PLoS ONE: Undersøgelse af Malformin C, en Fungal Source Cykliske pentapeptid, som Anti-Cancer Drug

Abstrakt

Malformin C, en svampeinfektion cyklisk pentapeptid, er blevet hævdet at have anti-cancer potentiale, men ingen

in vivo

undersøgelse var til rådighed til at underbygge denne ejendom. Derfor gennemførte vi

in vitro

og

in vivo

eksperimenter for at undersøge sine anti-cancer effekter og toksicitet. Vores undersøgelser viste Malformin C hæmmede Colon 38 og HCT 116 cellevækst dosisafhængigt med et IC

50 på 0,27 ± 0,07 uM og 0,18 ± 0.023μM hhv. Denne hæmning blev ekspliciteret af Malformin C effekt på G2 /M anholdelse. Desuden har vi observeret opreguleret ekspression af phospho-histon H2A.X, p53, kløvet caspase 3 og LC3 efter Malformin C-behandling, mens apoptose assay viste en forøget population af nekrotiske og sene apoptotiske celler.

In vivo

, den patologiske undersøgelse viste den akutte toksicitet af Malformin C ved dødelig dosis i BDF1 mus kan skyldes en akut endnu subtile inflammatorisk respons, i overensstemmelse med forhøjet IL-6 i plasma cytokin assay. Yderligere anti-tumor og toksicitet eksperimenter viste, at 0,3 mg /kg injiceret ugentligt var den bedste terapeutiske dosis af Malformin C i Colon 38 xenotransplanteret BDF1 mus, mens 0,1 mg /kg hver anden dag viste ingen effekt med højere modstand, og 0,9 mg /kg ugen enten ført til dødelige toksicitet i syv uger gamle mus eller vises ingen fordel i forhold til 0,3 mg /kg gruppe i ni uger gamle mus. Konkluderer vi Samlet at Malformin C anholdelser Colon 38 celler i G2 /M-fasen og inducerer flere former for celledød via nekrose, apoptose og autofagi. Malformin C har potent cellevækstinhiberingen aktivitet, men det terapeutiske indeks er for lavt til at være et anticancerlægemiddel

Henvisning:. Wang J, Jiang Z, Lam W, Gullen EA, Yu Z, Wei Y, et al. (2015) Undersøgelse af Malformin C, en Fungal Source Cykliske pentapeptid, som Anti-Cancer Drug. PLoS ONE 10 (11): e0140069. doi: 10,1371 /journal.pone.0140069

Redaktør: En R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, UNITED STATES

Modtaget: Maj 2, 2015; Accepteret: September 20, 2015; Udgivet: 5. november 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Yung-Chi Cheng er en Fellow af National Foundation for Cancer Research, USA. En del af hans løn er fra NCI tilskud fra CA-154.295. Det meste af forskningsstøtte er finansieret af en fond til Yung-Chi Cheng laboratorium ved Yale University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Malformins er en gruppe af cykliske pentapeptider oprindelig opdaget og isoleret fra kultur filtrat af svampen

Aspergillus niger

, og det fremkalder de misdannelser af bønne planter og krumninger af majs rødder [1, 2] . Malformin kunne også fås fra ekstrakt af

Aspergillus tubingensis

[3]. På nuværende tidspunkt er tre undergrupper af Malformins identificeret, nemlig Malformin A, Malformin B [4], og Malformin C. Som det første opdaget undergruppe, Malformin En hovedsageligt består af Malformin A

1, A

2, A

3 og A

4 [5, 6], hvor Malformin A

1 er mest godt undersøgt, og dets biologiske aktiviteter er blevet rapporteret, herunder misdannelser af planter, antibiotiske virkninger mod visse bakterier arter [7], forbedring af fibrinolytiske aktivitet [8, 9], og forebyggelse mod IL1-induceret prokoagulant reaktion [10]. Malformin C er en relativt ny og toksisk medlem af Malformins [11] (Fig 1A). Den har vist antibakteriel aktivitet [12], samt potent mod malaria og antitrypanosomal egenskaber [13]. Også Malformin C hæmmer bleomycininducerede G2 checkpoint i jurkatceller [14], og hævdedes at have potentiale i kræftbehandling. Der er imidlertid ikke

in vivo

undersøgelse blevet præsenteret for underbygge sin anti-tumor ejendom. Derfor har vi gennemført en række indledende

in vitro

og

in vivo

undersøgelser for at udforske Malformin C anti-cancer effekter og dens

in vivo

toksicitet.

