PLoS ONE: Genetisk modifikation af kræftceller ved hjælp af ikke-Viral, Episomale S /MAR vektorer for In Vivo Tumor Modelling

Abstrakt

Udviklingen af ​​genetisk mærkede dyr tumorxenoplantater er et område af igangværende forskning for at muliggøre lettere og mere pålidelig test af behandlinger mod kræft. Genetisk mærket tumormodeller har en række fordele i forhold til konventionelle tumormodeller, herunder let langsgående overvågning af terapier og den reducerede antal dyr, der er nødvendige for forsøg. Adskillige forskellige metoder er blevet anvendt i tidligere undersøgelser at markere tumorer genetisk, men alle har begrænsninger, såsom genotoksicitet og andre artefakter i forbindelse med brugen af ​​integrere virale vektorer. For nylig har vi skabt en episomalt opretholdt plasmid-DNA (pDNA) ekspressionssystem baseret på Scaffold /Matrix Attachment Region (S /MAR), der tillader langvarig luciferase transgenekspression i muselever. Her beskriver vi en yderligere brug af denne pDNA-vektor med den humane Ubiquitin C promotor for at skabe stabilt transficeret human hepatom (Huh7) og human pancreascarcinom (MIA-PaCa2) cellelinier, der blev leveret til “immune deficiente” mus og overvåges på langs over gang anvendes bioluminometer. Begge cellelinier afslørede vedvarende episomale langsigtet luciferaseekspression og dannelse af en tumor, der viser de patologiske egenskaber ved hepatocellulært carcinom (HCC) og pankreatisk carcinom (PaCa) hhv. Dette er den første demonstration af, at en pDNA-vektor kan bibringe langvarig episomal luciferase transgen ekspression i forskellige musetumormodeller og kan således let anvendes til at følge tumordannelse uden at interferere med cellulære genom

Henvisning:. Argyros O, Wong SP, Gowers K, Harbottle RP (2012) genetisk modificering af kræftceller ved hjælp af ikke-Viral, Episomale S /MAR vektorer for

In Vivo

Tumor Modelling. PLoS ONE 7 (10): e47920. doi: 10,1371 /journal.pone.0047920

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: Juni 17, 2011; Accepteret: September 20, 2012; Udgivet: 26 oktober, 2012 |

Copyright: © 2012 Argyros et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af Myrovlytis Trust. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en af ​​de største sundhedsrisici i hele verden. Derfor er der et stigende behov for at udvikle nye lægemidler og nye fremskridt inden for dyr tumor modellering. Men på trods af store fremskridt på dette område, udvikling af klinisk relevante dyremodeller, der tillader hurtig og følsom overvågning af tidlig tumorvækst og efterfølgende metastaser er stadig, en løbende udfordring [1].

Mange konventionelle dyr tumormodeller anvendes til udvikling af behandlinger mod kræft involverer injektion af humane tumorceller i immunkompromitterede mus [2], [3] efterfulgt af standard kaliber målinger til vurdering tumorstørrelse, sædvanligvis som et slutpunkt måling, efter at dyret er blevet aflivet. Disse modeller er temmelig begrænset og forskning har været i gang med at udvikle en genetisk markant tumor, der ville gøre det muligt for ikke-invasiv overvågning af tumor parametre af

in vivo

imaging baseret på lys emission fra luciferase-udtrykkende celler eller fluorescens fra GFP-udtrykkende celler [1]. Anvendelsen af ​​genetisk mærket tumorceller i et dyr cancer model har en række fordele. Primært, det tillader en at overvåge effektiviteten af ​​terapeutiske interventioner som lægemiddel, gen eller celleterapi lettere end med konventionelle modeller. Det letter sporing af tumor parametre, såsom størrelse og udvikling, samt giver yderst følsomme visualisering af tidlig metastase og evalueringen af ​​minimal residual sygdom efter terapi [4]. Den tillader også anvendelsen af ​​sekventielle målinger til at følge tumorstørrelse under behandling, så der kan udføres langsgående undersøgelser for at analysere virkningerne af behandlinger over tid giver mere pålidelige oplysninger og reduktion af antallet af forsøgsdyr [5].

