PLoS ONE: SATB1 Overekspression Regulerer udvikling og progression i blærekræft gennem EMT

Abstrakt

Den globale gen regulator Special AT-rige sekvens-bindende protein-1 (SATB1) er blevet rapporteret at inducere EMT-lignende forandringer og være forbundet med dårlig klinisk resultat i flere kræftformer. Denne undersøgelse har til formål at vurdere, om SATB1 påvirker de biologiske adfærd af blære overgangsordning celle karcinom (BTCC) og yderligere at belyse, om denne effekt virker gennem en epitelial-mesenkymale overgang (EMT) vej. Ekspressionen af ​​SATB1, E-cadherin (epiteliale markører), vimentin (mesenchymal markører) i BTCC væv og tilstødende noncancerous væv, såvel som i to cellelinier af blærecancer blev undersøgt. Hvorvidt SATB1 ekspression er associeret med klinisk-patologiske faktorer eller ikke blev analyseret statistisk. Cell invasion og migration, cellecyklus, celledeling og apoptose blev evalueret i SATB1 knockdown og overudtrykte cellelinier. Vores resultater viste, at ekspressionen af ​​SATB1 var bemærkelsesværdigt opreguleret både i BTCC væv og blære kræft cellelinjer med stort potentiale for metastaser. Resultaterne blev også forbundet med EMT markører og dårlig prognose i BTCC patienter. Desuden SATB1 induceret EMT processer gennem nedregulering af E-cadherin, opregulering af E-cadherin repressorer (sneglen, Slug og vimentin). SATB1 forfremmet også cellecyklusprogression, celleproliferation, celle invasion og celle migration, men ændrede ikke celle overlevelse. Som konklusion tyder vore resultater, at SATB1 spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​blærekræft ved at regulere gener, der kontrollerer EMT processer. Endvidere kan det være et hidtil ukendt terapeutisk mål for aggressive blære kræft

Henvisning:. Wan F, Cheng C, Wang Z, Xiao X, Zeng H, Xing S, et al. (2015) SATB1 Overekspression Regulerer udvikling og progression i blærekræft gennem EMT. PLoS ONE 10 (2): e0117518. doi: 10,1371 /journal.pone.0117518

Academic Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: August 7, 2014 Accepteret: December 26, 2014; Publiceret: 23 feb 2015

Copyright: © 2015 Wan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Blærekræft (BC) er en af ​​de mest almindelige maligne neoplasmer som påvirker foring af urinblæren, med en anslået 386,300 nye tilfælde og 150,200 dødsfald som følge af sygdommen på verdensplan, om året [1]. I Kina har man rapporteret, at BC er den mest almindelige urogenital malignitet, og forekomsten af ​​denne sygdom er blevet øget i de seneste årtier [2]. På grund af den høje lokale tumortilbagevenden, yderligere progression og fjerne metastaser, har dårlig klinisk resultat blevet vist for BC patienter, trods de store forbedringer i kirurgiske teknikker og adjuvans terapier [3-6]. I mellemtiden er de komplicerede veje under onkogenese og uforudsigelige biologiske adfærd kræft stadig dårligt forstået og påvirkes af miljømæssige og genetiske faktorer [7]. Derfor er der behov identifikation af nye molekylære markører, der kunne tjene som standard prognostiske faktorer for tidlig diagnose og for udviklingen af ​​en mere effektiv behandling for BC patienter.

