H og ved tab af MMR-proteinekspression for det berørte gen. Således den molekylære ætiologi af tumorer, der involverer dMMR er meget heterogen, der involverer flere forskellige gener og talrige mekanismer gen inaktivering, herunder epigenetiske, somatiske og germline ændringer.

Der synes at være mindst to betydende veje fører til sporadisk og arvelig CC. Den første vej, der involverer dMMR, menes at have oprindelse i en savtakket forløber (den siddende takket adenom) og tegner sig for alle sporadisk MSI-H CC (selvom ikke alle kræftformer opstår via den takkede vej er MSI-H). HNPCC giver også anledning til MSI-H CC. Den anden vej menes at stamme fra tubulo /villøse adenomer og fører til sporadiske CC eller FAP-relateret CC præget af tumor CIN og pMMR. Vores forståelse af disse veje på molekylært niveau og deres inddragelse i overgangen fra normal til polyp til karcinom, selv om en forbedring, stadig ufuldstændig.

Genom-dækkende tilgange (udtryk profilering, genom-dækkende SNP analyse, aCGH, næste generation sekventering) fortsætter med at forfine vor forståelse af processen af ​​tumorigenese. Opdagelsen af ​​en voksende klasse af små ikke-kodende RNA’er, herunder miRNA, har afsløret en endnu større grad af kompleksitet for cancer biologi [9], [10], [11]. microRNA (miRNA) er 18-24 nt små ikke-kodende RNA-molekyler, der overvejende hæmmer genekspression ved post-transkriptionelle [9] niveau. Som miRNA regulere ekspressionen af ​​et stort antal af protein-kodende gener, er en lang række biologiske processer påvirket, såsom metabolisme, organogenese, udvikling og bestemmelse af cellens skæbne, herunder død [10]. Ændret ekspression af miRNA er også blevet associeret med en række sygdomme hos mennesker, herunder cancer [11]. Selv om et stigende antal undersøgelser har behandlet miRNA udtryk i CC [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], få har blevet offentliggjort på præmaligne læsioner i tyktarmen [21], [22], [23], [24], [25]. Især er den rolle, miRNA i overgangen mellem normal colon og polyp og mellem polyp og kræft ikke forstået.

I denne undersøgelse blev der globalt miRNA (735 miRNA mål) udtryk evalueret i 315 prøver (52 normal colon mucosa og 263 colontumorer) ved hjælp af BeadArray ™ platformen (Illumina, Inc.) [26]. Prøver udvalgt til analyse blev kategoriseret efter en række kliniske og molekylære kriterier for at udforske tumor heterogenitet nærmere, for at opdage biologisk relevante miRNA og behandle overgangsbestemmelser ændringer fra normal til adenom og adenom til carcinom. Tumor typer inkluderet tubulovillous adenomer, adenocarcinomer med dMMR udvalgt til både sporadiske og nedarvede sager, og adenokarcinomer med pMMR udvalgt til fase (A, B, C og D) og alder debut (gamle-versus unge debuterende sygdom).

Metoder

Etik Statement

The Mayo Clinic Board Institutional Review revideret og godkendt til humane studier protokollen titlen “identifikation og validering af miRNA Signature Profiler som biomarkører for Colon Cancer Progression” fra Dr. Stephen N. Thibodeau. Udvalget bemærkede, at de menneskelige undersøgelser aspekter indebærer brug af prøver indsamlet under IRB-godkendte protokoller. Udvalget besluttet, at samtykkende proces giver mulighed for fremtidig brug af prøverne som eksemplificeret i den nuværende protokol. Størstedelen af ​​patienterne forudsat skriftligt informeret samtykke. For dem, der ikke gjorde det, blev prøver anonymiseret.

Sample Selection

Prøver fra patienter med CC eller polypper blev udvalgt fra to separate tumor registre. Den første samling af prøver blev opnået fra alle patienter, der undergik kirurgisk resektion for CC i løbet af en treårig periode fra 1995 til 1998 (umarkerede). Den anden samling, indledt i 2000, er en løbende indsamling af biospecimens fra Mayo Clinic i Rochester patienter med kolorektal neoplasi. For senere registreringsdatabasen, har ingen kriterier før udvælgelseskriterier blevet brugt af registret, bortset fra at kun de polypper med en diameter på ≥ 7 mm opsamles til fremtidig brug.