i tidligere undersøgelser, har en række forskellige metoder været anvendt til at udstyre tumorceller med påviselige markører [1], [4], [6], [7], [8], [9]. Den mest effektive metode til afgivelse af gener til celler er anvendelsen af ​​vektorer afledt af modificerede virus [10]. Trods fordelene ved denne gentildelingssystem er der også væsentlige begrænsninger, primært vedrørende integration af vektoren i cellegenomet, den potentielle immunogenicitet af virale kodende gener samt tab af langvarig ekspression af reportergenet. Det ville være af stor interesse derfor at udvikle en ikke-viralt gentildelingssystem der kan mediere langvarig reportergenekspression i et dyr tumormodel. En effektiv måde at opnå dette mål er at anvende et plasmid-DNA (pDNA) ekspressionssystem, som kan opretholdes som en funktionel, episomalt enhed når den er blevet leveret til celler i tumormodel og tilbydes tilfredsstillende påviselige niveauer af markørgenekspression i hele deres levetid [11].

Forrige

in vivo

studier med pDNA vektorer har vist, at virale promotorer såsom cytomegalovirus (CMV) promotor er i stand til at levere de højeste niveauer af transgen ekspression oprindeligt [12], [13], men efterfølges med et efterfølgende fald i ekspression inden for to måneder [14]. Denne nedgang i ekspression er promotor-afhængig og sandsynligvis være resultatet af transkriptionel inaktivering af promotoren [15]. Faktisk har CpG methylering af CMV-promotoren i forskellige plasmidvektorer vist sig at have en negativ effekt på transgen ekspression både

in vitro

in vivo

[11], [16], [ ,,,0],17].

for nylig har vi og andre har vist, at en pDNA-vektor omfattende en kombination af en mammal, vævsspecifik promotor med en nuklear scaffold /matrix-tilhæftning-region (S /MAR) element kan fremme langsigtet episomalt udtryk

in vitro

in vivo

[11], [18], [19], [20], [21]. S /MAR element udgør et konkret forbindelse af vektoren med den nukleare matrix via platform-tilhæftning faktor-A (SAF-A), tøjring vektoren til kromosomet stillads under mitose og bringe plasmidet i tæt kontakt med cellens replikation maskiner, derfor skabe mitotisk stabilitet og opretholdelse af plasmidet som en epigenetisk enhed gennem hundredvis af celledelinger [22], [23], [24], [25], [26]. S /MAR element har vist sig at have en beskyttende virkning på følsomme for methylering steder i α1-antitrypsin (AAT) lever-specifik promotor [11], men ikke har en sådan virkning på CMV-promotoren, hvilket understreger, at en pattedyr-stedet en viral promotor er mere egnet til langsigtet transgenekspression med denne vektor.

en S /MAR-indeholdende plasmid er udviklet til påføring på leveren ved udnyttelse af en lever-specifik promotor, AAT, og har vist sig at vare ved og udtrykke luciferase transgen episomalt over 6 måneder i hepatocytter [11]. I betragtning af den langsigtede ekspression af disse episomalt opretholdt plasmider, ville et S /MAR baseret vektor i kombination med en pattedyrpromotor synes at være ideel til brug som en genetisk markør for tumorceller.

plasmider indeholdende et S /MAR sekvens og en CMV-promotor er tidligere blevet transficeret i CHO [18], [23], [25], HaCat [23], HeLa [27], K562 leukæmiceller, U251 gliom [20] og primære fibroblast- [28] og er blevet vist at replikere og opretholdes som ekstra-kromosomale episomer.

den her beskrevne arbejde viser for første gang, at anvendelsen af ​​et episomalt opretholdt, pUbC-S /MAR plasmid, der medierer vedvarende luciferase transgen ekspression at generere genetisk mærkede tumorcellelinier, som giver anledning til forskellige kræftformer, når den anvendes

in vivo

. De anvendte cellelinier er et menneske hepatocellulært carcinom cellelinie Huh7, som er afledt af en patient med hepatocellulært carcinom og en human pankreatisk carcinom-cellelinje, MIA-PaCa2. Salg

