PLoS ONE: Struktur-Based udvikling i små Molecule PFKFB3 Inhibitors: Rammer for potentielle kræft terapeutiske midler Målretning af Warburg Effect

Abstrakt

Kræftceller vedtage glycolysen som den vigtigste kilde til metabolisk energiproduktion til hurtig cellevækst. HIF-1-induceret PFKFB3 spiller en central rolle i denne tilpasning ved at hæve koncentrationen af ​​Fru-2,6-BP, den mest potente glycolyse stimulator. Da denne metaboliske omdannelse er blevet foreslået at være et kendetegn for cancer, har PFKFB3 opstået som en hidtil ukendt mål for cancerkemoterapi. Her rapporterer vi, at en lille molekylær inhibitor, N4A, blev identificeret som en første lederforbindelse til PFKFB3 inhibitor med terapeutisk potentiale. I et forsøg på at forbedre sin styrke, vi bestemt krystalstrukturen af ​​PFKFB3 • N4A kompleks til 2,4 Å opløsning og, at udnytte det dermed molekylær information, nået mere potent YN1. Når testet på dyrkede cancerceller, både N4A og YN1 inhiberede PFKFB3, undertrykke Fru-2,6-BP niveau, som igen undertrykt glycolyse og i sidste ende førte til celledød. Denne undersøgelse validerer PFKFB3 som et mål for nye kræftbehandlinger og giver en ramme for fremtidige udviklingsindsats

Henvisning:. Seo M, Kim JD, Neau D, Sehgal I, Lee YH (2011) Struktur-Based Udvikling af Small Molecule PFKFB3 Inhibitors: Rammer for potentielle kræft terapeutiske midler målretning af Warburg Effect. PLoS ONE 6 (9): e24179. doi: 10,1371 /journal.pone.0024179

Redaktør: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, Indien

Modtaget: 2. maj 2011; Accepteret: August 2, 2011; Udgivet: 21 September, 2011

Copyright: © 2011 Seo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en National Cancer Institute tilskud 1R01 CA124758-01 til Y.-HL De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i modsætning til normale celler, er kræftceller blevet bemærket at flytte deres energistofskiftet mod glykolyse [1]. Dette fænomen, der oprindeligt betegnes Warburg virkning, og denne overgang tillader kræftceller at tilfredsstille forøgede biosyntetiske krav til biomasse og energi [2], [3]. Undersøgelser har konsekvent vist et unormalt højt glykolytisk sats i et bredt spektrum af menneskelige kræftformer, men de sygdomsfremkaldende mekanismer der er ansvarlige for denne metaboliske tilpasning forbliver dårligt forstået [4], [5]. Blandt de mulige mekanismer, er mitokondrie respiratoriske defekter og hypoxi i tumor mikromiljø tilskrevet som to vigtige faktorer for Warburg effekten [6], [7], [8]. Trods kompleksiteten og uklarhed af underliggende mekanismer er ansvarlige for Warburg effekten, de metaboliske konsekvenser er en konsekvent transformation mod glycolysen som den vigtigste kilde til ATP-produktion [4], [9]. Denne metaboliske abnormitet af kræftceller giver abiochemical grundlag til fortrinsvis undertrykke progression af maligne celler ved selektiv hæmning af glykolyse [10], [11], [12].

I glycolysen vej, phosphofructokinase-1 (PFK- 1) katalyserer større hastighedsbegrænsende trin, der konverterer fructose-6-phosphat (Fru-6-P) til fructose-1, er 6-bisphosphat (Fru-1, 6-BP) og allosterisk reguleret af fructose-2,6 -bisphosphate (Fru-2,6-BP) [13], [14]. Under rigelig energiforsyning, høje niveauer af ATP kraftigt hæmmer PFK-1-aktivitet; dog kan Fru-2,6-BP tilsidesætte denne inhiberende virkning og forbedre glucoseoptagelse og glycolytiske flux [15]. Ikke overraskende Fru-2,6-BP syntese opreguleres i mange cancercellelinier, hvilket antyder, at selektive depletering af intracellulære Fru-2,6-BP i cancerceller kan potentielt benyttes til at hindre glycolytiske flux og undertrykke malign celle overlevelse og progression [16], [17], [18].