Alle vævsprøver blev hurtigt nedfrosset i flydende kvælstof ved tidspunktet for indsamlingen og derefter opbevaret ved -80 ° C til senere brug. Normale områder af tyktarmsepitelet blev opnået fra enten margenen af ​​resektion eller ved siden af ​​tumoren. Alle undtagen en af ​​de normale vævsprøver anvendt til denne undersøgelse blev matchet med tumorer. Rektal kræftformer blev udelukket. Polypper blev evalueret til histologisk type, med kun tubulovillous adenomer udvalgt til undersøgelse. Patologisk tumor iscenesættelse blev klassificeret i henhold til Dukes ‘kriterier [27]. Patientgrupper chart bedømmelser blev udført for at opnå kliniske karakteristika tumoren, herunder tumorstedet, stadium og alder ved diagnose.

Tumor Behandling og RNA-ekstraktion

Frosset væv blev skåret på en kryostat til at generere hematoxylin og eosin (H 30% demonstrerede ustabilitet, og MSS hvis ingen af ​​markørerne demonstrerede ustabilitet

immunhistokemisk (IHC) analyse for protein ekspression blev udført på FFPE prøver til MLH1 og MSH2 (alle tilfælde) og MSH6 og PMS2 (undergruppe), som tidligere beskrevet [29]. DNA dMMR blev defineret ved tilstedeværelsen af ​​MSI (MSI-H) og /eller fravær af proteinekspression for MLH1, MSH2, MSH6 eller PMS2. DNA pMMR blev defineret ved fravær af høje niveauer af mikrosatellit ustabilitet (MSS /MSI-L) og ved tilstedeværelsen af ​​normale protein udtryk for MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2.

Tumorer med dMMR viser et fravær af MLH1 blev yderligere testet for at fastslå årsagen til gen-inaktivering, dvs. epigenetisk (sporadisk) versus kimcellelinje (arvet). Enten en methyleringsspecifik PCR-baseret assay eller et HpaII-enzym fordøje baseret assay blev anvendt til at teste for promotor hypermethylering [30]. Derudover blev en PCR-baseret assay for ændringer i V600E mutation i BRAF også udført. MLH1 tilfælde Demonstration

MLH1

promotor hypermethylering var klassificeret som sporadisk (dMMR1). MLH1 tilfælde med vildtype BRAF og uden

MLH1

promotor hypermethylering blev klassificeret som kimcellelinje (dMMR2). Sager om MSH2, MSH6 eller PMS2 (ved tab af protein-ekspression ved IHC eller kimcellelinje test) blev også klassificeret som kimcellelinje (dMMR2).

miRNA profilering

Global miRNA (735 miRNA mål) ekspression blev evalueret ved brug af BeadArray ™ platformen (Illumina, Inc.) i det væsentlige som beskrevet af Sarver et al. [16]. For hver undersøgt prøve, blev 200 ng af total RNA anvendes til analysen.

Statistisk analyse

Study Design.

Separate randomisering ordninger blev skabt for at bestemme rækkefølgen af ​​væv cryosectioning, RNA ekstraktion og fordelingen af ​​prøver til de 96-brønds Sentrix Array (SAM) plader at sikre, at prøven grupper af renter og demografiske karakteristika var velafbalancerede over flere potentielle eksperimentelle effekter.

Kvalitet vurderinger.

i alt 336 vævsprøver (281 tumorer og 55 normale vævsprøver) fra 282 forsøgspersoner blev oprindeligt testet med Illumina platformen. For 54 af patienterne, blev både normale og tumorvæv opnået fra det samme individ (tabel 1). For kvalitetskontrol formål, blev 8 prøver testet en ekstra gang og 5 prøver blev testet yderligere tre gange (Test for reproducerbarhed), hvilket resulterer i alt 23, der udtages testet (i alt testet = 359). Femogtyve yderligere negative og opskæring kontroller blev også brugt til at vurdere den samlede kvalitet.

