PLoS ONE: Gypenosides synergistisk anti-tumor effekt af 5-fluoruracil på kolorektal cancer in vitro og in vivo: en rolle for oxidativ stress-medieret DNA Skader og p53 Activation

Abstrakt

Målsætning

5-fluorouracil (5-FU) har været almindeligt anvendt som en første-line lægemiddel til kolorektal cancer (CRC) behandling, men begrænset af lægemiddelresistens og alvorlig toksicitet. De kemo-sensibilisatorer, der udbygger sin effektivitet og overvinde sin begrænsning er et presserende behov for. Gypenosides (Gyp), de vigtigste komponenter fra

Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, har vist potentiale anti-tumor ejendom med lille side-effekt. Her har vi udforsket nøje kemo-sensibilisering af Gyp at forstærke anti-tumor effekt af 5-Fu

in vitro

og

in vivo

.

Metode /vigtigste resultater

3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltertrazolium bromid tetrazolium assay og kolonidannelse test afslører, at Gyp væsentlig grad kan øge 5-Fu-forårsaget SW-480, SW- 620 og Caco2-celler levedygtighed tab. CalcuSyn analyse viser, at Gyp virker synergistisk med 5-Fu. Annexin V-PE /7-AAD-farvning indikerer 5-Fu + Gyp kunne inducere SW-480 celle apoptose. De aktiveringer af caspase 3, blev caspase 9 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) er involveret i processen. Gyp viste sig også at opregulere 5-Fu-forårsaget phospho-p53-ekspression og således forøge 5-FU-induceret G0 /G1 fasen. Gyp forhøjede intracellulære ROS niveau, væsentligt forbedret 5-Fu-udløst DNA beskadigelse respons som påvist ved flowcytometri, comet assay og ekspressionen af ​​Ser139-histon H2A.X. Inhibering af ROS og p53 vendes henholdsvis celledød induceret af 5-FU + Gyp, tyder de centrale roller ROS og p53 i processen. Desuden 5-FU og Gyp i kombination udviser meget overlegen tumorvolumen og vægt inhibering på CT-26 xenograft musemodel sammenlignet med 5-FU eller Gyp alene. Immunhistokemi analyse tyder det kombinationer stærkt undertrykt tumor spredning. Foreløbige toksikologiske resultater viser, at 5-Fu + Gyp behandling er forholdsvis sikker.

Konklusioner

Som en potentiel kemo-sensibiliserende, Gyp viser en pragtfuld synergistisk effekt med 5-Fu til at hæmme kræft celledeling og tumorvækst. Ved at bruge 5-Fu og Gyp i kombination ville være en lovende terapeutisk strategi for CRC behandling

Henvisning:. Kong L, Wang X, Zhang K, Yuan W, Yang Q, Fan J, et al. (2015) Gypenosides synergistisk anti-tumor effekt af 5-fluoruracil på kolorektal cancer in vitro og in vivo: en rolle for oxidativ stress-medieret DNA Skader og p53 Aktivering. PLoS ONE 10 (9): e0137888. doi: 10,1371 /journal.pone.0137888

Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, KINA

Modtaget: 27. juni, 2015; Accepteret: August 24, 2015; Udgivet: 14 September, 2015

Copyright: © 2015 Kong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige ondartet kræft og den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, at der tegner sig for omkring 1,2 millioner nye tilfælde og 600 000 dødsfald om året [1]. Kirurgisk resektion, efterfulgt af kemo- eller strålebehandling, er den eneste etablerede helbredende behandling for CRC, men begrænset af lægemiddelresistens og alvorlig toksicitet [2].

5-fluorouracil (5-FU), en analog af uracil , er den mest udbredte kemoterapeutisk lægemiddel til behandling af faste tumorer, især for colorectal cancer [3]. I tumorceller, er 5-Fu omdannet til fluordeoxyuridin monophosphat (FdUMP) til at udøve sin cytotoksiske virkning. FdUMP kan mis-inkorporere i DNA eller RNA, inhiberer aktiviteter af thymidylatsynthetase (TS), i sidste ende medføre celle apoptose [4]. Ikke desto mindre er den generelle responsrate med 5-Fu monoterapi som førstevalg til behandling af CRC ret begrænset (approximately10-20%) [5]. Yderligere øget dosering ville producere lægemiddelresistens og uundgåelige bivirkninger begrænser således sin terapeutiske virkning. For nylig, kombination eller flere komponenter (snarere end monoterapi) terapi, hvor to eller flere slags lægemidler anvendes samtidigt, er en bevist behandling for cancer [6,7]. 5-Fu kombineret med nye cytotoksiske lægemidler såsom oxaliplatin, resveratrol og irinotecan har ikke blot forbedret responsrater til 40-50%, men også reduceret den uønskede reaktion af disse lægemidler [8-10], hvilket tyder på, at 5-Fu har en favorabel sikkerhedsprofil, og kan være egnet til kombinationsbehandling med andre lægemidler. På trods af disse forbedringer, er der et akut behov for nye terapeutiske strategier og nye kemo-sensibilisatorer.