Det har været almindeligt anerkendt, at dårlig prognose af maligniteter er forbundet med tumor aggressivitet. Dette sker, når noninvasive celler bliver invasiv gennem flere metastatiske trin, såsom epitelceller miste polaritet og yderligere invaderende vaskulære og lymfatiske rum [8]. Den epitel mesenkymale overgang (EMT) er den centrale proces som oprindeligt opstår under kritiske faser af embryonale udvikling, hvor cellerne mister deres epitelial karakteristika og celle-celle kontakter, og samtidig erhverve vandrende og invasive egenskaber af mesenkymale celler [9-11]. Endvidere kan der opstå lignende EMT-lignende processer under tumorprogression i carcinomer og har en fremmende rolle i forebyggelsen apoptose og senescens af tumorceller, der bidrager til immunsuppression [12]. Tab af E-cadherin udtryk er kendetegnende for EMT-processen [9]. Igen, i de seneste undersøgelser, transkriptionsfaktorer, såsom Sneglen og Slug er blevet identificeret som direkte repressorer af E-cadherin og inducere af EMT, hvilket yderligere fremkalder komplette EMTs på både morfologiske og adfærdsmæssige niveauer, når overudtrykt i epitelceller [13-15] . Desuden en voksende mængde af beviser tyder på, at EMT spiller en central rolle i initiering og udvikling af metastaser under tumor invasion og progression af blærekræft

in vivo

in vitro

[16 -18].

Special aT-rige bindende protein 1 (SATB1) er en nuklear matrix-tilhæftning-region (MAR) DNA-bindende protein, der virker som et genom organisator og gen regulator gennem modulering af rumlig konformation af kromatin. Den deltager også i en række biologisk vigtige processer såsom proliferation, differentiering, apoptose og omprogrammering af ekspressionsprofiler [19-21]. I nyere undersøgelser er der fundet opregulering af SATB1 at være korreleret med invasion og metastase af mange typer malignances, herunder mavecancer, brystcancer, rektal cancer, levercancer, og prostatakræft. Disse resultater tyder på, at SATB1 er en uafhængig prognostisk faktor og et potentielt terapeutisk mål i humane kræftformer [21-26]. For eksempel Han et al fandt, at SATB1 udtømning kunne vende den EMT proces gennem nedregulering af E-cadherin repressorer såsom Sneglen og Sipi og opregulering af E-cadherin i stærkt aggressive (MDA-MB-231) cancerceller [21] . En anden undersøgelse rapporterede, at kemoterapeutisk undertrykkelse af MIR-448 øger mRNA-niveauer af SATB1 og fremmer EMT. Disse resultater giver potentielle nye terapeutiske metoder til blærekræft.

Mens blære overgangsordning celle karcinom (BTCC) er en af ​​de mest almindelige undertyper af BC, den nuværende viden om den specifikke mekanisme BTCC invasion og metastase er stadig begrænset. I en nylig undersøgelse, Bin Han et al fandt, at SATB1 blev overudtrykt i humane blærecancer og forbundet med tumorklassificering og scene. Derudover har de også vist sig, at SATB1 udtømning faldt celleproliferation og forøget celle apoptose i 5637 og T24-celler [27]. Men hvor ekspressionen af ​​SATB1 påvirker den biologiske adfærd BTCC og om SATB1 inducerer EMT i blærekræft er stadig uudforsket. I denne undersøgelse evaluerede vi udtryk for SATB1 i BTCC prøver og blærekræft cellelinjer selvom immunhistokemisk farvning, real-time RT-PCR assays og western blotting analyse og fandt, at dets udtryk er korreleret med klinisk patologiske karakteristika. I etablerede humane blære cancer cellelinjer, vi yderligere demonstreret, at overudtrykt eller tavshed SATB1 reguleret cellen migration, invasion og spredning, sammen med cellecyklus.