(a) Kemisk struktur af Malformin C. Malformin C er medlem af Malformins, en gruppe af fungale cykliske pentapeptider. Dens kemiske formel er C

23H

39O

5 N

5S

2 med en molekylvægt på 529,7. (B) cellecyklusprogression af Colon 38 celler udsat for en stigende koncentration af Malformin C i 24 timer. (C) cellecyklusprogression af Colon 38 celler udsat for en stigende koncentration af Malformin C i 48 timer. (D) Den dosisafhængige akkumulering af G2-M-fasen Colon 38-celler behandlet med Malformin C ved koncentrationer på 90 nM, 270 nM og 810 nM. Sammenlignet med kontrolgruppen, symbolet Δ repræsenterede

P

0,05, mens * repræsenteret

P

0,01. (E) Cell cyklus analyse af Colon 38 celler behandlet med kombinationer af Malformin C og SN38. Alle celler blev udsat for respektive forbindelser er angivet over grafen i 24 timer, og analysen blev udført in duplo. Ved behandling med SN38, blev ingen signifikante ændringer i cellecyklusprogression observeret uden eller med forskellig dosering af Malformin C.

Selvom forekomsten og dødeligheden af ​​kolon og rektal kræft er faldet i de sidste tyve år, colorectal cancer (CRC) er fortsat den fjerde hyppigst diagnosticerede cancer og den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald i USA [15]. Kemoterapi er almindeligt anvendt til CRC på forskellige stadier. Irinotecan (CPT-11, Camptosar) er et kemoterapeutisk lægemiddel, der forhindrer DNA fra unwinding ved inhibering af topoisomerase I-funktion, og anvendes til behandling af fremskreden eller metastatisk CRC. I denne undersøgelse anvendte vi murine Colon 38-celler, HCT116 celler og allotransplantat tumor som model til at undersøge potentialet i Malformin C anti-cancer ejendom og valgte CPT-11 som en kontrol for at undersøge dens mulige kombination og underliggende mekanisme.

Materialer og Metoder

Fungal Materiale

kulturen i

Aspergillus tubingensis

blev isoleret fra sandet jord i Patong strand i Phuket, thailandske ø (7,89 ° N , 98,29 ° E). Sandet jord blev indsamlet fra en offentlig strand, og ingen specifik tilladelse var nødvendig for det pågældende sted eller sådan aktivitet. Vi bekræfter, at vores feltstudier ikke indebar truede eller beskyttede arter. Den isolat blev identificeret ved en af ​​forfatterne (Prof. Yixuan Zhang) baseret på sekvensanalyse af ITS-region af rDNA og dets morfologi. Stammen blev tildelt tiltrædelse No. 6992 kultur samling på Kina General Mikrobiologisk Culture Collection Center, Beijing. Den fungale stamme blev dyrket på skråkulturer af kartoffeldextroseagar (PDA) ved 28 ° C i 4 dage. Derefter skråsubstrater sporer blev inokuleret i 250 ml Erlenmeyer-kolber, hver indeholdende 40 ml af medium (1% glucose, 1% saccharose, 1% pepton, 0,5% jordnøddemel, 0,3% KH

2PO

4, 0,1% NH

4CL, 0,3% MgSO

4 · 7H

2O) og den endelige pH af mediet blev indstillet til 6,5 før sterilisation. Kolbekulturer blev inkuberet ved 28 ° C på en rotationsryster ved 160 rpm i 48 timer for at opnå frø væske til fermentering. Fermentering blev udført i Fernbach dyrkningskolber (500 ml) hver indeholdende 80 ml medium (1% glucose, 0,2% asparaginsyre, 0,1% KH

2PO

4, 0,05% magnesiumsulfat

4 · 7H

2O og sporstoffer) og den endelige pH 6,0 før sterilisering. De sporstoffer pr 1L gæring medier indeholdt 0,1 mg MnSO

4, 0,1 mg ZnSO

4, 0,2 mg FeCl

3, 1mg B Vitamin

1, 5 ug biotin. 8% (volumenforhold) frø væske blev plantet i hver gæring flaske, dernæst dyrket ved 28 ° C på en rotationsryster ved 160 rpm i 96 timer.