Ud over de laboratorie kvalitetskontrol vurderingerne blev global kvalitet og partiskhed vurderet via flere plotte teknikker. Alle analyser blev udført på loggen

2 skala og resultaterne præsenteres på skalaen fold-ændringen. Box-og-knurhår parceller blev brugt til at vurdere globale gennemsnitlige skift i miRNA distribution eller koncentration mellem prøver og SAM. Parvise minus versus gennemsnit (MVA) grunde til to prøver, defineret som forskellen pr-sonde mellem de to prøver (lodret akse) versus per-probe gennemsnit (vandret akse) for de to prøver [31], blev anvendt til at vurdere aftale mellem tekniske gentagelser. Tilbageværende MVA grunde til en given prøve, defineret som forskellen mellem denne prøve og gennemsnittet af alle prøver (lodret akse) versus gennemsnittet af alle prøver (vandret akse) [32], blev anvendt til at vurdere, om der og funktionel form af , f.eks (ikke) linearitet forspænder som en funktion af overflod. Plots af principal komponent analyse (PCA) resultater blev anvendt til at undersøge (DIS) lighed af eksemplarer til negative kontrolprøver og eksistensen af ​​SAM effekter. Box plots og dot plots blev brugt til at vurdere arten og sammenhæng i pr-sonde SAM effekter. Detection satser blev vurderet for hver prøve, med sonde afsløring defineret som p-værdier. 0,01

Baseret på disse kvalitetsvurdering analyser, i alt 21 af de 359 prøver (herunder nogle gentagelser) blev fjernet fra yderligere studere. Tolv viste sig at være mere ens i udtryk distribution til negativ kontrol prøver baseret på kassediagrammer, opdaget og PCA plots og en prøve havde et ekstremt højt, men smal vifte af udtryk. Yderligere syv eksemplarer havde naturligvis forskellige gulv og loft effekter i resterende MVA plots og grupperet tættere på de negative kontrolprøver i PCA. En ekstra prøve blev elimineret, da det var den eneste i sin klasse. Der var således 338 prøver (318 unikke og 20 gentagelser) fra 268 individer tilbage til analyse.

Forbehandling.

Den overflod fordelingen af ​​735 miRNA og 20 kontrol sonder spændte over et bredt område, med 40% opdaget -60% af sonder i prøver passerer kvalitetsvurdering (ved hjælp af en 0,01 afsløring p-værdi tærskel). Desuden var der ingen

a priori

grund til at forvente en asymmetrisk fordeling af ændringer [16]. Således blev 338 prøver passerer en indledende kvalitet normaliseret hinanden via fraktil normalisering [31]. Post-normalisering resterende MVA plots viste, at gennemsnitlig lineær skævhed blev fjernet. plot af PCA resultater viste dog, at en SAM effekt tilbage. Kontrast skøn og dot plots viste, at, mens der var næsten ingen SAM effekt for størstedelen af ​​sonder, viste en håndfuld ændringer op til 2 gange mellem SAM, der var konsistent på tværs af alle prøver på hver SAM og blev ikke drevet af vildskudspunkter. Det vil sige, konsistente SAM-by-probe interaktioner blev observeret. Således blev restprodukter fra lineære modeller med SAM i modellen passer på en per-sonde basis for at fraktil normaliserede data anvendt som de endelige normaliserede, SAM-justerede data. Disse lineære modeller gav resultater inden decimal støv empiriske Bayes metoder, da prøvens størrelse er stor [33].

Resterende MVA plots, box plots og pr-sonde dot plots viste ingen tendens over tid for én prøve betjener som en skæring kontrol med væv skære syv gange i løbet af de to måneder, det kræves for at behandle alle de vævsprøver. Tilbageværende og parvise MVA parceller viste generelt god overensstemmelse mellem de tekniske replikater placeret på forskellige SAM. Den største SAM observerede virkning var 2,33 gange (log

2 skala forskel på 1,22), og kun en håndfuld prober havde SAM effekter af 2-fold. 91,5% (691/755) af sonder havde SAM effekt skøn. 1,2 gange

Per-sonde afsløring satser sammen med afbildninger af pr-sonde standardafvigelse (SD) i løbet af alle normaliserede prøver (n = 338 ) versus gennemsnitlig udtryk i alle normaliserede prøver viste klare gulv og loft effekter i overflod distribution. A per-probe tærskel SD af ≤0.4 i disse prøver på loggen

2 skala blev anvendt til at bortfiltrere “ikke-informative” prober på en måde agnostiker til gruppe [34]. Dette resulterede i 123 sonder med 0% afsløring satser, 37 mættede prober og 376 mid-overflod sonder med lav SD bliver filtreret ud, forlader 199 informative sonder med en SD . 0,4