En familie af bifunktionelle enzymer, 6-phosphofructo-2-kinase /fruktose-2,6-bisphosphatases (PFKFB1-4), er ansvarlige for de intracellulære niveauer af Fru-2,6-BP [18], [19], [20]. Blandt disse isozymer, PFKFB3 er dominant over-udtrykt i skjoldbruskkirtlen, bryst-, tyktarms-, prostata og ovarie tumorcellelinjer [18], [21], [22]. Nylige undersøgelser har vist, at induktion af PFKFB3 ekspression ved HIF-1 under hypoxiske tilstand efterfølges af øget invasiv potentiale og modstand mod kemoterapi [21], [23]. Taget sammen antyder disse undersøgelser PFKFB3 er et potentielt mål for en ny klasse af anti-neoplastiske midler, der forhindrer indtræden af ​​cancer-specifikke glycolyse ved at inhibere Fru-2,6-BP bølge og i sidste ende, inducerer død af cancerceller. Derfor hæmning af PFKFB3 som en terapeutisk strategi for kræft er blevet foreslået [22].

På trods af de potentielle fortjenester, har udnyttelsen af ​​PFKFB3 for cancerbehandling forblev fattige. Clem et al (2008) rapporterede et pyridinyl-holdig forbindelse som en mulig PFKFB3 inhibitor, baseret på receptorstruktur forudsagt fra den af ​​PFKFB4 [24]. Selvom lovende, kan hæmmere baseret på andre end den sande PFKFB3 enzym strukturer mangler specificitet og begrænse strategisk forbedring af inhibitor potens. Vi var i stand til at overvinde sådan en medfødt defekt ved at engagere sig i de strukturelle studier af PFKFB3 og dets komplekser med ligander. I denne rapport har vi identificeret N4A som en ny kompetitiv inhibitor og testet sin hæmmende virkning på PFKFB3 aktivitet. For at forstå den molekylære mekanisme af inhibitor-anerkendelse PFKFB3 bestemte vi strukturen af ​​PFKFB3 i kompleks med N4A.Guided af det strukturelle grundlag for inhibitor binding; vi kunne derefter optimere N4A anvendelse ligheden søgning og beregningsmæssige vurdering, hvilket resulterer i en opfølgende blyforbindelse med en 5 gange forbedring i styrke.

Udover den molekylære mekanisme PFKFB3 hæmning og inhibitor forbedring vi undersøgte også inhibering af Fru-2,6-BP produktion og glycolyse i HeLa-celler ved PFKFB3 inhibitor behandling. De hidtil ukendte PFKFB3 inhibitorer, N4A og YN1 reducerede Fru-2,6-BP niveauer og glycolytisk flux, hvilket resulterer i vækstinhibering af tumorceller og massiv celledød. Disse resultater giver ikke blot beviser, som validerer målretning af PFKFB3 men også den første direkte strukturelle indsigt i protein hæmmer interaktioner, oprettelse grundlag for struktur-assisteret optimering og udvikling af nye PFKFB3 hæmmere som kemoterapeutiske midler mod kræft.