Materialer og metoder

Materialer

Primær blærekræft prøver og matchede ikke-kræft væv blev opnået fra 126 patienter (gennemsnitsalder 65,2 år, interval 45-78) diagnosticeret med blærekræft, som gennemgik kirurgisk resektion for immunhistokemiske analyser på EU Hospital i Department of Urology (Wuhan , Kina) mellem april 2007 og oktober 2012. Dele af vævsprøver blev fikseret i formalin og indstøbt i paraffin. Alle patienterne modtog ikke præoperativ behandling, såsom kemoterapi eller strålebehandling. Alle deltagere, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi (HUST). Klinisk og patologisk oplysninger blev indhentet fra en retrospektiv gennemgang af veldokumenterede medicinske journaler. Tumorer blev klassificeret histologisk som ikke-muskel-invasiv blærekræft (NMIBC) (stadie PTA) eller muskel invasiv blærekræft (MIBC) (fase pT3) i henhold til tumor-knuder-metastase (TNM) klassificering for scenen [28]. Grade blev tildelt i henhold til WHO klassifikation af tumorer i urinvejene og Male kønsorganer (2004) [28]. Alle dødsfald skyldtes blærekræft. Patient karakteristika er beskrevet i tabel 1. Menneskelige blærekræft cellelinjer BIU-87 og T24 blev opretholdt i vores laboratorium (Central Laboratory for Union Hospital, Tongji Medical College, HUST, Wuhan, Kina). BIU-87-celler blev afledt fra en klasse II, ikke-muskel-invasiv (PT1) humant BTCC i urinblæren. T24-celler, som er dårligt differentieret og besidder et højere potentiale for metastase og vise en typisk fibroblastisk morfologi mikroskopisk blev afledt af en grad III blærecarcinom [29]. Cellerne blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 100 ug /ml penicillin-streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA, USA) og inkuberet med en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C.

immunohistokemisk farvning analyse

Proteinekspression blev bestemt ved immunohistokemisk farvning for SATB1, E-caderin og vimentin, med streptavidin biotin-peroxidase-kompleks fremgangsmåde under anvendelse SABC kits (Boster Ltd Wuhan, Kina) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev vævsprøverne fikseret i 10% neutral pufret formalin, dehydreret og indlejret i paraffin. Derefter blev snittene afparaffiniseret og rehydreret. Hydrogenperoxid blev anvendt til at blokere endogen peroxid aktivitet i 10 minutter. Efter antigen-genvinding under anvendelse af en mikrobølgeovn, blev sektionerne behandlet med 10% normalt gedeserum i 10 minutter ved stuetemperatur for at reducere ikke-specifik bindingskapacitet. Snittene blev derefter inkuberet med kanin-polyklonale antistof SATB1, E-caderin og vimentin (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) ved fortynding af 1:70. Disse blev efterladt i et fugtigt kammer natten over ved 4 ° C. Efter vask tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS) i 5 minutter hver gang, blev sektionerne inkuberet med sekundært antistof i 40 minutter og derefter med streptavidin biotin-peroxidase-kompleks i 40 minutter ved 37 ° C. Efter skylning diaminobenzidin (DAB; Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) blev anvendt som kromogen og blev snittene modfarvet med hematoxylin. Prøver inkuberet med PBS i stedet for det primære antistof fungerede som negative kontroller. SATB1staining i nukleare blev defineret som påviselige immunreaktioner og E-caderin og vimentin farvning i plasmalemma eller cytoplasma blev defineret som påviselige immunreaktioner. Den positive farvning blev scoret baseret på intensiteten og procentdelen af ​​celler med SATB1 nuklear farvning. Ifølge den fremherskende intensitet, blev farvningsintensitet betegnet på følgende skala: score 0, negativ nukleare farvning for alle tumorceller; score 1, svage kernekraft farvning; score 2, moderat kernefarvning; score 3, stærk nuklear farvning. Ifølge procentdelen af ​​positivt farvede celler, var stillingen af ​​farvning tæthed givet som følger: 0, mindre end 5%; 1, 5 til 25%; 2, 25 til 50%; 3, mere end 50%. Det endelige resultat blev beregnet ved at lægge de to ovenstående scorer. Snesevis af 0-2 blev defineret som lav udtryk scoringer, og 3-6 blev defineret som high scores.