Differential udtryk

Per-sonde lineære mixed effects modeller med kontrast udtalelser blev anvendt til at vurdere forskellen udtryk ved hjælp af de fraktil normaliserede, SAM-justerede data. Emne blev inkluderet som en tilfældig effekt for at redegøre for sammenhængen mellem flere observationer pr emne (tekniske gentagelser og den parrede karakter af alle, men en normal prøve). En SAM effekt blev inkluderet i modellen for at redegøre for de frihedsgrader, der anvendes i pr-sonde fjernelse af SAM effekt. Fordelingen af ​​p-værdier og falske opdagelse satser [35], [36] (beregnet på grundlag af modelresultater for alle 735 miRNA sonder) blev anvendt til at give en generel fornemmelse af, om der er sande forskelle. Faktisk signifikans blev vurderet ved hjælp af mere konservative Bonferroni korrigeret p-værdier baseret på 0,05 /735 = 6,8 × 10

-5 for hver sammenligning sammen med fold-change cutoffs at indarbejde biologisk betydning. Seks hovedgrupper blev sammenlignet: normal, polyp, pMMR1 (gamle debut), pMMR2 (ung debut), dMMR1 (sporadisk) og dMMR2 (germline). Ekstra sammenligninger inkluderet pMMR1 Stages B, C og D (Stage A med n = 3 blev udeladt af denne sammenligning på grund af den lille stikprøvestørrelse), samt pMMR1 MSS og MSI-L-grupper.

Justering variabler blev inkluderet i givet fald for at undgå mulig confounding med histologi. Tumor fase blev inkluderet som kovariat i modeller til vurdering forskelle mellem tumortyper at justere for eventuelle ubalancer af sygdommens sværhedsgrad på grund af scenen. Placering i tyktarmen blev ikke medtaget som kovariat i modeller, der sammenligner pMMR og dMMR tumorer, da dette blev anset for at være en del af biologien af ​​tumorerne. Ingen kovariater blev inkluderet i modellerne, der sammenligner de polypper eller normale grupper med andre grupper, da hverken scene eller placering i tyktarmen er relevante for disse grupper.

Visualisering af data.

Visualisering for tilstedeværelsen af globale effekter blev opnået gennem uovervåget klyngedannelse og PCA udnytte unikke vævsprøver kun (318 af 338 prøver); de tekniske replikater blev ekskluderet fra disse analyser. For prøver med flere tekniske gentagelser, de replikat eksemplar mærket “1” blev valgt. PCA-analyser blev udført på pr-sonde betyde-centrerede og SD-skalerede data ved hjælp af Partek [37] og R-funktionen prcomp [38]. Ukontrollerede klyngedannelse analyser blev udført på pr-sonde median-centrerede data i Partek hjælp Pearsons forskellighed matrix for beregning af afstande mellem de enkelte prøver og den gennemsnitlige sammenkædning metode til beregning af afstande mellem to klynger. Points eller specimen etiketter blev farvet på parceller med kendte kliniske gruppering oplysninger.

Resultater

Sample egenskaber

Efter omfattende kvalitetsvurdering af miRNA profilering resultater (se Metoder), 338 vævsprøver fra 268 patienter blev anvendt til yderligere analyse. Normale og tumor vævsprøver (ikke medregnet nogen af ​​de tekniske replikater) omfattede 52 normal colon mucosa, 41 tubulovillous adenomer, 158 adenocarcinomer med pMMR udvalgt til fase (3 Stage A, 72 trin B, 43 Stage C og 30 Trin D) og alder af debut (148≥50 år versus 10 50 år), og 64 adenocarcinomer med dMMR udvalgt til både sporadisk (53 dMMR1) og arvede CC (11 dMMR2) som skitseret i tabel 1.

Alle sager med sporadisk dMMR (dMMR1) havde

MLH1

inaktivering grundet promotor hypermethylering. Den arvede dMMR gruppe (dMMR2) var sammensat af sager, der har: (i) en kendt kimlinie mutation i enten

MLH1

(n = 1) eller

MSH2

(n = 3); eller (ii) tab af protein-ekspression for MSH2 (n = 3), MSH6 (n = 2) eller PMS2 (n = 2) ved IHC og antages at have en kimlinie mutation i disse gener. Flere sager med dMMR var ikke let kategoriseret (dMMR3) og på grund af det lille antal, blev disse slået ud yderligere analyse. Af de 268 forsøgspersoner, 119 var kvinder og 149 mænd.