Resultater

Samlet strategi for inhibitor screening og forbedring

en skematisk flowdiagram beskriver vores strategi for opdagelse og forbedring af PFKFB3 hæmmere er vist i figur 1. Kandidater til en ledende forbindelse, blev valgt fra beregningsmæssige screening ved hjælp af krystalstruktur PFKFB3 som vi tidligere har fastlagt til 2,1 Å opløsning [25] blev anvendt som molekylær si af screening (a). De resulterende hit-forbindelser fra denne molekylsigte blev evalueret ved enzymatisk inhiberingsassay og forbindelser med den højeste inhiberende aktivitet blev selekteret som ledemolekyler efter overvejelse af lægemiddel-sandsynligheden (b). Derefter blev detaljerede kinetiske egenskaber karakteriseret (c) og de biologiske virkninger på humane adenocarcinomaceller blev undersøgt ved at måle glycolytiske flux, væksthæmning, og celledød (d). For at forstå den molekylære basis af hæmningen af ​​PFKFB3 blev røntgenkrystallografisk strukturanalyse af PFKFB3 • inhibitorkomplekset udført (e). Baseret på den molekylære oplysninger stammende fra trin (e), udførte vi en søgning efter hidtil ukendte derivater med forbedret styrke, ved anvendelse føringen forbindelse som en skabelon (f). De resulterende forbindelser fra denne lighed søgning blev evalueret gennem beregningsmæssige docking hjælp FlexX [26] (a) og den bedste optimeret forbindelse blev ledt gennem denne udvælgelsesproces igen. Gennem gentagne cyklusser af disse processer, var vi i stand til at opnå en forbindelse med hæmmende aktivitet størrelsesordener over det oprindelige bly og som udviser potent PFKFB3 hæmning in vitro.

Inhibitor Screening og bindingsegenskaber

Under vores tidligere undersøgelse blev adskillige forbindelser, der kan binde til Fru-6-P lomme af PFKFB3 identificeret fra virtuel screening. For at bekræfte de inhiberende aktiviteter og til at eliminere falske positiver fra disse lægemiddelkandidater, blev PFKFB3 inhibering testet ved 10 uM hver af forbindelserne (figur 2A). At forhindre ikke-specifik inhibering forårsaget af tilfældige hydrofobe interaktioner mellem inhibitor og protein blev en samme test udført i nærvær af 0,1% Tween-20. Blandt de testede forbindelser, ZINC04887558 (N4A, 5, 6, 7, 8-tetrahydroxy-2- (4-hydroxyphenyl) -chromen-4-on) inhiberede enzym aktivitet på over 65% under substrat-mættende betingelser og denne inhibering blev ikke påvirket ved tilstedeværelsen af ​​Tween-20. Vi valgte N4A som en indledende “ledende” (figur 2B). Den efterfølgende kinetisk undersøgelse afslørede, at N4A hæmmer PFKFB3 med en IC

50 værdi of2.97 ± 0,16 pM (tabel 1). En steady state hæmning undersøgelse viste, at N4A hæmmer PFKFB3 som en kompetitiv inhibitor mod Fru-6-Pwith en K

jeg på 1,29 ± 0,26 uM, som forventet fra virtuel screening og som påvist i en Lineweaver-Burk plot (Figur 2C) .

(A) Hæmning styrker kandidatlandenes forbindelser. Størrelserne af inhibering med forbindelser ved 10 pM hver måles gennem enzymassay og præsenteret som percentiler mod kontrollen (□). En samme forsøg blev også udført i nærvær af 0,1% Tween-20 (▪), at eliminere falske positiver forårsaget af ikke-specifikke hydrofobe interaktioner. (B) Strukturer af de PFKFB3 inhibitorer. (C) Lineweaver-Burk plots viser den kompetitive hæmning af N4A mod Fru-6-P. De inhibitorkoncentrationer blev anvendt, var: 0 pM (▪), 1 uM (○), 2 uM (▴) og 3 uM (□) af N4A. De er også mærket ved siden af ​​enkelte parceller. (D) Lineweaver-Burk plots viser den kompetitive hæmning af YN1 mod Fru-6-P. De inhibitorkoncentrationer blev anvendt, var: 0 pM (▪), 1 uM (○), 2 uM (▴) og 3 uM (□) af N4A. (E) selektivitet N4A og YN1 på PFKFB isoformer. Resultaterne udtrykkes som procent hæmning på det dobbelte af IC

50 koncentration mod PFKFB3 (N4A = 6 uM, YN1 = 1,3 uM).