RNA ekstraktion og kvantitative realtids-PCR-analyser

Samlet RNA blev ekstraheret og oprenset fra hver vævsprøve og cellelinjer under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Revers transkription blev udført under anvendelse af revers transkription kit (Takara Biotechnology Dalian, Kina) med følgende betingelser: revers transkription ved 37 ° C i 25 min, efterfulgt af inkubation ved 85 ° C i 5 sekunder i 20 ul reaktionsvolumen. Derefter cDNA’et blev fremstillet og anvendt som en skabelon til kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (PT-PCR) udført på en ABI StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) under anvendelse af SYBR Green Real- time PCR Master Mix (Takara Clontech, Kyoto, Japan). Dette blev gjort med følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, efterfulgt af 40 amplifikationscykler (95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder). Primere blev konstrueret under anvendelse af NCBI Primer-BLAST som følger: SATB1 (fremad, 5′-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 ‘; revers, 5′-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′), E-cadherin (fremadrettet, 5’-CTG GACGCTCGGCCTGAAGT-3 ‘; revers , 5’-GGGTCAGTATCAGCCGCTTT-3 ‘), vimentin (fremad, 5′-ACAGGCTTTAG CGAGTTATT-3′; omvendt, 5’-GGGCTCCTAGCGGTTTAG-3 ‘), Twist (fremad, 5’CAGCGCACCCAGTCGCTGAA-3’; omvendt, 5 ‘ -CCAGGCCCCCTCCATCCTCC-3 ‘), snail (fremad, 5′-ATCCGAAGCCACACGCTGCC-3′; revers, 5’-CACGGCTGCAGTGGGGACAG-3 ‘), Slug (fremad, 5′-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3′; revers, 5’-TTGCGTCACTCAGTGTGC-3 ‘), ZEB1: (fremad, 5′-TGCTCCCTGTGCAGTTACACCTT-3′; revers, 5’-CCAGACTGCGTCACATGTCTTTGA-3 ‘), ZEB2: (fremad, 5′-ATACCGCGGTGCCATCCTTGTACAGTGGTT-3′; revers, 5’-GCGCTGCAGAGTAATTGGAAAAAAACAAA-3 ‘) , GAPDH (fremad, 5’-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘; revers, 5′-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3’). Primerne blev designet til at være intron-spændende. Tærsklen cyklus (CT) værdier blev standardiseret til CT værdier GAPDH. De relative niveauer af individuelle mRNA i hver prøve transkript sammenlignet med kontrol GAPDH blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCt metode.

Western blotting-analyse

Totalt protein blev ekstraheret fra hver vævsprøve og cellelinie ved anvendelse RIPA buffer (Sigma, St. Louis, MO, USA) ifølge producentens anvisninger. Proteinkoncentrationer blev bestemt med et BCA Protein Assay Kit (Boster Ltd Wuhan, Kina). Lige mængder af høstede proteinprøver blev opløst på en 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) og overført til PVDF-membraner (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), efterfulgt af blokering med TBST puffer sammensat af 50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl og 0,05% Tween suppleret med 5% fedtfri mælk ved 4 ° C i 2 timer. De blottede membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin polyklonale antistof SATB1, E-cadherin, vimentin (Abcam Inc., Cambridge, CA, USA) (1: 800), ZEB1, ZEB2, Sneglen og Slug (Santa Cruz Biotechnology Inc ., Santa Cruz, CA, USA) (1: 500). Vi brugte GAPDH (Boster Ltd., Wuhan, Kina) som en belastning kontrol. Antistofbinding blev påvist under anvendelse peroxidasekonjugerede sekundære antistoffer (Boster Ltd Wuhan, Kina) i yderligere 2 timer ved stuetemperatur i overensstemmelse med producentens anvisninger. De immunreaktive bånd blev visualiseret ved forøget Western blotting påvisning systemet ECL (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) og intensiteten af ​​de detekterede bånd blev analyseret ved anvendelse af et billede J program.

SATB1-knockdown celler

En tidligere valideret shRNA blev anvendt [21]. Sekvensen af ​​shRNA var som følger: 5′-GGATTTGGAAGAGAGTGTC-3 ‘. Den shRNA blev syntetiseret og klonet ind i pGenesil2 vektoren (GenePharma Co Ltd Shanghai, Kina) og derefter transficeret i 50% -confluent T24 cellelinje sammen med et pGenesil2 kontrol vektor under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) ifølge fabrikantens instruktioner . Poolede populationer af knockdown-celler blev opnået efter to ugers selektion lægemiddel med 400 pg /ml G418, efter inkubation i 24 timer. Så de stabile RNA-interferens-medieret SATB1-knockdown cellelinjer blev betegnet som pGenesil2-SATB1-shRNA og blev yderligere dyrket i de efterfølgende eksperimenter. T24 celler behandlet med pGenesil2-scrambled-shRNA (5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘), som ikke er målrettet nogen bestemt gen blev brugt som kontrolgrupperne.