Resultater

Generation af stabilt transficerede Tumor cellelinier hjælp pUbC-S /MAR Plasmid

Baseret på tidligere

in vitro

undersøgelser med anvendelse af S /MAR vektorer, vi havde til formål at anvende denne erfaring til at etablere en række forskellige stabilt transfekterede tumorcellelinier til generering af forskellige tumor modeller, som kan overvåges af

in vivo

bioluminescens imaging teknikker. Et plasmid indeholdende et S /MAR element i kombination med pattedyrs UbC promotoren (pUbC-S /MAR), driver en luciferase transgen blev anvendt i denne undersøgelse (figur 1A). Den allestedsnærværende UbC promotoren blev anvendt, således at den samme vektor kan anvendes til at styre luciferase transgen i forskellige cellelinier.

A) pUbC-S /MAR plasmid anvendt i denne undersøgelse, hvori luciferaseekspression drives af den humane UbC-promotoren. B) Huh7, og MIA-PaCa2 celler blev transficeret med pUbC-S /MAR og dyrket under selektion med G418 for omkring to uger. Tre enkelt kolonier blev isoleret og ekspanderet ud af selektion med regelmæssig billeddannelse ved hjælp af en Xenogen bioimager. C) Southern-blot af totalt DNA isoleret fra tre individuelle kolonier for hver cellelinje ved 45 dage efter transfektion. Bane 1-3: Huh7 isolerede kolonier; Banerne 4-6 MIA-PaCa2 isolerede kolonier; (+): Positiv kontrol, 10 ng bakterielt pUbC-S /MAR plasmid. D) luciferase bioluminscensassayet (i to eksemplarer) på stigende mængder af Huh7 og MIA-PaCa2 celler, som viser grænser for signal (luciferase) påvisning,

in vitro

. E-F) plasmidredning eksperimenter af tre

E. Coli

kolonier for Huh7 (bane 1-3) og fire kolonier til MIA-PaCa2 cellelinjer (bane 4-7), der viser identisk begrænsning mønster med ren pUbC -S /MAR plasmid (+), følgende begrænsning fordøje med

Spe

jeg enzym. (-) Negativ kontrol (intet DNA); M: 1 kbp stigen (Hyperladder I, Bioline)

MIA-PaCa2 og Huh7 celler blev transficeret med pUbC-S /MAR vektor og dyrket i to uger i tilstedeværelse af G418 (. 1 mg /ml). Efter denne tid celler dannede særskilte kolonier og luciferase-ekspression blev verificeret under anvendelse af en bioluminescerende imager (figur 1B, top panel). Tre individuelle transgen udtrykker kolonier for hver af de cellelinier (Huh7 og MIA-PaCa2) blev isoleret og efterfølgende dyrket uden antibiotisk selektion (figur 1B, midterste panel). Ekspression af luciferase transgen blev påvist i begge cellelinier indikerer vellykket stabil transfektion med pUbC-S /MAR plasmid. Cellerne blev yderligere dyrket i fravær af selektionstryk for anden måned (figur 1B bundpanel). 45 dage efter transfektion blev genomisk DNA ekstraheret fra alle tre kolonier af hver cellelinie for at bekræfte episomal vedligeholdelse af pDNA. En Southern blot blev udført (figur 1C), som i alle tilfælde viste et enkelt bånd med den nøjagtige størrelse af pUbC-S /MAR (8198 bps) for hvert af de kolonier af begge cellelinier. Endelig har vi udført luciferase bioluminescens-assays på stigende mængder af celler, for at tilvejebringe direkte kvantitative resultater af genekspression til sammenligning. Resultaterne er vist i figur 1D, hvor grænsen for signalet afsløring var mellem 500-5000 celler for Huh7 celler og mellem 250-2500 celler til MIA-PaCa2.