Global miRNA udtryk forskelle mellem normal tyktarm, adenom og carcinom

PCA og hierarkisk klynge analyser, både uovervåget, blev brugt til at visualisere miRNA ekspressionsmønstre stede på globalt plan i vores udtryk datasæt. Samlet set var der en klar adskillelse mellem grupper bestående af normale, adenom, pMMR1 og dMMR1 afledte væv, når undersøgt af både uden opsyn PCA (figur 1A) og hierarkisk klyngedannelse (figur 1B) ved hjælp af sættet af 199 “informative” sonder opnået som beskrevet i Metoder. Af interesse er imidlertid hierarkisk clustering foreslår også tilstedeværelsen af ​​to subpopulationer for dMMR1 gruppe af tumorer, som synes at være drevet af en klynge af miRNA (flertallet fra kromosom 14), der viser lav ekspression i en gruppe og høj ekspression i den anden (angivet med pilen i figur 1B).

(A) Plots af hovedkomponenterne fra PCA analyser. Vandret akse svarer til hovedstolen komponent 1 (PC1), lodrette akse svarer til PC2, dybde akse svarer til PC3. Procenten af ​​variation forklares ved en bestemt pc er angivet i aksen etiketten. Point farvet af gruppe status med blå repræsenterer normal epitel, lilla repræsenterer polyp, grøn repræsenterer pMMR1, og rød repræsenterer dMMR1. To forskellige orienteringer leveres. (B) i vognen hierarkisk klyngedannelse miRNA profiler med sættet af 199 “informative” prober opnået som beskrevet i Fremgangsmåder. Prøver angivet langs den vandrette akse og omfatter normal colon, adenomer, pMMR1 carcinomer og dMMR1 carcinomer med gruppemedlemskab fremgår af farven bar mellem dendogram og varmen kort. miRNA er angivet ved den lodrette akse. Farven bar nedenfor viser niveauet for ekspression.

De globale miRNA ekspressionsmønstre blev derefter visuelt undersøgt i forskellige foruddefinerede tumor undergrupper til at bestemme, om disse kunne skelnes. PCA grunde til disse analyser er vist i figur 2 (data ikke vist for den hierarkiske klyngeanalyser). Inden for pMMR1 gruppen af ​​tumorer, var der ingen synlige mærkbare forskelle baseret på scenen, enten på tværs af alle tre faser eller mellem to faser (Fase A ikke medtaget på grund af små tal), eller på grund af køn. Derudover ingen adskillelse af grupper var synlig mellem tumorer med en ældre alder for debut (≥50 y /o, pMMR1) og dem med en yngre alder for debut ( 50 y /o, pMMR2). En analyse af tumorer inden for hver af de to dMMR undertyper, dMMR1 (somatisk) versus dMMR2 (germline), også viste ingen mærkbare forskelle.

Vandret akse svarer til principal komponent 1 (PC1), lodrette akse svarer til PC2 og dybde akse svarer til PC3. Point farvet af gruppe status. Procenten af ​​variation forklares ved en bestemt pc er angivet i aksen etiketten. (A) pMMR1 evalueret af Dukes stadie; (B) evaluering af alder debut (pMMR1 – gamle og pMMR2 – unge). (C) evaluering af 2 grupperinger af dMMR sager (dMMR1 – epigenetisk tavshed MLH1 og dMMR2 – kimcellelinje); (D) de pMMR1 grupperne MSI-L og MSS tumorer. Farver til hver af grupperne, der sammenlignes, er vist i øverste højre legende kassen.

Fordi tumorer ofte er klassificeret efter deres MSI status (MSS, MSI-L og MSI-H), disse tre grupper blev yderligere undersøgt for ekspression forskellene sammen, derefter systematisk i par. Som forventet, MSI-H-gruppe (defineret som dMMR) grupperet separat fra både MSI-L og MSS-grupper (begge defineret som pMMR). Men MSI-L og MSS grupper viste ingen mærkbare forskelle (figur 2).

Differential udtryk mellem normal tyktarm, adenom og carcinom

Vi har udført gruppebaserede statistiske sammenligninger på en probe- ved-sonde basis ved hjælp af lineære modeller i flere foruddefinerede analyser i et forsøg på at identificere statistisk signifikante differentielt udtrykte miRNA. Samlet set meget blev observeret signifikante forskelle mellem flere af grupperne for specifikke miRNA ved hjælp af en Bonferroni korrigeret p-værdi tærskel for signifikans (6,8 × 10

-5). Tabel 2 giver en optælling af de miRNA demonstrerer betydelig udtryk fold ændringer på varierende cutoffs (≥2.0 og ≥4.0). Tabel 3 viser de ni statistisk signifikante differentielt udtrykte miRNA med den største fold ændring (fold ændring af ≥4), mens figur S1 viser dot grunde til hver af disse mellem de forskellige væv undergrupper.