SATB1-overekspression celler

Den menneskelige fuldlængde SATB1 cDNA blev klonet i pcDNA3.1-ekspressionsvektoren købt fra GenePharma Co, Ltd (Shanghai, Kina). Efter at være blevet bekræftet ved DNA-sekventering, blev pcDNA3.1-SATB1 ekspressionsvektor og pcDNA3.1 kontrol vektor transficeres i 50% -confluent BIU-87 celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Efter transfektion blev stabile cellelinier udvalgt efter inkubering med 600μg /ml G418 i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum i to uger. Disse blev derefter dyrket for de efterfølgende eksperimenter. De SATB1-overekspression BIU celler blev etableret, og SATB1 ekspressionsniveauerne vist ved disse celler blev bekræftet ved hjælp af Real-Time RT-PCR-analyse. Ikke-transfekterede BIU-87 celler blev anvendt som kontrolgrupperne.

Immunofluorescensanalyse

For at bestemme protein cellulære lokalisering for SATB1 og E-cadherin blev immunofluorescens udført ved hjælp af en A1Si laser-konfokalt. Kort fortalt blev BIU-87 og T24-celler transficeret med pcDNA3.1-SATB1 og pGenesil2-SATB1-shRNA ekspressionsvektorer podet på dækglas og anbringes i 24-brønds plader. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 30 min ved 37 ° C efter inkubering i 3 dage, og derefter vasket med PBS to gange i 10 minutter hver. De fikserede celler blev permeabiliseret med 0,3% Triton- X 100 i 15 minutter, blokeret i 10% gedeserum i 1 time og derefter vasket med PBS to gange i 10 minutter hver. Derefter blev cellerne inkuberet med primært antistof som følger: kanin polyklonale antistof SATB1, og E-cadherin (Abcam Inc., Cambridge, CA, USA) (1:50) ved 4 ° C natten over efterfulgt af påvisning med Cy5-konjugerede sekundære antistoffer og FITC-mærket phalloidin (5 ug /ml) (Sigma) i 1 time ved stuetemperatur i mørke. DAPI blev efterfølgende anvendt til at farve kerner. Billeder blev indsamlet ved hjælp af et Nikon A1Si laser-scanning konfokal mikroskop (Nikon, Japan).

Cell invasion og migration analyser in vitro

BIU og T24cells transficeret med pcDNA3.1-SATB1 plasmider, pGenesil2 vektor indeholdende SATB1-specifikke shRNA samt den negative kontrol vektoren blev tilsat til det øvre kammer af Transwell-plader med 6,5 mm poly-carbonat filtre og 8.0μm porestørrelse (Corning Costar, MD, USA). Dette blev gjort i 100 pi serumfrit medium og 500 pi RPMI-1640 indeholdende 10% FBS. For celleinvasion assays blev Transwell filterindsatse belagt med 50 pi Matrigel (BD Biosciences, NJ, USA). Efter inkubation i 12 timer ved 37 ° C, 5% CO

2 atmosfære, de tumorceller, som trængte bunden af ​​indsatsen membran blev fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet med krystalviolet (Boster Ltd Wuhan, Kina) ifølge til fabrikantens protokol. Så de invasive farvede celler blev talt under et lysmikroskop i 10 tilfældigt udvalgte felter ved 200 ganges forstørrelse. For celle migration assays blev transficerede celler podet i øvre kamre uden overtrukket Matrigel. Efter inkubation i 12 timer ved 37 ° C, 5% CO

2 atmosfære, de migrerede celler på undersiden af ​​filtermembran blev fikseret og farvet med krystalviolet og derefter talt og analyseret som beskrevet ovenfor. Tre replikat-brønde blev testet pr assay og hvert eksperiment blev udført tre gange. Spektrofotometer blev anvendt til at måle den optiske densitet ved 560 nm, og evnen hos celleinvasion blev beregnet ved anvendelse procentdelen af ​​de celler, der trængte de Matrigelcoatede filtre.