Yderligere bevis for episomal vedligeholdelse blev leveret af plasmid redning af pUbC-S /MAR fra kanamycinresistente

E. coli

bakterier efter transformation med totalt DNA fra hver af kolonier af de to cellelinier. I dette tilfælde kun intakt frit plasmid-DNA ville producere bakterielle kolonier på plader indeholdende kanamycin der er modstanden markør til stede på pUbC-S /MAR plasmid. Begrænsningen mønstre af pDNA af udvalgte kolonier var i overensstemmelse med ikke-modificerede ikke-integrerede plasmidkonstruktioner for både Huh7 og MIA-PaCa2 cellelinier (figur 1E og 1F).

stabilt transficerede Huh7 og MIA-PaCa2 Cell linjer danner Tumorer

in vivo

stadig opretholde høje niveauer af transgen ekspression 35 dage efter Injection

Celler fra hver af de to genererede stabilt transficerede cellelinjer (MIA-PaCa2 og Huh7) blev særskilt administreres af intraperitoneal injektion til grupper af mus (n = 4). Mus blev afbildet 24 timer efter injektion og luciferase-ekspression blev observeret i begge grupper af injicerede mus (figur 2A). Vi har bemærket, at alle fire mus injiceret med MIA-PaCa2 celler udtrykte luciferase hele overvågningsperioden og dannede tumorer, mens tre ud af fire mus injiceret med Huh7 celler udtrykte luciferase og en mus havde ingen indledende luciferaseekspression sandsynligvis på grund af manglende evne til celler til at etablere sig i de nye omgivelser, selv om dette er fortsat uklart. Ikke desto mindre blev den luciferase udtryk overvåges i begge grupper af mus i en samlet periode på 35 dage med ugentlig bioimaging. Bioluminescerende billeddannelse fotos af en repræsentativ mus over tid for hver cellelinje er vist i figur 2A. Niveauet af ekspression steg kraftigt 21 dage efter celle levering (figur 2C). Ingen luciferaseekspression blev påvist i kontrol ubehandlede dyr (data ikke vist), hvor baggrunden lysniveau emission var 5 × 10

5 fotoner /sek /cm

2 /sr.

A) en gruppe på fire mus for hver cellelinje blev injiceret intraperitonealt med 3 × 10

6 Huh7 eller MIA-PaCa2 celler stabilt transficeret med pUbC-S /MAR og visualiseret med tiden (fra dag ét efter injektion) til bioluminescens under anvendelse af en Xenogen bioimager efter intraperitoneale injektioner af 15 mg /ml D-luciferin, med en-minute erhvervelse tid. En repræsentativ mus for hver cellelinje er vist ved dag 7, 21 og 35. b) 35 dage efter injektion af Huh7 og MIA-PaCa2 injicerede mus blev dræbt og dissekeret for at lede efter tegn på tumorvækst. Ingen vækst var indlysende fra ekstern undersøgelse af dyret, men på at åbne det op en masse blev observeret i den peritoneale kavitet (Huh7 behandlet mus vist som et eksempel). Dyret blev afbildet for bioluminescens før og efter tumor fjernelse. Intensiteten af ​​luciferaseekspression vises på musen: rød repræsenterer høj ekspression, violet repræsenterer lav ekspression. Farven bar illustrerer relativ signal intensitet. (C) grafisk illustration af den langsigtede luciferase ekspression fra NOD-SCID-mus injiceret med enten Huh7 eller MIA-PaCa2 stabile cellelinier (n = 3 for Huh7 og n = 4 for MIA-PaCa2). Luciferase kvantificering udtrykkes, som fotoner /sek /cm

2 /sr og plottet (+/- SD). Baggrund lysniveau emission på ikke-behandlede dyr er 5 × 10

5 fotoner /sek /cm

2 /sr.

I betragtning af stigningen i luciferase transgen ekspression 35 dage efter -administration af cellerne, var vi sikre på, at en tumor afledt fra de injicerede celler var dannet. Musene blev derfor aflivet på 35 dage og dissekeret for at lede efter tegn på tumordannelse. Mens eksternt var der ingen mærkbar vækst, blev en stor masse observeret i bughulen, når dyret blev dissekeret. Et repræsentativt billede af tumormassen fra et dyr behandlet med Huh7-celler er vist i figur 2B. Billeddannelse af musene før og efter fjernelse af tumoren bekræftede, at luciferase transgenekspression blev lokaliseret til tumoren masse (figur 2B).