Ekstraktion, isolering og identifikation af Malformin C

20L gæring materiale blev vakuumfiltreret til fjernelse af mycelium, derefter ekstraheret med N-butylalkohol, og det organiske opløsningsmiddel blev inddampet til tørhed under vakuum til opnåelse af en rå ekstrakt. 5g rå ekstrakt blev opløst i CH

3OH efterfulgt af silicagelsøjlekromatografi (CC) (10 × 100cm) anvendelse af CHC

3-CH

3OH gradienteluering (15: 1 → 10: 1 → 5: 1). Fraktionen (0,8 g) elueret med 15: 1 CHC

3-CH

3OH blev separeret ved søjlekromatografi, og yderligere oprensning ved RP-HPLC (Shimadzu LC-10A; Diamonsil C18 200 × 4,6 mm 5 um; 1 ml /min, 80% CH

3OH i H

2O til eluering, afsløring UV bølgelængde på 215 nm, malformin C t

R 13.065min) til 99% renhed. Den rene forbindelse blev identificeret på grundlag af omfattende spektroskopiske undersøgelse, herunder HR-ESI-MS, 1D-NMR og 2D-NMR. HR-ESI-MS-spektre blev opnået på et Bruker mikro-Q-TOF massespektrometer. 1D og 2D-NMR-spektre blev målt på et Bruker ARX-300 spektrometer (300 MHz for

1H, 75 MHz for

13C). Den rene forbindelse blev identificeret som malformin C via sammenligning af data med dem, der tidligere rapporteret [16].

Drugs og cellelinier

CPT, doxorubicin, vincristin, taxol, VP-16, oxaliplatin og DAPI blev indkøbt fra Sigma. L-OddC blev leveret af Shire Pharmaceuticals blev Inc. Muse Colon 38 cellelinje etableret før [17], og fås fra Dr. Giuseppe pizzorno af Translational Science i Nevada Cancer Institute, USA. Menneskelig lungeadenokarcinom NCI-H1975-cellelinje blev købt fra National Cancer Institute og givet af Dr. Don Nguyen af ​​afdelingen for patologi ved Yale University. Human lymfoid CEM, human nasopharyngeal carcinom KB og HCT 116 colon cancer cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). Murine bugspytkirtelkræft PanO2 og KB-resistente cellelinier blev tidligere etableret i laboratoriet og beskrevet før [18-22]. Colon 38, NCI-H1975, CEM og KB-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium, PanO2 celler blev dyrket i DMEM-medium, og HCT 116 celler i McCoys 5a medium. KB-resistente cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 med 37nmol /L Doxorubicin for KB-MDR, 300 nM CPT for KB300-CPT, 20 nM vincristin for KBv20c, 20 uM VP16 for KB20a-VP16 og 7 um VP16 for KB7d, og alle disse lægemidler blev trukket tilbage fra medierne, når celler blev podet til forsøgene. Alle celler blev dyrket i medier suppleret med 10% FBS, og holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

Cell Growth Assay

Celler blev podet ved 1 × 10

4 /ml i 48-brønds plader. Efter inkubation natten over, Colon 38, HCT 116, PanO2, NCI-H1975, CEM, KB, KB-MDR, KB300-CPT, KBv20c, KB20aVP16, og KB7d celler blev behandlet med lægemidler i 72 timer, 72 timer, 72 timer, 120 timer, 72 timer, 120 timer, 72 timer, 108 timer, 72 timer, 108 timer, og 108 timer. Celler blev fikseret og farvet med 0,5% methylenblåt i 50% ethanol i 2 timer ved stuetemperatur (RT), efterfulgt af vask med ledningsvand til fjernelse af uabsorberet methylenblåt. Plader blev lufttørret natten, solubiliseret i 1% Sarkosyl og roteret i 3 timer ved stuetemperatur. Cellevækst blev kvantificeret på basis af mængden af ​​methylenblåt adsorberet til at interagere med cellulære proteiner målt ved spektrofotometer (Molecular Devices) ved 595 nm. Værdierne blev beregnet og værdien dag nul blev trukket fra hver gennemsnitlig værdi inklusive den ubehandlede kontrol. De lægemiddelbehandlede værdier blev udtrykt som en procentdel af den ubehandlede kontrol, og procenter blev afbildet versus lægemiddelkoncentration at generere en IC

50 værdi. Alle eksperimenter blev udført i dobbelte brønde og blev gentaget mindst tre gange.

klongenicitetsassayet

Colon 38 og HCT 116 celler blev udpladet med 2,4 x 10

5 /brønd i seks- brønds plader henholdsvis og behandlet med Malformin C eller oxaliplatin i 24 timer. Den næste dag blev cellerne høstet og podet i nye seks-brønds plader med 300 /brønd med frisk dyrkningsmedium. Kolonierne blev farvet med methylenblåt efter 11 dage og derefter talt. Resultaterne omfattede de midler og S.D. opnået fra tre uafhængige forsøg.