Forbedring af hæmning effekten af ​​den ledende forbindelse, N4A, ved struktur-guidet optimering er et vigtigt mål med denne undersøgelse. Da detaljerne vil blive diskuteret i de følgende afsnit, er kun en kort slutresultatet indført her for tidlige sammenligninger. To yderligere N4A inhibitorer, YN1 (7, 8-dihydroxy-3- (4-hydroxyphenyl) -chromen-4-on) og YZ9 (ethyl-7-hydroxy-2-oxochromene-3-carboxylat) (figur 2B) er blevet opnået under anvendelse af struktur-styrede optimering. Som opsummeret i tabel 1, YN1 exhibitsIC

50 = 0,67 uM og K

i = 0,24 ± 0,03 uM, der viser en 5 gange stigning i inhibering. Forbindelse YZ9 viser endnu større hæmning-en størrelsesorden over start bly, N4A. Alle de testede forbindelser er opløselige i forskellige vandige opløsninger på op til 50 uM intervaller i nærværelse af. 1% dimethylsulfoxid (DMSO)

Den ledende forbindelse, N4A, og et derivat, YN1, blev testet for deres hæmmende virkning på andre menneskelige PFKFB isoformer. De hæmmere havde en stærkere effekt på PFKFB3 end på andre PFKFB isoformer. Med den dobbelte IC

50 for PFKFB3 hvor PFKFB3 var over 80% inhiberet, N4A udviser mindre end 50% inhibering og YN1 viser mindre end 40% inhibering på PFKFB1, PFKFB2 og PFKFB4 (Figur 2E). N4A og YN1 er forholdsvis selektive hæmmere af PFKFB3. Forbedring af isoformspecificitet må være det vigtigste mål for næste fase optimering og sådanne bestræbelser der gøres.

Effekter af N4A og YN1 på Fru-2,6-BP-niveauer, glykolyse, og cellevækst

Vi næste undersøgt virkningerne af anvendelsen af ​​N4A og YN1inhibitors at leve HeLa-celler. forventes inhibering af PFKFB3 at forårsage et fald i niveauerne af Fru-2,6-BP i HeLa-celler. Efter en 8 timers eksponering for N4A og YN1 blev Fru-2,6-BP reduceres med ca. 20%; efter en 48 timers eksponering, blev Fru-2,6-BP reduceret over 40% (figur 3A). Nedregulering af Fru-2,6-BP niveauer ved N4A og YN1 var ledsaget af nedsat glycolyse, som forventet. Faldet i Fru-2,6-BP-niveauer efter udsættelse for N4A og YN1 førte til et fald i produktion af lactat, som blev afspejlet af et fald i lactat sekreter større end 30%. Tilsammen tyder disse data N4A og YN1 hæmme PFKFB3 resulterer i undertrykkelse af glykolysen (figur 3B).

Fru-2,6-BP niveauer (A) og niveauerne af udskilt laktat (B) blev bestemt enzymatisk til tidspunktet 0, 4, 8, 12, 24, eller 48 timer efter inhibitor-behandlinger af HeLa-celler. Resultaterne blev normaliseret til prøveproteinet koncentrationer og udtrykt som et forhold til værdien af ​​vehikelbehandlede. Data er middelværdier ± S.E.M. fra mindst tre eksperimenter. Tidsafhængige virkninger af 25 pM af hver af N4A (linie med diamanter) og YN1 (stiplet linje med hule firkantede) på de cellulære Fru-2,6-BP niveauer (A) og de lactat sekreter (B) er vist. (C) væksthæmmende af N4A, YN1, og YZ9 på HeLa og T47D-celler. Celleantal blev analyseret over 36 timer med den trypanblåt tælle eller XTT-assay. Datapunkter er udtrykt som% cellevækst af kontrol indeholdende køretøjet mod logaritmisk skala af inhibitorkoncentrationer. Fejl barer står for intraexperimental replikater standardafvigelsen.