Histologisk analyse af de dannede Tumorer

Hæmatoxylin og eosin farves vævssnit blev udført for at identificere tumorhistologi afledt fra hver cellelinje. Figur 3 viser histologiske sektioner af tumorer dannet af Huh7-celler. Histologi bekræfter, at tumoren er et hepatocellulært carcinom (HCC) med varierende grader af differentiering (Figur 3A-D). Tumoren består af polygonale celler fordelt i løse ark og pseudoglandular mønstre. Kernerne var moderat pleomorfe, vesikulær og indeholde en kernelegeme. Enkelte isolerede mitotiske tal blev også noteret. Den cytoplasma var eosinofil og cellekanter var veldefineret, mens stroma var sparsom. Intracellulære og ekstracellulære galde dråber blev ikke set i tumoren og hverken var tumor nekrose. Funktionerne i tumoren blev bekræftet af en uafhængig histopatolog at være i overensstemmelse med en klasse II HCC (modificeret Edmonson og Steiners grading system).

Sektioner fra forskellige dele af de to tumorer blev skåret og farvet med hæmatoxylin og eosin til histologisk analyse af tumorerne. A-D) Snit fra Huh7 injicerede mus. Sektioner har en amorf struktur og blev identificeret som hepatocellulært carcinom (HCC) af varierende differentiering: (A) moderat differentieret HCC, forstørrelse x 10 (B-C) Snit blev analyseret ved immunohistokemi for at vise fordelingen af ​​luciferaseekspression. Brun farvning indikerer luciferase positive celler. (B) Positivt farves, Forstørrelse × 40 (C) Positivt farves, Forstørrelse × 10 (D) Negativ kontrol: ingen primær antistof tilsat, forstørrelse × 10 E-H) Sektioner fra MIA-PaCa2 injicerede mus. Sektioner har en amorf struktur og blev identificeret som Pankreatisk karcinom (PaCa) med varierende grader af differentiering. (E) moderat differentieret PaCa blev forstørrelse x 10 (F-G) Sektioner analyseret ved immunohistokemi for at vise fordelingen af ​​luciferaseekspression. Brun farvning indikerer luciferase positive celler. (F) Positivt farves, Forstørrelse × 40 (G) Positivt farves, Forstørrelse × 10 (H) Negativ kontrol:. Ingen primær antistof tilføjede, forstørrelse × 10

Desuden luciferase immunhistokemisk analyse af tumor sektioner (figur 3B og 3C) viste alle hepatocyt-lignende celler afledt fra de injicerede celler, der skal udtrykke luciferase. Ufarvede områder menes at være enten nekrotisk væv eller celler rekrutteret til tumoren, som endnu ikke er blevet bekræftet eksperimentelt og er i øjeblikket under undersøgelse.

Ligeledes haemotoxylin og eosin farvede vævssnit blev opnået for tumorerne dannet i mus efter injektion af MIA-PaCa2 celler (Figur 3E-H). I dette tilfælde viste de histologiske snit, at de dannede tumorceller var trængt mellem den normale pancreas acini ved periferien af ​​tumoren. Tumorcellerne blev beskrevet skal fordeles i faste plader uden tegn på glandulær differentiering og har en moderat mængde cytoplasma med veldefinerede cellerammer. Kernerne var atypisk og hyperkromatiske mens nucleoli var iøjnefaldende. Mitotiske tal var sjældne. Størstedelen af ​​tumorceller indeholdt en bleg intracytoplasmatisk vesikel skubbe kernen til periferien bibringe en signetring udseende. Ekstracellulære slim og stromale fibrose blev ikke set. En uafhængig histopatolog bekræftede alle funktionerne i tumoren var i overensstemmelse med en signetring carcinom i bugspytkirtlen.

De pUbC-S /MAR Plasmid er episomalt Vedligeholdt og Udtrykt i Resulterende Tumor Væv

Til give fysiske beviser på den molekylære beskaffenhed af de pUbC-S /MAR plasmid i HCC og pankreatiske tumorer, udførte vi Southern blot-analyse på total DNA isoleret fra to forskellige steder i den samme tumor 35 dage efter levering af enten Huh7 eller MIA-PaCa2 cellelinje.

en repræsentativ blot er vist i figur 4A, hvor der registreres en individuel bånd af den forventede størrelse i alle baner. Dette indikerer, at de pUbC-S /MAR pDNA forblive episomalt 35 dage efter levering. Yderligere bevis for episomal vedligeholdelse blev også leveret af plasmid redning af pUbC-S /MAR plasmid isoleret fra kanamycin-resistente

E. coli

efter transformation med total DNA fra tumor stammer fra Huh7 eller MIA-PaCa2 behandlede mus. I dette tilfælde ville kun intakt fri pDNA fra den isolerede tumor prøve producere bakterielle kolonier på plader indeholdende kanamycin, resistensmarkøren stede på plasmidet. Begrænsningen mønstre af pUbC-S /MAR plasmid var i overensstemmelse med umodificerede ikke-integrerede plasmidkonstruktioner (vist i figur 4E).