Cell Cycle Analysis

Colon 38 og HCT 116 celler blev podet separat på seks-brønds plader med 3 × 10

5 celler per brønd, og inkuberet i 48 timer. Forskellige koncentrationer af Malformin C eller Oxaliplatin blev tilsat til dyrkningsmediet og inkuberes i yderligere 24 timer. Celler blev derefter høstet under anvendelse af pancreatin og 10 pg /mL DNase1, 37 ° C, 5 min og vasket to gange med kold PBS. I alt 1×10

6 celler for hver prøve blev opdelt i portioner, resuspenderes i 500 pi PBS og fikseret ved tilsætning 500 pi 4% PFA. Efter 30 minutters inkubation på is, blev prøverne vasket to gange med kold PBS. Før analyse celler blev resuspenderet i 150 pi 1 ug /ml DAPI i PBS i 30 minutter, derefter filtreret for at fjerne aggregater. Analyse blev udført på en BD Biosciences LSRII og analyseret ved hjælp FlowJo software (Tree stjerne).

Apoptose Assay

Tidligt apoptotiske hændelser blev bestemt ved hjælp af en Vybrant Apoptose Assay Kit # 2 (Molecular Probes , V13241) ifølge producentens instruktioner, og den beskrevne før [23] metode. Colon 38-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af Malformin C og CPT i 24 timer. Celler behandlet med 3,7% formaldehyd i 15 minutter blev anvendt som positive kontrolceller. Analyse blev udført på en BD Biosciences LSRII og analyseret ved hjælp FlowJo software (Tree stjerne).

konfokalmikroskopi

Colon 38 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af Malformin C i tre forskellige tidsforløb, herunder 24 timers behandling, 48 timers behandling, og 24-timers rensning efterfulgt af Malformin C tilbagetrækning og yderligere 24 timers inkubation. Alle cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS og derefter permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i PBS. 3% bovint serumalbumin i PBS, blev anvendt til at blokere ikke-specifik binding. Celler blev derefter eksponeret for monoklonalt anti-p53, monoklonalt anti-spaltet caspase 3, eller monoklonale anti-LC3 (1: 200; Cell Signaling Technology) ved stuetemperatur i 1 time, vasket med 0,2% Tween 20 i PBS efterfulgt af fluorescein isothiocyanate- konjugeret anti-kanin IgG ved 1: 400 fortynding. Cytoplasmisk actin blev counter-farvet med 0.25μg /ml rhodamin phalloidin (Invitrogen). Cellerne blev derefter forseglet i antifade reagens (Invitrogen). Konfokale mikrografer blev scannet af en laser konfokalt (LSM 510, Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).

Western Blot

Colon 38 celler og HCT 116 (5 × 10

5) blev udpladet på plader med 6 brønde. Efter 24 timer blev celler behandlet som angivet i figurteksterne. Celler blev lyseret i 2 × SDS-prøvebuffer (26.7mM pH 6,8 Tris-HCl, 1% SDS, 25% glycerol, 0.36M β-mercaptoethanol og 0,05% bromphenolblåt) og sonikeret i 10 sekunder for at forskyde DNA. Helcelle-ekstrakter blev derefter elektroforeret gennem 15% eller 8% SDS-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). De blev derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med blokeringsopløsning (TBS, 0,1% Tween 20, og 3% fedtfri mælk), efterfulgt af et specifikt antistof mod phospho-histon H2A.X (Ser139) (1: 2000, kanin monoklonalt mAb ; Cell Signaling Technology, # 9718), total H2A.X (1: 2000, kanin monoklonalt mAb; Cell Signaling Technology, # 7631), caspase 3 (D2R6Y) (1: 1000, kanin monoklonalt mAb; Cell Signaling Technology, # 14220 ), og LC3A (D50G8) (1: 1000, kanin monoklonalt mAb; Cell Signaling Technology, # 4599) natten over ved 4 ° C. Membranerne blev derefter yderligere inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin-IgG (1: 2000; Sigma) ved stuetemperatur i 2 timer, og signaler blev visualiseret ved forøget kemiluminescens (Perkin-Elmer Life Science). Den phospho-histon H2A.X og totale H2A.X blots blev testet igen med antistoffer til p-Actin. (1: 2000, Sigma, A5316)