ændringen i ekspressionsniveau, der forekommer i normalt at adenom til carcinom sekvens for hver af de ni miRNA kan tydeligt ses i figur S1. Fem af de ni viser konsistente ændringer på tværs af alle grupper i forhold til normal, med miR-135b og miR-31 opreguleret og miR-1, miR-137 og miR-9 nedreguleret i alle prøver. HS_29 er opreguleret i alle karcinomer, men ikke i de polypper, miR-552 og miR592 er opreguleret i de polypper og pMMR tumorer men ikke dMMR tumorer, og endelig miR99a nedreguleres i polypper med mellemliggende niveauer i både pMMR og dMMR tumor grupper.

Brug Bonferroni P-værdi tærsklen på sammen med en fold ændring i ekspressionsniveauet af ≥2, i alt 54 miRNA blev identificeret blandt de forskellige sammenligninger (tabel 2, tabel S1). Tredive én miRNA blev differentielt udtrykt mellem normalt colon væv og adenomer. En sammenligning af den normale colon væv til de to vigtigste carcinom grupper (pMMR1 og dMMR1) identificeret 31 og 28 betydelige miRNA henholdsvis udnytter disse kriterier. Endelig blev 6 og 11 betydelige miRNA identificeres, når adenomer blev sammenlignet med to carcinoma grupper. Varmen kort, vist i figur 3, viser den relative ekspression forskelle i disse miRNA blandt grupperne blive undersøgt.

Prøver angivet langs den vandrette akse og omfatter normal colon, adenomer, pMMR carcinomer (1 og 2 kombineret ) og dMMR carcinomer (1 og 2 kombineret) med gruppemedlemskab angivet med farve bar mellem dendogram og zonekort. miRNA er angivet ved den lodrette akse. Farven bar nedenfor viser niveauet for ekspression.

Af interesse, de fleste (23 31) af miRNA, der var differentielt udtrykt mellem normal og adenom med fold ændringer i ≥2 blev også differentielt udtrykte i sammenligning af normal til både pMMR og dMMR væv grupper, for eksempel miR-135b og miR-31 (tabel S1). Derudover niveauer og retning af de ændringer i forhold til det normale for de fleste af disse var konsistent mellem adenom og carcinom. Ud over de nævnte for adenom og carcinom grupper ligheder imidlertid blev også identificeret forskelle i ekspression. Af de 43 miRNA, der var signifikant differentielt udtrykte med fold ændringer ≥2 i de to tumor grupper, havde 20 ikke opfylder disse kriterier i den polyp gruppen (f.eks miR-375, mir-147, etc.), selv om flere andre miRNA havde betydelig men mindre niveauer af ekspression forskel i polyp gruppen (f.eks miR-188-5p, miR-210) (tabel S1). Når tumor blev sammenlignet direkte til polyp gruppen, blev identificeret 20 miRNA; 9 opreguleret (f.eks miR-483-3p, miR34b) og 11 nedreguleret (f.eks miR-552, miR-592).

Selvom PCA og klyngeanalyse var i stand til at adskille pMMR1 og dMMR1 undergrupper (figur 1), der var overraskende få miRNA, der var signifikant forskelligt udtrykte mellem disse to grupper (tabel 2 og tabel S1). Kun fire miRNA (MIR-31, mir-224, MIR-552, mir-592,) blev fundet ved en 2-gange ændring eller højere. Som bemærket for adenom sammenligninger, at størstedelen af ​​miRNA som blev differentielt udtrykt mellem den normale colon væv og pMMR1 gruppe med fold ændringer ≥2 blev også udtrykkes forskelligt i sammenligning af den normale colon væv til dMMR1 væv gruppen. Igen, niveauet og retningen af ​​disse ændringer i forhold til normale for de fleste af disse miRNA var konsistent mellem disse to sammenligninger (tabel S1).

En række yderligere forud planlagte sammenligninger viste minimale forskelle mellem specifikke undergrupper.