(A) Southern blot-analyse af pDNA isoleret fra to forskellige regioner af tumorvæv fra NOD /SCID-mus, 35 dage efter levering af Huh7 og MIA-PaCa2 stabil cellelinjer, udført som beskrevet i materialer og metoder. Et repræsentativt hybridiseringsmønster af pDNA isoleret fra et dyr af hver tumor, er vist. Påvisning af indikator plasmid af M: 1 kbp stigen (Hyperladder I, Bioline); bane 1: pUbC-S /MAR isoleret fra tumorvævet dannet efter Huh7 injektion af NOD /SCID-mus 35 dage efter injektion; bane 2: pUbC-S /MAR isoleret fra en anden region i tumorvævet dannet efter Huh7 levering til NOD /SCID-mus 35 dage efter injektion; Bane 3 pUbC-S /MAR isoleret fra tumorvævet dannet efter MIA-PaCa2 injektion af NOD /SCID-mus 35 dage efter injektion; bane 4: pUbC-S /MAR isoleret fra en anden region i tumorvævet dannet efter MIA-PaCa2 levering til NOD /SCID-mus 35 dage efter injektion; (+) Positiv kontrol: 25 ng lineariseret pUbC-S /MAR plasmid. (B) Replication-afhængig assay af pUbC-S /MAR plasmid DNA isoleret fra tumorerne fra mus 35 dage efter administration. bane 1-3: Southern blot af den samlede tumor DNA isoleret fra NOD /SCID-mus 35 dage efter levering med Huh7 stabil cellelinje og dobbelt fordøjet med

Spe

I-

Mbo

jeg ( bane 1),

Spe

I-

Dpn

I (bane 2) eller

Spe

I-

BFU

CI (bane 3) enzymer; banerne 7-9: Sydlige af den samlede tumor DNA isoleret fra NOD /SCID-mus 35 dage efter levering med MIA-PaCa2 stabil cellelinje og dobbelt fordøjet med

Spe

I-

Mbo

I (bane 4),

Spe

I-

Dpn

I (bane 5) eller

Spe

I-

BFU

CI (bane 6) enzymer; M: 1 kbp stige (Hyperladder I, Bioline UK Ltd., London, UK). (C) Kvantitativ PCR udført på tumor DNA opnået på dag 35 efter injektion af Huh7 og MIA-PaCa2 cellelinier. DNA blev ekstraheret fra to forskellige steder på hver tumor ved slutningen af ​​eksperimentet, og antallet af pUbC-S /MAR vektorgenomer pr diploid genom er vist, efter normalisering med GAPDH genet, som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. (D) PCR-analyse af DNA isoleret

in vitro

fra Huh7 (bane 1) og MIA-PaCa2 (bane 4) celler før injektion i NOD /SCID-mus, og

in vivo

fra to forskellige regioner af tumoren for hver cellelinje (bane 2,3 for Huh7 og baner 5,6 til MIA-PaCa2 cellelinjer). Forventede PCR-produkt størrelse: 1091 bp. 100 bp DNA-stige (bane M), (+) positiv kontrol: pUbC-S /MAR; (-) Negativ kontrol: PCR-blanding uden DNA. (E) plasmidredning eksperimenter af fire

E. Coli

kolonier for Huh7 (bane 1-4) og tre kolonier til MIA-PaCa2 cellelinjer (bane 5-7), der viser identisk begrænsning mønster med ren pUbC- S /MAR plasmid (+), følgende begrænsning fordøje med

Spe

jeg enzym. M:. 1 kbp stigen (Hyperladder I, Bioline)