Animal Studies

I alt tredive 4 ± 0,5 uger gammel kvinde BDF1 mus (Charles River Laboratories) blev anvendt til det første eksperiment, femogtyve 6 ± 0,5 uger gamle mus til det andet forsøg, og seks 6 ± 0,5 uger gamle mus til patologisk undersøgelse. Alle mus blev opstaldet i to uger inden forsøget at tilpasse sig miljøet på Yale Animal Facility, SPF (SPF), 23 ± 2 ° C, 12:12 lys og mørke cyklus, 5 pr bur. 2 × 10

6 murine Colon 38-celler blev transplanteret subkutant i hver mus til eksperimentet. Vi overvåges dagligt vægten af ​​dyret, tab af mobilitet, nedsat kropstemperatur og unormal bevægelse eller stilling, mangel på grooming aktivitet, dehydrering, vurderet ved en 2-3 sek telt tid og /eller hvis musen tabt mere end 15% legeme vægt, ville det blive fjernet fra undersøgelsen. Ethvert dyr, der optrådte meget syg, der var koldt at røre ved, krum, kunne ikke bevæge sig, spise eller drikke normalt fra behandlingen blev aflivet med 30% isofluran (blanding af 30% v /v isofluran og 70% propylenglycol) indånding og livmoderhalskræft dislokation. Efter 10 til 14 dage, mus med tumor størrelser på 150-300 mm

3 blev udvalgt i en pulje, og derefter tilfældigt allokeret til forskellige grupper, med 5 mus i hver gruppe. Malformin C blev opløst ved 10 mM DMSO, og slutkoncentrationen af ​​DMSO var mindre end 0,05% af Malformin C opløsning anvendes til behandlingen. Forskellige koncentrationer af steriliseret malformin C (0,1 mg /kg, 0,3 mg /kg, 0,9 mg /kg, 1,8 mg /kg, 2.6mg /kg) og steriliseret PBS blev administreret intraperitonealt (ip) om morgenen fra dag 1. efter hele behandling blev blodprøver opsamlet efter bedøvelse med 30% isofluran inhalering, og derefter blev musene aflivet ved cervikal dislokation. Tumorvæv blev udtaget efter musene blev bekræftet døde og nedfrosset i -70 ° C til fremtidig undersøgelse. For patologisk undersøgelse af Malformin C akutte giftighed, vi tildelt tilfældigt seks mus i PBS koncernen og 1,8 mg /kg Malformin C-gruppen. Lægemidler blev injiceret i.p. og alle forsøgspersonerne blev overvåget hvert 15. minut i 6 timer, indtil mus i Malformin C-gruppen var tæt på døden. Derefter blev musene aflivet, blev der taget blodprøver for kemi, del af milten og peritoneum blev dyrket i bakteriologi, og resten af ​​undersøgte væv blev fikseret i formalin, indlejret i paraffin, og snit til histopatologiske undersøgelser. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med en godkendt Yale University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) protokol (2013-07.784). blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Alle afsnit i denne rapport overholde de ANKOMMER retningslinjer for rapportering dyr forskning.

Plasma cytokin assay

Plasma cytokin assay blev udført efter betjeningsvejledningen BD cytometrisk Bead Array (CBA) Mus Th1 /Th2 Cytokine Kit brugsanvisning. Muse- Th1 /Th2 cytokin standarder blev rekonstitueret i assay-fortyndingsmiddel og serielt fortyndet til koncentrationen af ​​0-5000pg /ml. Et beløb på 10 pi af hver prøve mus cytokin capture perle suspension blev blandet, og 50 pi af standard fortyndinger eller test blandede perler blev overført til analyse rør. Efter tilsætning 50 pi af PE påvisningsreagens blev prøverne inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer. Derefter blev prøverne vasket og 300 pi vaskebuffer sattes til hvert rør. Alle prøver blev analyseret ved hjælp af BD FACS Array System.