Øget Fru-2,6-BP-niveauer indledes med øget glykolysen ofte ledsager spredning af transformerede celler, herunder kræftceller [3]. Vi undersøgte virkningen af ​​PFKFB3 inhibitorer, N4A og YN1, på proliferationshastigheden af ​​humane adenocarcinomaceller. Behandlinger med 25 pM af hver af N4A og YN1 forårsagede 70% og over 90 reduktioner% henholdsvis i celleproliferation, sammenlignet med ueksponerede celler (figur 3C). Resultaterne af cellevækstinhiberingen assays konsekvent bekræftet, at inhibering af PFKFB3 ved N4A og YN1 undertrykker cellulær energimetabolisme og i sidste ende cellevækst og at YN1 er en mere potent inhibitor med en GI

50 på 8,2 ± 0,8 uM i forhold til N4A (GI

50 = 14,2 ± 1,5 pM) (tabel 1). N4A og YN1 var også i stand til at inhibere blød agar-kolonidannelse i HeLa-celler (figur 4). HeLa-celler blev udpladet i blød agar med forskellige koncentrationer af N4A eller YN1 og dyrket i 3 uger for at tillade kolonidannelse. Begge forbindelser inhiberede signifikant kolonidannelse ved 25, 50 og 100 uM. Kolonidannelse blev inhiberet med 64% og 79% i nærvær af 25 uM N4A og YN1 henholdsvis.

(A) forankringsuafhængig cellevækst i blød agar. HeLa-celler blev dyrket i blød agar i 21 dage i nærvær af de angivne koncentrationer af N4A og YN1 henholdsvis (20 ×). (B) Statistisk analyse af forsøget. Kolonner, mean (n = 5); barer, SD.

For yderligere at undersøge mekanismen ansvarlig for antiproliferativ virkning af PFKFB3 inhibitorer, blev flow-cytometrisk analyse af celledød udføres. Resultaterne indikerer, at N4A og YN1 inducerede både apoptotisk og nekrotisk celledød. Denne blandede mønster er relateret til arten af ​​apoptose, som i modsætning nekrose, er en ATP-afhængig proces [27], [28]. Celledød induceret af PFKFB3 hæmmere bør korrelerer med deres evne til at udtømme cellulære ATP og udtynding af ATP favoriserer døden ved nekrose som tidligere spekuleret [11], [27], [28]. Vores data understøtter dette argument: ved en relativt lav koncentration (25 uM) af N4A eller YN1, et miljø, hvor udtømning af cellulær energi udtynding er moderat, blev cellerne fundet at være tilbøjelige til apoptose, hvorimod, ved højere koncentrationer (50 uM) af inhibitorer blev døden ved nekrose væsentligt forøget på grund af utilstrækkelig cellulær energi i forbindelse med apoptotisk proces (figur 5).

cellerne blev behandlet med to forskellige koncentrationer af inhibitorer, 25 uM og 50 uM. (A) Induceret celledød ved to forskellige koncentrationer af N4A blev målt ved flowcytometri efter dobbelt farvning med Annexin V og PI. (B) Kvantificering af flow-cytometrisk data (middelværdi ± SD), der viser en dosis-relateret virkning N4A. (C) cytogrammer af YN- celledød og (D) kvantificering af flowcytometrisk data.

opbygning PFKFB3 • N4A kompleks

Vi ønskede at bruge N4A inhibitor som en bly til struktur-styrede optimering af yderligere inhibitorer. For at lette denne opgave, var det nødvendigt at bestemme de molekylære karakteristika N4A binding til PFKFB3 ved at krystallisere menneskelig PFKFB3 i tilstedeværelse af N4A. Vi bestemt strukturen af ​​dette kompleks til 2,4 Å opløsning med en metode med molekylær udskiftning ved hjælp af den første PFKFB3 struktur (FBF-kode: 2AXN) som en søgning model [29]. En