Gypenosides (Gyp), de store komponenter uddrag fra

Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, eksisterer primært som dammarane -type triterpenglycosider (fig 1A) og har været anvendt som en traditionel populær folkemedicin i Asien i århundreder til behandling af cancer [11-13], hyperlipoproteinæmi [14], hepatitis [15], og kardiovaskulær sygdom [16]. Eksperimentel undersøgelse har rapporteret, at Gyp kan udløse apoptose i human colorectal cancer 205 celler gennem mitokondrier-afhængige vej og aktivering af caspase-3 [17]. Vores tidligere undersøgelser tyder også på, at Gyp hæmmede menneske kolorektal cancer SW-480 og SW-620 celler proliferation og migration i en dosis- og tidsafhængig måde [18,19]. På trods af disse kræfter, Gyp var relativt mindre giftige for humane normale celler [20], der viser potentiel anvendelse i behandlingen af ​​kræft. Men der er ikke nogen information om kemo-sensibilisering virkning Gyp indtil nu. Og hvorvidt Gyp kan blive en god kemo-sensibilisator til at forstærke effektiviteten af ​​kemoterapi i klinikken er ikke klart. I den foreliggende undersøgelse udnytter vi den humane kolorektal cancer SW-480, SW-620, Caco2-celler og CT-26 xenograft musemodel at undersøge mulighederne for kemo-sensibilisering virkning Gyp at potensere den anti-tumor effekt af 5-Fu

In vitro

in vivo

. Så vidt vi ved, er nærværende undersøgelse er den første

in vitro

in vivo

præklinisk forskning, der vurderer kemo-overfølsomhed effekt af Gyp og anti-tumor effekt af at bruge 5 -Fu og Gyp i kombination. Disse resultater kan give en ny terapeutisk strategi til at opnå anti-cancer synergisme.

(A) Kemisk dammarane skelet struktur Gypenosides. (B) Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assay på 48 timer efter 5-FU behandling i SW-480, SW-620 og Caco2-celler. (C-F) Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assay efter 24 og 48 timer efter 5-FU og /eller Gyp behandling i SW-480, SW-620 og Caco2-celler. Kombination (CI) blev analyseret under anvendelse CalcuSyn software. CI 1 indikerer en synergistisk virkning. (G) Kolonidannelse af SW-480 og Caco2-celler efter 5-FU og /eller Gyp behandling. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre eksemplarer og

s

* 0,05,

s

** 0,01 versus kontrol;

s

##

0,01 versus 5-Fu eller Gyp alene gruppen.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Gypenosides (Gyp) er venligst leveret af Ankang Pharmaceutical Institute for Beijing University (Shaanxi, Kina) og opløst i 80% ethanol (EtOH) til en endelig opbevaring koncentration på 100 mg /ml. 5-fluorouracil (5-FU) blev købt fra Sigam-Aldrich (St. Louis, Mo, USA) og opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) også til en endelig opbevaring koncentration på 100 mg /ml. Gyp og 5-Fu-opløsning blev steriliseret gennem 0,22 um filter til anvendelse i efterfølgende eksperimenter og opbevaret i -20 ° C.

3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltertrazolium bromid tetrazolium (MTT), Hoechst 33342, propidiumiodid (PI), RNase A, N-acetylcystein (NAC), og pifithrin-α blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Guava nexin Reagens blev opnået fra Millipore Corporation (Billerica, MA, USA). 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (DCFH-DA) var fra Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, USA). Den aspartataminotransferase (AST), alaninaminotransferase (ALT), blod urea nitrogen (BUN), og serumkreatinin (Cr) assay kit blev leveret af Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina).