Statistisk analyse

Data blev analyseret ved en- eller to-vejs variansanalyse (ANOVA) (GraphPad Prism 5), Students t-test (Microsoft Office Excel), og korrelationsanalyse (GraphPad Prism 5). Forskellen blev anset for at være statistisk signifikant, når

P

. 0,05

Resultater

Den væksthæmning og clonogenicity af Malformin C mod forskellige cancer cellelinjer

virkningerne af Malformin C på væksten hæmning af forskellige cancer cellelinjer blev undersøgt. Alle celler blev udsat for stigende koncentrationer af Malformin C og L-OddC. IC

50 værdi blev defineret som koncentrationen af ​​lægemiddel, der inhiberede cellevækst med 50%. L-OddC, også kendt som troxacitabine, er en L-nukleosidanalog med anticanceraktivitet [24-27] og blev anvendt som en positiv kontrol i denne undersøgelse. Malformin C inhiberede Colon 38, HCT 116, PanO2, NCI-H1975, CEM og KB-celler i en dosis-afhængig måde med et IC

50 på 0,27 ± 0,07 pM, 0,18 ± 0,02 uM, 0,29 ± 0,05 uM, 0,16 ± 0,04 uM, 0,030 ± 0,008 pM og 0,18 ± 0,05 uM henholdsvis (S1 tabel). Malformin C havde forskellige hæmningseffekter blandt forskellige cancercellelinier (

P

0,01, envejs ANOVA), og Malformin C var mere potent end L-OddC for vækstinhibering af Colon 38, HCT 116 og PanO2 (

P

0,01, t-test). Derfor valgte vi Colon 38 og HCT 116 for den følgende undersøgelse. Virkningerne af Malformin C på kolonidannende evne Colon 38 og HCT116 blev derefter bestemt som den procentdel af synlige koloni antal lægemiddel-behandlede gruppe sammenlignet med ikke-behandlede kontrolgruppe af klonogene assay. Colon 38 og HCT 116 celler udviste en dosisafhængig tab af kolonidannende evne efter udsat for Malformin C med en LC

50 værdi på 0,6 ± 0,07 uM og 0,7 ± 0,09 uM henholdsvis, som blev defineret som koncentrationen af ​​lægemiddel at inhiberede kolonidannelse med 50%. Forholdet mellem LC

50 til IC

50 blev ca. 2: 1 i Colon 38-celler og 4: 1 i HCT 116-celler og dette resultat indikerede, at Malformin Cs virkninger på vækstinhibering af Colon 38 og HCT 116 var delvist irreversibel.

effekter af Malformin C på anticancer narkotika resistente cellelinier

cross-resistens profiler af Malformin C, sammenlignet med andre konventionelle anti-cancer medicin, blev undersøgt ansætte KB cellelinie og en række velkarakteriserede KB lægemiddelresistente cellelinier (tabel 1). Malformin C udviste en 233-fold resistens over for KB-MDR-celler, som overudtrykte humant P-gp 170-protein, sammenlignet med KB-celler (

P

0,0001). Det var også 4,4 gange resistent over for KBv20c celler (

P

0,001) og 2,8 gange mere følsomme over for KB300-CPT-celler (

P

0,05) sammenlignet med KB-celler ( tabel 2). For yderligere at bekræfte Malformin C modstand mod KB-MDR-celler, verapamil (VRP), en calciumkanal-antagonist af P-gp 170-protein, blev anvendt til revers multilægemiddelresistens [28]. En ikke-toksisk koncentration af VRP (5 uM) blev administreret til KB resistente celler udover Malformin C, Taxol og Doxarubicin i 72 timer. Med VRP havde IC

50 i Malformin C i KB-MDR faldt betydeligt, fra 233-fold til 4-fold af den for KB-celler (tabel 3). Disse data viser, at KB-MDR-celler var meget modstandsdygtige over for Malformin C, og lægemiddel-resistente effekt blev vendt af VRP. Vejviser