Derudover har vi udført en replikering afhængig begrænsning assay at vise pDNA replikation. Total tumor-DNA fra to forskellige områder af enten HCC eller PaCa tumor, blev isoleret fra animalske grupper behandlet med pUbC-S /MAR plasmid ved afslutningen af ​​den 35 dage eksperimentet og blev fordøjet med

Spe

I, en enkelt cutter, at linearisere plasmidet, før yderligere fordøjelse natten over med de følsomme for methylering enzymer

Dpn

jeg,

Mbo

i eller

BFU

CI. Alle tre enzymer genkender den samme sekvens (GATC).

Dpn

jeg kræver methylering af mål-DNA ved bakterieceller for fordøjelsen, mens

Mbo

Jeg begrænsning er afhængig af pattedyr DNA methylering og

BFU

Cl nedskæringer uanset methylering status og skelner ikke kilden til methylering.

restriktionsspaltning fragmenter blev separeret på en 0,8% agarosegel, derefter blottet og probet med et 408-bp fragment fra kanamycinresistensgenet. Southern blot-analyse (figur 4B) tjener til at sammenligne fordøjelsen mønster af pUbC-S /MAR i tumor DNA isoleret fra Huh7 behandlede dyregruppe (figur 4B bane 1-3) med det fra MIA-PaCa2 gruppe (figur 4B baner 4-6).

Et tab af bakteriel methylering af pUbC-S /MAR plasmid findes i DNA isoleret fra begge tumorer, når disse er fordøjet med

Spe

i /

Mbo

I eller

Spe

I /

Dpn

I henholdsvis (bane 1,2,4,5). Vellykket fordøjelse af

Mbo

I er angivet ved omdannelse af den lineære

Spe

jeg band til fordøjelse fragmenter (bane 1 for Huh7 og bane 4 til MIA-PaCa2) og manglende fordøjelse af

Dpn

jeg forlader den enkelte

Spe

jeg lineariseret band intakt (bane 2 for Huh7 og bane 5 til MIA-PaCa2). Som

Mbo

jeg kun skærer pattedyr-afledt DNA, mens

Dpn

jeg kræver bakteriel methylering for fordøjelsen, betyder det, at pUbC-S /MAR plasmid har gentaget i tumorceller både HCC og PaCa. Endelig fordøjelse med

Spe

I-

BFU

CI ikke blokeres af nogen form for methylering og tjener som en positiv kontrol for plasmid fordøjelse (bane 3 og 6). Disse data viser, at S /MAR-huser plasmid pUbC-S /MAR er i stand til at replikere

in vivo

efter levering af stabilt transficerede cellelinjer, der ligner undersøgelser

in vitro

hvori S /MAR-udrustet pDNA er i stand til at opnå mitotisk stabilitet og replikation [26]. Den korrekte størrelse af restriktionsspaltning bands antyder mitotisk stabilitet uden grove omlejringer af replikerende plasmid.

Kvantitativ PCR blev udført ved afslutning af forsøget (35 dage efter levering) at sammenligne den relative kopiantal af plasmid molekyler i Huh7 og MIA-PaCa2 behandlede grupper. Resultaterne er vist i figur 4C, hvor i begge tilfælde plasmidkopiantal er beregnet til at være ca. en til tre vektor kopier /celle, i overensstemmelse med tidligere rapporter, som viser et relativt lavt kopital af S /MAR vektor af mindre end 10 kopier /celle [18], [25], [29].

desuden vedligeholdelse af transgene markørgen blev også vist ved PCR-analyse på DNA isoleret fra “dyrkede” MIA-PaCa2 og Huh7 celler (figur 4D , banerne 1 og 4) og fra to forskellige steder i tumorvæv på 35 dage efter levering (figur 4D, banerne 2,3 for Huh7 og baner 5,6 til MIA-PaCa2). Et PCR-produkt med den forventede størrelse, 1091 bps, blev genereret ud fra DNA fra alle kilder indikerer, at pUbC-S /MAR plasmid blev opretholdt i både Huh7 og MIA-PaCa2 celler og i hele tumoren er fremstillet af sådanne celler efter injektion i NOD -SCID mus. Dette bekræfter tilstedeværelsen af ​​pUbC-S /MAR plasmid både

in vitro

in vivo.