Cellelinjer

den menneskelige kolorektal cancer SW-480, SW-620, Caco2 celler og humant normalt navlestrengen vene endotelceller HUVEC blev opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Celler blev dyrket i RPMI-1640, L-15-medium (Sigam-Aldrich) eller Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Gibco, Life Technologies, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone, USA), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 1 mM glutamin. Kulturer blev holdt ved 37 ° C med fugtighed og 5% CO

2.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse MTT-assay og kolonidannelse test. For MTT-assay, celler (1 x 10

5 celler /ml) blev podet i plader med 96 brønde (Corning Inc., NY, USA) natten over og eksponering for 5-FU (1, 5, 10, 50, 100 , 300 ug /ml), Gyp (70, 85, 100 ug /ml) eller 5-FU + Gyp i 24 og 48 timer (kontrol opløsningsmiddel eksponering til 80% ethanol og DMSO samtidigt). Efter behandling blev cellelevedygtigheden bestemt ved tilsætning af 10 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS) til hver brønd efterfulgt af inkubation i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO

2. MTT Blandingen blev fjernet, og 150 pi DMSO blev tilsat til hver brønd. Prøver blev omrørt på et rysteapparat i 15 minutter, og absorbansen ved 570 nm blev registreret ved anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Tek, ELX800, USA). Cellelevedygtighed blev beregnet som følger:. (1-gennemsnit absorbans af behandlet gruppe /gennemsnitlig absorbans kontrolgruppe) x 100%

Kolonidannelse test blev udført for at vurdere den langsigtede proliferativ potentiale SW-480 eller Caco2-celler efter 5-FU og /eller Gyp behandling. Celler blev podet i 6-brønds plader ved en densitet på 1000 celler /brønd og dyrket i 7-10 dage ved 37 ° C med 5% CO

2. Mediet blev skiftet hver 3. dag, indtil synlige kolonier dannet. Derefter kolonierne blev fikseret med 4% paraformaldehyd ved 4 ° C i 15 minutter og farves med Giemsa i 30 minutter. Prøverne blev vasket med PBS og tørret ved stuetemperatur. Antallet af farvede kolonier, som indeholdt 50 celler blev manuelt talt. Proliferation potentiale blev beregnet som følger:. Relative kolonidannelse rate (%) = antal kolonier i behandlingsgruppen /antal kolonier i kontrolgruppen × 100%

Vurdering for kombinationsindeks

efter detektion enkelt og kombination inhiberende virkninger af 5-FU og Gyp, kombinationen index (CI) blev beregnet ifølge fremgangsmåden af ​​Chou og Talalay [21] ved brug CalcuSyn software program (Biosoft, Cambridge, UK). Værdien af ​​CI er et kvantitativt mål for graden af ​​interaktion mellem stoffer. CI 1, angiver synergisme, CI = 1, betegner additive virkninger; CI 1, betegner antagonisme.

Bestemmelse af celleapoptose

Cell apoptose blev påvist under anvendelse Guava nexin assay som anvender Annexin V-PE til påvisning af phosphatidylserin på den ydre membran af apoptotiske celler [22] . SW-480-celler (2 x 10

5 celler /ml) blev podet i 24-brønds plader og behandlet med 5-FU og /eller Gyp i 24 timer, derefter blev cellerne høstet og vasket med PBS. Efter at 100 pi celler af hver prøve blev suspenderet i en blanding af 100 pi Annexin V-PE og 7-AAD bindingsbuffer, inkuberet ved 37 ° C i 20 minutter i mørke og underkastes flowcytometrianalyse (Millipore, USA) straks . Histogrammer blev analyseret ved anvendelse FCS Express V3 software.

Hoechst 33342-farvning

Hoechst 33342-farvning blev anvendt til at bekræfte ændringerne af kerner morfologi SW-480-celler efter 5-FU, Gyp eller 5- fu + Gyp behandling. Kort beskrevet efter inkubation i 24 og 48 timer blev celler farvet med 10 mM Hoechst 33342 ved 37 ° C i mørke i 15 minutter, derefter vasket tre gange med PBS og iagttaget under anvendelse af en fluorescens mikroskopi med standard excitationsfiltre (Nikon, Japan) .