Malformin C forårsagede G2 /M anholdelse i Colon 38 cellelinje

virkningerne af Malformin C på cellecyklus fase fordeling af Colon 38 og HCT 116 celler blev undersøgt, og en koncentration på 90 nM, 270 nm, 810nM af Malformin C blev administreret henholdsvis 24 timer og 48 timer. Som illustreret i figur 1, den procentdel af G2-M-fasen gradvist endnu væsentligt forøget i Colon 38-celler behandlet med 270 nm og 810nM Malformin C i både 24-time (Fig 1B og 1D) og 48-timers (Fig 1C og 1D) -forsøg . Omvendt procentdelen af ​​G1-fasen faldt i celler udsat for 810nM Malformin C. Disse resultater antydede, at Malformin C inducerede en dosisafhængig G2-M standsning i Colon 38-celler. Der blev imidlertid ikke observeret nogen tidsafhængige ændringer af cellecyklusprogression i Colon 38-celler (Fig 1D, S1 Fig), og ingen mønster ændringer cellecyklus blev fundet i HCT 116-celler (S2 Fig). Desuden har vi undersøgt virkningerne af Malformin C på cellecyklusprogression af Colon 38 celler udsat for SN38 i 24 timer. Alle celler blev behandlet med en stigende dosering af Malformin C (0nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM) foruden ingen lægemiddel eller 9nM SN38 hhv. Irinotecan (CPT-11) er en analog af camptothecin-en topoisomerase I-inhibitor. Inde i kroppen, er det omdannet til den aktive metabolit SN38 (7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin) af leverenzymer og tarm carboxyesterases, og SN38 har en meget højere potens

in vitro

forårsager alvorlige DNA-skader, som fører til G2-M anholdelse i kræftceller. I denne undersøgelse, vi igen bekræftet, at når de behandles med 300 nM Malformin C alene, den procentdel af G2-M fase Colon 38 celler steget væsentligt i forhold til kontrolgruppen (Fig 1E). Derudover SN38 induceret G2-M anholdelse i Colon 38 celler og tjente som en positiv kontrol. Der var ingen signifikant forskel på progressionen mønster mellem Colon 38 celler behandlet med SN38 alene og dem behandlet med Malformin C i tillæg til SN38 (Fig 1E).

Irreversible virkning af Malformin C i forårsager celledød

Induktion af tumor suppressor protein p53 er en central begivenhed for celler som respons på DNA-skade [29]. De fleste af kemoterapeutiske midler til kræftbehandling arbejde gennem DNA-beskadigelse, hvilket resulterer i celledød ved apoptose, autophapy eller nekrose [30]. For apoptose, både ydre og indre veje fører til

caspase 3

aktivering som i sidste ende inducerer apoptose, og derfor spaltet caspase 3 kan anvendes til at evaluere apoptose proces [31]. For autophagy, er påvisning af mikrotubulus-associeret protein let kæde 3 (LC3) almindeligt anvendt til at overvåge autofagi og Autophagy-relaterede processer, herunder autophagic celledød [32]. I denne undersøgelse p53, blev spaltet caspase 3 og LC3 undersøgt anvendelsen konfokalt mikroskop. Alle Colon 38 celler for konfokal blev behandlet med Malformin C ved koncentrationerne af 0 um, 0,27 um og 0,54 uM i 24 timer, 24 timer efterfulgt af Malformin C tilbagetrækning og en anden 24 timers kultur ved skiftende medier, og 48 timer henholdsvis ( fig 2A). Ekspressionen og placering af p53 blev vist i immunofluorescens mikrografer at p53-ekspression blev induceret i kernen efter eksponeret for 0,54 uM Malformin C i 24 timer, uanset om cellerne blev dyrket i yderligere 24 timer eller ikke (Fig 2B-2D). Når de behandles i 48 timer, selv om p53 ikke blev vist i celler, blev celletallet væsentligt reduceret, hvilket indikerede de celler, der udtrykker p53 var sandsynligvis døde af DNA-beskadigelse (figur 2E). Også udtrykkene for spaltet caspase 3 og LC3 var højere i Malformin C behandlet Colon 38-celler, især ved koncentrationen 0,54 uM, hvilket betød der var flere celler oplever apoptose og autofagi efter at være blevet udsat for Malformin C (Fig 2B-2E) .

ekspressionsniveauet (grøn fluorescens) blev probet med specifikt monoklonalt p53, kløvet caspase 3 og LC3 antistoffer, efterfulgt af FITC-konjugeret anti-muse-IgG. Cytoplasmatisk Actin (rød fluorescens) blev modfarvet med rhodamin phalloidin. Immunofluorescens mikrografer er taget ved konfokal mikroskop. (A) Eksperiment design-Malformin C blev givet for 24 timer og farves ved 24, for 24 timer og farves på 48 timer, i 48 timer og farves på 48 timer, hhv. (B) Immunofluorescens-farvning ved 24 timer efter 24h behandling. (C) Immunfluorescensfarvning ved 48h efter 24h behandling. (D) Immunfluorescensfarvning ved 48h efter 48h behandling. (E) Angivelse af p53, kløvet caspase 3 og LC3 efter tre måder administration af forskellig koncentration af Malformin C baseret på konfokal mikroskopi resultater.