Cell cyklus og proliferation analyse

for at validere virkningen af ​​SATB1 på cellecyklussen, flowcytometri blev anvendt til analyse procentdelen af ​​celler i hver celle cyklus fase efter cellefarvning med propidiumiodid (PI) (Keygentec, Kina) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev BIU og T24-celler resuspenderet i iskold PBS og fikseret med 70% ethanol på is. Så de faste brønde blev farvet med PI-opløsning i 30 minutter og analyseret ved flowcytometri

CCK-8 celleproliferationsassay (CCK-8 kit, Boster Ltd Wuhan, Kina). Anvendtes til påvisning cellen vækstrater ifølge fabrikantens instruktioner. Kort fortalt blev de etablerede SATB1-knockdown T24-celler og SATB1-overudtrykker BIU-87-celler ved 4 × 10

3 pr brønd blev podet i fladbundede plader med 96 brønde og inkuberet i 48 timer ved 37 ° C, i et 5% CO

2 atmosfære. Til kvantificering af cellelevedygtighed blev celler inkuberet med en CCK-8-opløsning (10 pi /brønd) i 1,5 timer ved 37 ° C. Derefter absorbansværdierne af tumorceller blev målt ved 450 nm ved angivne tidspunkter ved anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Rad, Tokyo, Japan). Tre replikatbrønde blev testet pr assay, og hvert forsøg blev udført tre gange.

Apoptose assay

For at påvise effekten af ​​SATB1 på celle apoptose, flowcytometri blev udført for at analysere apoptotics sats hjælp annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Keygentec, Kina) ifølge producentens protokol. Kort fortalt BIU og T24-celler transficeret med pcDNA3.1-SATB1 plasmider og pGenesil2 vektor indeholdende SATB1-specifikke shRNA samt negativ kontrolvektor blev udpladet i 6-brønds plader og dyrket i 24 timer. Hvorefter cellerne (1×10

6) blev farvet med Annexin-V og PI og de apoptotiske celler blev bestemt af Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit og som vurderes under anvendelse af en FACSCalibur instrument.

Statistisk analyse

dataene er præsenteret som gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM). Tre replikat-brønde blev testet pr assay og hvert eksperiment blev udført tre gange. Statistiske sammenligninger mellem grupper blev bestemt af den studerendes

t

-test. Cross-table analyse blev udført under anvendelse af Pearsons chi-squared (χ

2) test eller Fishers eksakte test for at analysere betydningen af ​​korrelationer mellem SATB1 ekspression og klinisk-patologiske træk ved blærekræft. Kaplan-Meier-kurver blev anvendt til at estimere den prognostiske relevans af SATB1 i en univariat analyse. Multivariat analyse blev udført under anvendelse af en COX proportional hazard test. Alle data blev analyseret under anvendelse SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle statistiske tests blev tosidede og statistisk signifikans blev antaget for p 0.05.

Resultater

SATB1 er opreguleret i humane BTCC væv og blærekræft cellelinje med højt metastatisk potentiale