Cell cyklus analyse

SW-480-celler blev podet i 24-brønds plader og udsættelse for 5-Fu, Gyp eller 5-Fu + Gyp for 24 og 48 timer. Så de behandlede celler blev høstet og anbragt som følgende trin: vasket to gange med kold PBS, fikseret med 70% iskold ethanol ved -20 ° C natten over, vasket to gange med kold PBS, inkuberet med 100 mg /ml RNase A i 30 min ved 37 ° C, efter at farvet med 50 mg /ml PI i mørke i 30 minutter og udsat for flowcytometrianalyse. For hvert eksperiment blev 5000 celler registreret. De opnåede resultater blev analyseret af Cell Quest-software.

Vurdering af DNA-skader Salg

PI interkalerer i DNA og størrelsen af ​​DNA-fragmenter vises som en hypoploid DNA histogram [23]. Celler i plader med 24 brønde blev behandlet med 5-FU, Gyp eller 5-FU + Gyp i 24 og 48 timer, derefter farvet med 5 pg /ml PI, permeabiliseret ved frysetørring kaste og underkastet flowcytometrianalyse. Histogrammer blev analyseret ved anvendelse FCS Express V3 software.

Comet assay en følsom og hurtig teknik til påvisning af DNA-skader i individuelle celler, blev udført som tidligere beskrevet [24].

Måling af intracellulær ROS produktion

ændringen af ​​intracellulær ROS niveau blev målt ved anvendelse af oxidativ omdannelse af den følsomme fluorescerende probe 2 ‘, 7′-dichlorfluorescein-diacetat (DCFH-DA) til fluorescerende 2′, 7’-dichlorfluorescein (DCF ). DCFH-DA let diffunderer gennem cellemembranen og hydrolyseres enzymatisk af intracellulære esteraser til dannelse af ikke-fluorescerende DCFH, som derefter hurtigt oxideres til dannelse stærkt fluorescerende DCF i nærvær af ROS, og fluorescensintensiteten er proportional med ROS-produktion. Celler blev inkuberet med 5-FU, Gyp eller 5-FU + Gyp for 6 og 12 timer, derefter farvet med 10 pM DCFH-DA ved 37 ° C i mørke i 30 min. Efter vask med PBS tre gange blev cellerne ses under et fluorescensmikroskop, straks (Nikon, Japan).

NAC (5 mM) blev anvendt som en ROS scavenger tilsættes til dyrkningsmediet samtidig med 5-FU og /eller Gyp tilføjer. The ROS-generering, DNA skader og celle apoptose blev analyseret som beskrevet ovenfor.

Pifithrin-α (10 uM) blev anvendt som en inhibitor af p53 til at mindske ekspressionen af ​​p53 til dyrkningsmediet, når cellerne blev inkuberet med 5 -Fu og /eller Gyp. cellelevedygtighed, ROS-generering og DNA-skader den blev analyseret som beskrevet ovenfor.

Western blotting-analyse

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [25]. Proteiner (60 ug) blev elektroforesebehandlet på 5-13,5% polyacrylamidgeler, og gelerne blev overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, MA, USA), som blev inkuberet med relevante antistoffer. Følgende antistoffer blev anvendt: Phospho-p53 (Ser15), Phospho-cdk2 (Thr160), caspase 3, caspase 9, Bcl-2, Ser139-histon H2A.X, spaltes-PARP, β-actin (Cell Signaling Technology, Danvers , MA, USA) og cyclin E (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Den β-actin-ekspression blev anvendt som reference band. Proteinet udtryk sats blev kvantificeret ved Mængde One-software.

xenograft tumor model

De murine kolorektal cancer CT-26 celler blev opnået fra Cell Resource Center, Institut for Basic Medical Science (Beijing, Kina), og tilstanden af ​​kulturen var samme med SW-480-celler. De BALB /c mus (kvindelig, 18-20 g kropsvægt) blev leveret af Experimental Animal Center den fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina). De blev anbragt i en airconditionerede værelse ved 23 ± 2 ° C, med fri adgang til mad og vand og blev holdt i en 12 timers lys-mørke cyklus. Efter at være blevet fodret i vores anlæg i 1 uge, forventer tre mus blev anvendt som normale kontrol blev alle andre inokuleret med 0,1 ml af CT-26-celler (1 x 10

7 celler /ml) i den venstre oxter regionen og tilfældigt opdelt i 6 grupper med 6-8 dyr i hver gruppe. Behandling indledt dagen efter CT-26 celler implantation (dag 1). Gruppe I fik omvendt osmose vand via maveskylning dagligt og regelmæssig saltvand via intraperitonealt injiceret hver anden dag som kontrolgruppen; Gruppe II blev injiceret med 5 mg /kg 5-Fu intraperitonealt hver anden dag; Gruppe III fik 25 mg /kg Gyp via ventrikelskylning hver dag; Gruppe IV blev givet 50 mg /kg Gyp via gastrisk lavage hver dag; Gruppe V fik 5 mg /ml 5-Fu + 25 mg /ml Gyp og gruppe VI fik 5 mg /kg 5-Fu + 50 mg /kg Gyp. De lange (a) og korte (b) diameter på tumorerne blev målt ved anvendelse skydelære hver dag efter dag 6 for beregnet tumorvolumen som formlen: ab

2/2. Kropsvægten blev også målt.