Malformin C førte til flere former for celledød

histon H2A.X er en variant histon, der repræsenterer omkring 10% af de totale H2A histonproteiner i normale humane fibroblaster. Inden for få minutter efter DNA beskadigelse er H2A.X phosphoryleret ved Ser139 på steder med DNA-beskadigelse [33]. I vores undersøgelse blev Colon 38-celler og HCT 116 celler behandlet med Malformin C i 2 timer, 4 timer, 8 timer og 24 timer, og udtrykkene for phospho-Histone H2A.X og total H2A.X blev undersøgt ved Western blot. Som vist i figur 3, var der en dosisafhængig opreguleret ekspression af phosphoryleret H2A.X ved Ser139 efter 24 timers behandling af Malformin C i begge Colon 38 og HCT 116 celler, mens ekspressionen af ​​samlede H2A.X kun steg i Colon 38-celler efter 24 timers behandling af Malformin C. Desuden blev en mindre dosisafhængig phospho-H2A.X ekspression observeret efter 8 timers behandling af Malformin C i HCT 116-celler. Når vi tog forholdet mellem phosphoryleret og total H2A.X, det viste, at Malformin C forårsagede fosforylering af H2A.X i HCT 116 celler i en dosisafhængig måde, når de behandles i 8-24 timer.

( A, C) udtrykket af fosforyleret og total H2A.X i Colon 38 celler behandlet med forskellige koncentrationer af Malformin C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM) og Hydroxyurea (1 mM, 2 mM) til 2-timers, 4 timer , 8 timer og 24 timer testet ved Western blot, med β-actin-ekspression som en intern kontrol. Hydroxyurea blev anvendt som positiv kontrol. H2A.X phosphoryleres ved Ser139. (B, D) Ekspressionen af ​​phosphoryleret og total H2A.X i HCT116-celler behandlet med forskellige koncentrationer af Malformin C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM) og Hydroxyurea (1 mM, 2 mM) i 2 timer, 4 timer, 8 timer og 24 timer testet ved Western blot, med β-actin-ekspression som en intern kontrol. Hydroxyurea blev anvendt som positiv kontrol. H2A.X phosphoryleres ved Ser139.

udtryk for caspase 3 og LC3 blev også undersøgt af Western blot. Under autophagy, er LC3AI konverteret til LC3AII gennem lipidering, og LC3AII tjener som en indikator for autofagi. Så vi analyserede LC3AII udtryk for at teste Malformin C effekt på autofagi. Efter 24 timers behandling af Malformin C, observerede vi en dosisafhængig opregulering af spaltet caspase 3 i HCT 116-celler, og en dosisafhængig opregulering af LC3AII i både Colon 38 og HCT 116-celler (Fig 4A og 4B ). Men der var ingen dosis-respons for den øgede ekspression af spaltet caspase 3 i Colon 38 celler, og det kunne skyldes, at nogle apoptotiske celler løsnet fra pladen under dyrkning og gik tabt, når mediet blev fjernet. Der blev ikke fundet signifikante ændringer af kløvet caspase 3 og LC3AII udtryk efter 4 timers og 8-timers behandling (S5 Fig). For yderligere at undersøge dødsprocessen af ​​de DNA-beskadigede celler, gennemførte vi den apoptose-assay og fundet en signifikant større gruppe af sene apoptotiske celler og nekrotiske celler efter Malformin C eksponering, mens andelen af ​​tidlige apoptotiske celler viste ingen forskel fra kontrollen ( fig 3E). Alt i alt fandt vi, at 24-timers behandling af Malformin C kan forårsage DNA-skader og føre til celledød via apoptose, autophapy og nekrose.

(A, B) Udtrykket af spaltede caspase 3, total caspase 3, LC3AI og LC3AII i Colon 38 og HCT 116 celler behandlet med forskellige koncentrationer af Malformin C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM i 24 timer blev testet af Western blot, med β-Actin udtryk som en intern kontrol. Under