For at undersøge om den unormale udtryk for SATB1 er relateret til blærekræft udvikling og progression og også involveret i regulering EMT i human blærecancer, immunhistokemi, real-time RT-PCR og Western blotting-analyser blev oprindeligt udført for at identificere ekspressionen af ​​SATB1. Yderligere blev de brugt til at analysere E-cadherin og vimentin i 126 vævsprøver af human blærecancer, svarende til tilstødende normale væv og blære cancercellelinier hhv. Ekspressionsniveauerne af SATB1 og vimentin fandtes at være signifikant opreguleret i mRNA og protein niveauer i NMIBC og MIBC væv sammenlignet med dem i tilsvarende hosliggende nonneoplastic prøver (Fig 1A og C,. * P 0,05; ** P 0,05). Ekspressionsniveauerne af SATB1 RNA og protein var signifikant højere i metastatiske tumorcellelinie (T24) end den ikke-metastatisk tumor cellelinje (BIU-87) (fig 1A og C. ** P 0,001), hvilket tyder SATB1 ekspression blev forbundet med aggressive tumor fænotyper. Endvidere blev ekspressionen af ​​vimentin påfaldende opreguleres på RNA- og proteinniveau i T24-cellelinien sammenlignet med dem i BIU-87 cellelinjer (Fig 1A og C;. * P 0,05). Omvendt er E-cadherin-ekspression var markant lav eller tabt på mRNA og protein niveauer i NMIBC væv, MIBC væv og høj metastatisk tumor cellelinie T24 men betydeligt højt i tilsvarende hosliggende ikke neoplastiske prøver og BIU-87cell linie (fig. 1A og C; * P 0,05, ** P 0,001). Lignende resultater blev opnået ved immunhistokemi farvning analyse til påvisning SATB1, E-cadherin og vimentin, som viste, at SATB1 overvejende blev lokaliseret i kernerne i blæren cancervæv, med lav immunoreaktivitet i normale blære væv (fig. 1b). Imidlertid vimentin viste sig at være overvejende farvet i plasmalemma af blærekræft væv, med et tab af eller lav of E-cadherin-farvning (fig. 1B). Blandt primære patienter blærekræft med positiv SATB1 udtryk vises tabt eller lav E-cadherin udtryk, men høj vimentin udtryk. I modsætning hertil SATB1-negative patienter udviste stærk E-cadherin farvning, men en let farvning af vimentin (Fig. 1D), hvilket tyder på en stærk positiv korrelation mellem SATB1 og EMT markører i BTCC.

Udtryk af mRNA-niveauer af SATB1, E-cadherin og vimentin i humane blærecarcinom væv og to blærecarcinom cellelinier blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR (A; * P 0,05, ** P 0,001). IHC-farvning af humane blærecarcinom væv og tilsvarende hosliggende ikke-kræft væv til SATB1, E-cadherin og vimentin blev udført. SATB1 farvning blev observeret i kernerne i blære cancerceller, blev vimentin fundet at være overvejende farvet i plasmalemma af blære cancerceller, men E-cadherin farvning blev observeret hovedsagelig i plasmalemma af ikke-kræft blære celler (B); Blære kræft prøver med SATB1-positive blev farvet med vimentin men ikke E-cadherin. tumor prøver med SATB1-negative, blev imidlertid farvet med E-cadherin, men ikke vimentin (D). Den oprindelig forstørrelse var × 400x (B og D). Proteinniveauer af SATB1, E-cadherin og vimentin blev undersøgt ved Western blot (C). Fejl søjler indikerer s.e.m., n = 3 eksperimenter.

Overekspression af SATB1 er forbundet med klinisk-patologiske parametre og korrelerer med dårlig prognose

Forholdet mellem SATB1mRNA udtryk og klinisk-patologiske faktorer blev undersøgt. Som vist i tabel 1, blev høj ekspression af SATB1 signifikant associeret med alderen (≥55 vs. 55, p = 0,034), primær tumor dybde invasion (T1 + T2 vs T3 + T4, P 0,001), TNM trin (trin i + II vs. stadium III + IV, P = 0,015), tilstedeværelse af lymfeknudemetastaser (P = 0,013) og tilstedeværelse af fjernmetastaser (P = 0,012). Imidlertid blev fundet nogen signifikante forskelle mellem høj SATB1 udtryk og begge køn (mand vs. kvinde, P = 0,143) eller tumor differentiering (G1 vs G2 + G3, P = 0,111). Kaplan-Meier-analyse blev udført for at bestemme den prognostiske betydning SATB1. Som vist i fig. 2, den analyse viste en sammenhæng mellem højere SATB1expression niveauer og kortere samlet overlevelsestid (P 0,001). Desuden multivariabel Cox regressionsanalyse bekræftede, at SATB1 udtryk er en betydelig og uafhængig prognostisk faktor for menneskelig blære overgangsordning celle karcinom efter justering for de andre faktorer, som vist i tabel 2 (P = 0,005).