Mus blev observeret dagligt for kliniske tegn og aflivet den nittende. Tumorprøver blev vejet og fikseret med 10% formalin i mindst 24 timer, indlejret med paraffin, farves derefter ved hæmatoxylin-eosin-farvning og immunhistokemi. Inhiberingen blev beregnet som følger: (1- gennemsnitlig tumor vægt af den behandlede gruppe /gennemsnitlig tumor vægt af kontrolgruppe) x 100%. I mellemtiden blev milten skåret ud og vejet for beregnet milten indekser som følger: milt vægt /kropsvægt x 100%. Niveauerne af AST, ALT, BUN og Cr i serum blev også påvist.

Forsøg med mus blev udført i overensstemmelse med National Institute of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af universitetets Institutional Animal Care og brug Udvalg Shaanxi Normal University (Xi’an, Kina).

Immunhistokemi assay

Immunhistokemi blev udført på 7 um sektioner af paraffinindlejrede prøver vha monoklonalt anti-PCNA antistof (Abcam, Cambridge, UK). Kort fortalt, efter afparaffinering og hydratisering blev sektionerne behandlet med varme-medieret antigen-genvinding ved anvendelse af 10 mM citratpuffer (pH 6,0) i 15 minutter og permeabiliserede med 0,2% Triton X-100 i 15 min. Så den endogene peroxidaseaktivitet blev standset med 3% hydrogenperoxid-opløsning i 10 minutter. Ikke-specifik binding blev forhindret ved inkubering med 5% normalt gedeserum i 15 min. Efter dette blev sektionerne inkuberet med anti-PCNA-antistof (1: 8000 fortyndinger) natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Antistofbinding blev påvist under anvendelse peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof ved 37 ° C i 30 minutter. Derefter snit blev visualiseret ved diaminobenzidin opløsning, modfarvet let med hematoxylin, dehydreret med ethanol og observeret ved anvendelse af lysmikroskopi (Nikon, Japan).

Statistisk analyse

SPSS 16.0 software (SPSS Inc., Chicago ) blev anvendt til statistisk analyse. Værdier er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD) af tre prøver opnået fra tre uafhængige forsøg. Statistiske sammenligninger blev foretaget ved hjælp af envejs variansanalyse (ANOVA),

s

* 0,05 blev betragtet som signifikant forskel,

s

** 0,01 og

s

##

0,01 blev anset for at være yderst signifikant forskel.

Resultater Salg

Gyp synergistisk potenserer 5-Fu-induceret cellelevedygtighed inhibering

Fig 1B viser cytotoksiciteten af ​​5-FU på SW -480, SW-620 og Caco2 celler til behandling 48 timer hhv. Caco2-celler udføres mere følsomme end SW-480 og SW-620 celler til 5-Fu behandling (IC50 blev beregnet som 31,75 ug /ml for Caco2 og 257,23, 366.40 ug /ml for SW-480, SW-620 celler). Når koncentrationen overstiger 50 ug /ml, SW-480 og SW-620 celle show noget modstand mod 5-Fu behandling. Imidlertid Gyp inhiberede SW-480, SW-620 og Caco2 celleproliferation i en dosis- og tidsafhængig måde (IC50 blev beregnet som 99.59, 107,53 og 112,22 pg /ml for SW-480, SW-620 og Caco2-celler efter inkubation i 24 timer, fig 1C-1E). Når co-behandlede celler med Gyp (70, 85, 100 ug /ml) og 5-Fu (5, 10 ug /ml) samtidigt, den kombinerede behandling selv i lave doser viste meget højere antiproliferativ aktiviteter på SW-480 , SW-620 og Caco2 celler end det enkelt behandling. For eksempel behandling af SW-480 celler med 5 ug /ml 5-Fu eller 70 ug /m Gyp alene i 24 timer hæmmede levedygtighed celle ved 14,6 ± 2,67% (