Diskussion

Dette arbejde repræsenterer udviklingen af murine tumormodeller stammer fra to forskellige cellelinier. Betydeligt, denne undersøgelse viser for første gang etableringen af ​​genetisk mærket murine modeller af pancreas og hepatocellulære carcinomer bruger et ikke-viral episomal plasmidvektor. Både HCC og PaCa har høje forekomster; HCC er den femte mest almindelige form for kræft i verden og tegner sig for 80-90% af primær leverkræft [30], mens der er omkring 42470 personer diagnosticeret med kræft i bugspytkirtlen hvert år i USA med mindre end 20% en- års overlevelse [31].

i betragtning forekomsten af ​​disse sygdomme, er det afgørende, at der udvikles en effektiv metode til at forbedre sygdommen påvisning og prognose. Frembringelsen af ​​en effektiv genetisk markeret murine tumor model for HCC og PaCa er et vigtigt skridt i denne proces, da det vil gøre det muligt for virkningerne af potentielle lægemidler til at være mere let og præcist overvåget og vil derfor gøre det muligt mere pålidelige data, når udvikling af nye lægemidler mod cancer.

Forsøg på at generere genetisk mærket tumorer tidligere har haft begrænsninger, såsom risikoen for integration med virale vektorer og potentiel insertionsmutagenese. Desuden genotoksicitet af virale vektorer kan betydeligt ændre egenskaberne af modtageren celle og efterfølgende datterceller. Når du opretter tumorxenoplantater, jo færre ændringer til de oprindelige tumorceller bedre repræsentation af kræft model. Derfor er udviklingen af ​​ikke-virale vektorer i kræftforskning at minimere disse negative virkninger er afgørende. Vores tidligere arbejde har vist kraftige og vedvarende episomal luciferaseekspression

in vivo

, fra et pDNA ekspressionssystem omfattende en S /MAR element og et mammal promotor i murine leveren [11], [20], [21]. Sporing af luciferase transgen over tid i et enkelt dyr uden behov for at ofre dyr indikerer anvendeligheden af ​​denne vektor i genetisk mærket tumorceller kan følge udviklingen af ​​en tumor model blot ved

in vivo

billeddannelse. Som vist her, S /MAR vektor muliggør stabil transfektion af kræftceller og efterfølgende udvikling af HCC og Paca tumorxenoplantater. Dette papir beskriver den første demonstration af den funktionelle brug af en S /MAR vektor stabilt transfektion kræftceller til genetisk markere tumorer

in vivo

.

Tidligere undersøgelser

in vitro

har vist, at S /MAR vektorer kan replikere episomalt uanset promotoren anvendes. Vi bekræfter og udvide denne observation ved hjælp af pUbC-S /MAR vektor i Huh7 og MIA-PaCa2 cellelinjer. Vi har opnået lignende resultater ved anvendelse af Pepi-Luc vektor – et S /MAR plasmid hvor luciferaseekspression drives af den humane CMV-promotor (data ikke vist). Men en tidligere undersøgelse at markere tumorceller genetisk med en luciferase transgen drevet af CMV-promotoren [4] har vist begrænsningerne i denne promotor for langsigtet transgenekspression siden CMV-promotoren let inaktiveres af flere host mekanismer som CpG-methylering [11], [14], [15], [16], [17]. Denne begrænsning er blevet overvundet ved vores undersøgelse, som viser en vedvarende ekspression fra pattedyr UbC promotoren i kombination med en S /MAR element. Differentiel etablering af celler kan kompensere for forskelle mellem luciferaseekspression set mellem dyr i hver gruppe efter administration.

Histopatologi analyse af tumorerne viste den typiske vævsmorfologi forventes af PaCa og HCC (figur 3) og den immunhistokemiske analyse viste alle tumorceller afledt fra dem, injiceres i musen til at være luciferase positive (figur 3). I betragtning af denne og den langsigtede transgenekspression opnået i 35 dage efter injektion, hvor der observeres en kraftig stigning af ekspression efter 21 dage (figur 2C), denne S /MAR vektor synes at være ideelt egnet til anvendelse i cancer-cellelinjer til at generere en genetisk mærket murin model for denne sygdom.