5-års samlede overlevelse hos patienter med forhøjet SATB1 udtryk var betydeligt dårligere end dem med lav SATB1 udtryk (P 0,001; log-rank test)

Ektopisk udtryk for SABT1 inducerer EMT i et etableret. human cancer cellelinje, øge deres invasive kapacitet

Tidligere undersøgelser har knyttet SATB1expression med epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [21,24]. For at teste, om ektopisk ekspression af SATB1 kunne inducere EMT i ikke-metastatiske tumorceller, blev den humane blærecancer-cellelinie (BIU-87) med meget lav SATB1 ekspression transficeret med pcDNA3.1-SATB1 ekspressionsplasmider til at etablere en stabil SATB1-overudtrykkende cellelinje som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne af real-time RT-PCR og western blotting viste, at SATB1 mRNA og protein niveauer af transficeret gruppe steget betydeligt i forhold til den transficerede gruppe og kontrolgruppen vektor-transficerede gruppe (figur 3A;. ** P 0,001). Der var imidlertid ingen bemærkelsesværdige ændringer i ekspressionen af ​​SATB1 i kontrolvektoren-transficerede gruppe og transficerede gruppe (P 0,05). Lignende resultater kunne opnås ved immunofluorescens-analyse til påvisning SATB1 (fig. 3C). Interessant fandt vi, at transfektion af BIU-87-celler forårsagede en signifikant stigning af Sneglen og Slug (mRNA og protein) og en samtidig induktion af vimentin (mRNA og protein). MRNA-niveauer af E-cadherin ekspression blev reduceret efter transfektion af pcDNA3.1-SATB1 ekspressionsplasmider (figur 4A;. P 0,05). Der var imidlertid ingen bemærkelsesværdige ændringer i ekspressionen af ​​E-cadherin-protein mellem kontrolgruppen vektoren og pcDNA3.1SATB1 gruppe (figur 4B;. P 0,05). Der var kun en tendens til reduktion i E-cadherin-protein ekspression, og den inhiberede virkning var ikke så udtalt, fordi inhiberingen kan være posttranslationel.

SATB1 ekspression af BIU-87-celler og T24-celler transficeret med pcDNA3.1-SATB1 og pGenesil2-SATB1-shRNA blev undersøgt ved QRT-PCR og western blot (A og B; ** P 0,001). Ikke-transficerede BIU-87 celler blev anvendt som kontrolgruppe. T24-celler behandlet med pGenesil2 kontrolvektor, der ikke er målrettet en specifik gen blev anvendt som kontrolgrupper. Immunofluorescens-analyse blev udført til påvisning af SATB1staining i hver celle grupper. Immunofluorescens billeder på 200 × forstørrelse (C og D). Fejl søjler indikerer sem, n = 3 eksperimenter

udtryk for Sneglen og Slug, to hæmmere af E-cadherin, og mesenkymale markør vimentin blev opreguleret efter SATB1 udtryk blev forbedret (A;. ** P 0,001). MRNA-niveauer af E-cadherin ekspression blev reduceret efter transfektion af pcDNA3.1-SATB1 ekspressionsplasmider (A; P 0,05). Der var en tendens til reduktion i E-cadherin-protein ekspression i BIU-87-celler med forøget SATB1 ekspression (B; P 0,05). Efter SATB1 udtryk blev stille med SATB1 shRNA i T24 celler, blev ekspression af Snail, Slug og mesenkymale markører vimentin nedreguleres. Ekspressionen af ​​epitelial markering, E-cadherin, blev opreguleret sammenlignet med ikke-transfekterede celler og styrevektor-transficerede celler (C og D; * P 0,05; ** P 0,001). Der var ingen bemærkelsesværdige ændringer i udtryk for ZEB1, ZEB2 og Twist, andre kendte inhibitorer af E-cadherin, i BIU-87 med forbedrede SATB1 udtryk og T24 celler med reduceret SATB1 udtryk, henholdsvis.

Men der var ingen bemærkelsesværdige ændringer i ekspressionen af ​​ZEB1, ZEB2 og Twist, der er kendt som andre hæmmere af E-cadherin, i de tre cellegrupper (P 0,05).