s

˂ 0.05

vs

kontrol) og 13,8 ± 2,80% (

s

˂ 0.05

vs

kontrol), hhv. Ikke desto mindre, behandling af SW-480 celler med 5 ug /ml 5-Fu + 70 ug /m Gyp i 24 timer signifikant hæmmede celle levedygtighed ved 53,29 ± 1,02% (

s

˂ 0.01

vs

kontrol og 5-Fu alene). Når inkubationstiden blev forøget til 48 timer, den cellelevedygtigheden inhibering af 5 ug /ml 5-Fu var 32.37 ± 3,22% (

s

˂ 0.01

vs

kontrol), 70 ug /ml Gyp var 24,87 ± 1,83% (

s

˂ 0.01

vs

kontrol), 5 ug /ml 5-Fu + 70 ug /m Gyp var 72,11 ± 1,53% (

s

˂ 0.01

vs

kontrol og 5-Fu alene).

for yderligere at validere den synergistiske træk ved 5-Fu og Gyp, de cellernes levedygtighed hæmning virkninger af det indre og kombineret behandling blev analyseret under anvendelse CalcuSyn software. CI værdi for 5-Fu + Gyp behandling SW-480 celler var 0,68 ± 0,05, SW-620 celler var 0,65 ± 0,10 og Caco2 celler var 0,72 ± 0,07 under de anvendte doser (Fig 1C-1E). For SW-480-celler, kombinationen af ​​5-FU (5 ug /ml) og Gyp (70 ug /ml) udviste den bedste synergistisk inhibering kapacitet (de Cl-værdier var 0,63 og 0,68 for 24 og 48 timer), som blev udvalgt for yderligere mekanistiske undersøgelser. Desuden 5-FU og Gyp i kombination udviste meget svagere toksicitet mod humant normalt navlevene endotelcelle HUVEC (figur 1F).

Kolonidannelse test blev udført for yderligere at vurdere det proliferative potentiale af SW-480 og Caco2-celler efter 5-FU og /eller Gyp behandling. Fig 1G viste, at 5-Fu, Gyp, 5-Fu + Gyp alle inhiberer langsigtet proliferativ potentiale SW-480 eller Caco2-celler, i sammenligning med ubehandlede gruppe (

s Restaurant 0,01 vs kontrol), og den mest betydningsfulde ene med færre koloner dannelse blev observeret i 5-Fu + Gyp gruppe (

s

0,01 vs 5-Fu eller Gyp alene).

Apoptotisk respons udløst af 5- Fu og /eller Gyp

Som vist i fig 2A, i ubehandlet kontrol 93,35 ± 0,84% var levedygtige, 0,2 ± 0,06% cellepopulation var i den tidlige fase af apoptose (nederst til højre) og 2,75 ± 1,32% cellepopulation var i den sene fase af apoptose (øverst til højre). I 5-Fu behandlingsgruppen, den apoptotiske celle populationen (nederst til højre og øverst til højre) var 3,65 ± 0,81%. I Gyp behandlingsgruppen, 20,6 ± 1,63% celler var i den fase af apoptose (

s

0,01

vs

kontrol). Mens der i den 5-Fu + Gyp gruppe, 42,15 ± 0,67% celler var i apoptotiske fase (

s

0,01

vs

kontrol og 5-Fu alene).

(A) Cell apoptose blev påvist ved Annexin V-PE /7-AAD-assay efter 5-FU og /eller Gyp behandling i 24 timer i SW-480-celler. (B) Ekspressionsniveauet af caspase 3, caspase 9, Bcl-2 og spaltes-PARP i SW-480-celler blev detekteret ved western blotting. (C) Nuclear kondensering og cellemorfologi ændring i SW-480-celler efter 5-FU co-behandlet med Gyp blev observeret ved anvendelse af Hoechst 33342-farvning. Eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt pr eksperimentelt punkt, og repræsentative resultater blev vist. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre eksemplarer og

s

* 0,05,

s

** 0,01 versus kontrol.

Western blotting blev udført for at analyse den potentielle mekanisme arbejdede i 5-Fu og Gyp udløste apoptose. Som vist i figur 2B, 5-Fu + Gyp stærkt forbedret caspase 3, caspase 9 og PARP-spaltning og ned-reguleres ekspressionen af ​​anti-apoptotiske protein Bcl-2 i SW-480-celler (

s Restaurant 0.01 eller

s

0,05

vs

kontrol)

Morfologiske forandringer som følge af 5-Fu og Gyp på SW-480 celler

fig 2C. viser de morfologiske ændringer efter 5-FU og /eller Gyp behandling, der bruger Hoechst 33342-farvning. Svagt blå og homogene celler blev observeret i kontrolgruppen; 5-Fu eller Gyp behandlede celler viste svag forbedring af Hoechst 33342 farvning; mens der i 5-Fu + Gyp gruppe, celler udøvede bemærkelsesværdigt ændringer: kondenseret kromatin, fragmenteret punktformig blå nukleare fluorescens. Desuden afslørede fase billeder, celler i 5-Fu + Gyp behandlingsgruppen var skrumpet til unormal runde type, og celletal blev også reduceret tydeligt.

Effekter af 5-Fu og /eller Gyp på celle cyklus fordeling

Flowcytometri analysere i fig 3A viser, at sammenlignet med kontrol (G0 /G1-fasen, 33,8 ± 1,06%; S-fasen, 28,25 ± 0,59%, og G2 /M-fasen, 37,94 ± 0,65 %), var der en ophobning af celle population i G0 /G1-fasen (51,56 ± 1,08%,

s

0,01

vs

kontrol) og S-fasen (36,6 ± 0,91% ,

s

˂ 0.05

vs

kontrol) efter 5-Fu behandling. Gyp inducerede en ophobning af celle population i G0 /G1-fasen (45,97 ± 1,06%,

s

0,01

vs

kontrol). I 5-Fu + Gyp behandlingsgruppen, var der flere celler i G0 /G1-fasen (56,58 ± 0,57%,

s

0,01

vs

kontrol) og S-fasen (38,78 ± 0,46%,

s

0,05

vs

kontrol). En lignende tendens blev også fundet efter 5-Fu, Gyp eller 5-Fu + Gyp behandling i 48 timer.

(A) Cell cyklus fordeling efter 5-Fu og Gyp behandling. (B) Ekspression af phospho-p53, phospho-cdk2 og cyclin E efter 5-FU og /eller Gyp behandling i SW-480-celler blev detekteret ved western blotting. Eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt pr eksperimentelt punkt, og repræsentative resultater blev vist. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre eksemplarer og

s

* 0,05,

s

** 0,01 versus kontrol.

Ekspressionen af ​​phospho-p53, phospho-cdk2 og cyclin E i SW-480-celler efter 5-FU og /eller Gyp behandling blev påvist ved western blotting. Som vist i figur 3B, 5-Fu + Gyp bemærkelsesværdigt forøgede ekspressionen af ​​phospho-p53, men faldt ekspressionen af ​​cyclin E og phospho-cdk2 (

s Restaurant 0,01 eller

s

0,05

vs

kontrol) efter 24 og 48 timer inkubation

DNA skade responset induceret af 5-Fu, Gyp og 5-Fu + Gyp

som beskrevet i. metoderne, flowcytometri-analyse blev udført for at undersøge effekten af ​​5-FU + Gyp behandling på DNA fragmentation i SW-480-celler. Fig 4A viser, at niveauet af DNA fragmentation i kontrolgruppen var 4,66 ± 1,55%. Efter at være blevet behandlet med 5-Fu, Gyp eller 5-FU + Gyp i 24 timer, var der en stigende tendens (8,2 ± 0,48%, 15,4 ± 2,74%, og 45,15 ± 1,63%, henholdsvis) på DNA fragmentation niveauer. Graden af ​​DNA fragmentation i 5-Fu + Gyp behandlede gruppe var signifikant øget (

s

0,01

vs

kontrol og 5-Fu alene). Et lignende fænomen blev fundet efter 48 timers inkubering og DNA-fragmentering blev forøget til 64,65 ± 3,62% (

s Restaurant 0,01

vs

kontrol og 5-Fu alene) efter 5-FU + Gyp behandling, når DNA-fragmentering i kontrol, 5-Fu, og Gyp alene gruppen var 4,2 ± 0,81%, 20,85 ± 2,70% og 24,80 ± 1,96%, hhv.

(A) DNA-fragmentering blev detekteret ved anvendelse flow cytometri efter 5-Fu, Gyp og 5-Fu + Gyp behandling i SW-480 celler efter 24 og 48 timer. Histogrammer viste antal celle kanaler (vertikal akse) vs. PI-fluorescens (vandret akse). (B) Comet assay blev udført til påvisning af DNA-skader efter 5-FU co-behandlet med Gyp. (C) Ekspressionsniveauet af Ser139-histon H2A.X blev bestemt under anvendelse western blotting. Eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt pr eksperimentelt punkt, og repræsentative resultater blev vist. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre eksemplarer og

s

* 0,05,

s

** 0,01 versus kontrol;

s

##

0,01 versus 5-Fu eller Gyp alene gruppen.

Comet assay og udtryk for γH2A.X blev udført for yderligere at verificere, at DNA-skader blev forværret af 5-Fu kombineret med Gyp. Figur 4B viser, at 5-Fu, Gyp og 5-Fu + Gyp alle induceret varierende grader af DNA-skader i sammenligning med ubehandlede kontrolgruppe, og den mest betydningsfulde ene med flere celler produceret en stor hale af kometen blev observeret i 5-Fu + Gyp gruppe. Figur 4C viser, at 5-Fu kombineret med Gyp forværret phosphorylering af γH2A.X.

ROS akkumulering efter 5-Fu + Gyp behandling

Intracellulær ROS blev opdaget af DCFH-DA farvning ved 6 og 12 timer efter forskellige behandlinger. Som fig 5A illustreret, sammenlignet med kontrolceller i 5-FU + Gyp gruppen viste stærk DCF fluorescens ved 6 og 12 timer efter behandling, celle i Gyp gruppen viste nogle synlige DCF fluorescens ved 6 timer og lidt forbedret i 12 timer, mens ingen indlysende fluorescens blev observeret i 5-FU alene gruppen. For yderligere at validere rolle ROS i antitumorvirkningen af ​​5-FU + Gyp blev NAC hvormed mindske ROS niveau, så DNA-skader og celle apoptose blev analyseret. Resultaterne viste, at NAC samtidig behandling effektiv undertrykt det intracellulære ROS produktion med DCF fluorescens forsvundet (fig 5B). DNA skader forårsaget af 5-Fu + Gyp behandling blev delvist reddet af NAC (

s

0,01

vs

kontrol, Fig 5C). 5-Fu + Gyp forårsagede celle apoptose var også signifikant forhindret af NAC (

s

0,01

vs

kontrol, Fig 5D).

(A) Intracellulær ROS produktion efter 5-FU og /eller Gyp behandling blev påvist under anvendelse DCFH-DA-farvning. (B-D) Intracellulær ROS produktion, DNA-fragmentering og celle apoptose i SW-480-celler blev målt efter tilsat NAC til dyrkningsmediet samtidig med 5-FU og Gyp. Eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt pr eksperimentelt punkt, og repræsentative resultater blev vist. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre eksemplarer og

s

** 0,01 versus kontrol;

s

##

0,01 versus 5-Fu + Gyp gruppe.

Rolle p53 i 5-Fu + Gyp behandling

Den overdrevne produktion af ROS kan skade DNA og provokere p53 aktivitet til at inducere cellecyklus anholdelse og apoptose [26,27]. Vores resultater fundet p53 phosphorylering blev øget markant efter 5-Fu + Gyp behandling (Fig 3B). For yderligere at undersøge rollen af ​​p53 i 5-Fu co-behandlet med Gyp-induceret apoptose, pifithrin-α, en inhibitor af p53, blev tilsat for at formindske ekspression af p53, og derefter intracellulære ROS niveau, DNA-skader og cellelevedygtigheden var opdaget. Fig 6A viser, at pifithrin-α bemærkelsesværdigt vendt 5-Fu + Gyp-induceret celledød i SW-480-celler med cellelevedygtigheden blev forøget fra 47.49 ± 2,1% til 79,22 ± 0,63% (

s Restaurant 0.01

vs

kontrol). Men samtidig behandling med pifithrin-α ikke påvirke den intracellulære ROS ophobning og alvorlig DNA-skade forårsaget af 5-FU + Gyp behandling (Fig 6B og 6C).

(A) Cellelevedygtighed, (B) intracellulær ROS produktion og (C) DNA-skader blev påvist efter tilsat pifithrin-α til dyrkningsmediet samtidig med 5-FU plus Gyp. Eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt pr eksperimentelt punkt, og repræsentative resultater blev vist. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SD af tre eksemplarer og

s

** 0,01 versus kontrol;

s

##