PLoS ONE: Fluorescens-Guided Surgery i kombination med UVC Bestråling Cures Metastatisk Menneskelig kræft i bugspytkirtlen i ortotopisk musemodeller

Abstrakt

Formålet med denne undersøgelse er at fastslå, om ultraviolet lys (UVC) bestråling i kombination med fluorescens-vejledt kirurgi (FGS) kan udrydde metastatisk menneske bugspytkirtelkræft i ortotopisk nøgen-musemodeller. To uger efter ortotopisk implantation af humane MiaPaCa-2 bugspytkirtelkræftceller, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), i nøgne mus, blev lys-lys kirurgi (BLS) udført på alle tumorbærende mus (n = 24). Efter BLS blev mus randomiseret i 3 behandlingsgrupper; BLS-only (n = 8) eller FGS (n = 8) eller FGS-UVC (n = 8). De resterende tumorer blev reseceret ved anvendelse af en håndholdt bærbar imaging system under fluorescens sejlads i mus behandlet med FGS og FGS-UVC. Den kirurgiske resektion seng blev bestrålet med 2700 J /m

2 UVC (254 nm) i mus behandlet med FGS-UVC. Den gennemsnitlige resterende tumor området efter FGS (n = 16) var betydeligt mindre end efter BLS kun (n = 24) (0,135 ± 0,137 mm

2 og 3,338 ± 2,929 mm

2, henholdsvis;

p

= 0,007). Den BLS behandlede mus havde signifikant reduceret overlevelse sammenlignet med FGS- og FGS-UVC-behandlede mus til både tilbagefald overlevelse (RFS) (

s

0,001 og

s

0,001 henholdsvis) og samlet overlevelse (OS) (

s

0,001 og

s

0,001 henholdsvis). FGS-UVC-behandlede mus havde øget RFS og OS i forhold til FGS kun behandlede mus (

s

= 0,008 og

s

= 0,025, henholdsvis); med RFS varer mindst 150 dage angiver dyrene helbredt. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse tyder på, at UVC-bestråling i kombination med FGS har klinisk potentiale til at øge overlevelsen

Henvisning:. Hiroshima Y, Maawy A, Zhang Y, Sato S, Murakami T, Yamamoto M, et al. (2014) Fluorescens-Guided Surgery i kombination med UVC Bestråling Cures Metastatisk Menneskelig kræft i bugspytkirtlen i ortotopisk musemodeller. PLoS ONE 9 (6): e99977. doi: 10,1371 /journal.pone.0099977

Redaktør: Juri G. Gelovani, Wayne State University, USA

Modtaget: Januar 16, 2014 Accepteret: 20 maj 2014; Udgivet: 12 Jun 2014

Copyright: © 2014 Hiroshima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af National Cancer Institute tilskud CA CA132971 og CA142669, og Grants-i-Aid fra det japanske ministerium for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi for Fundamental Research (C) (# 23.592.018 til IE og # 24.592.009 til KT ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Yukihiko Hiroshima, Yong Zhang, Mako Yamamoto, Fuminari Uehara, Shinji Miwa, og Shuya Yano er datterselskaber af AntiCancer Inc. Masashi Momiyama og Takashi Chishima var tidligere afdelinger af AntiCancer Inc. Robert M. Hoffman er en ikke-lønnet datterselskab af AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. markedsfører dyremodeller for kræft. Der er ikke andre konkurrerende interesser. Der er ingen patenter, produkter i udvikling, eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Komplet tumor resektion kan forbedre den samlede overlevelse bugspytkirtlen kræftpatienter [1], hvilket er i øjeblikket 5% ved fem år. Metastatisk tilbagefald ofte forekommer efter forsøgt kurativ resektion af den primære tumor, fordi alle kræftceller ikke fjernes af kirurgen på grund af den manglende evne til at se dem. Gør tumorer fluorescerer giver store fordele for tumor detektering under operationen for at opnå fuldstændig resektion [2]. Vi har tidligere vist, at fluorescens-vejledt kirurgi (FGS) for bugspytkirtelkræft faldt det resterende tumorbyrde og generelt forbedret og sygdomsfri overlevelse i musemodeller [3] – [5]. Det er imidlertid vanskeligt at fjerne alle mikroskopisk sygdom selv med FGS [5].

Ultraviolet (UV) lysbestråling har vist effekt i forskellige musemodeller i vores laboratorium in vitro og in vivo på cancerceller, der udtrykker fluorescerende proteiner [6] – [10]. Vi har tidligere rapporteret UV-induceret celledød viste sig at være bølgelængde og dosisafhængig samt cellelinje afhængige, med UVC er mest effektive [9]. In vitro, ned til 25 J /m

2 UVC bestråling dræbt ca. 70% af 143B humane osteosarkomceller udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) og rødt fluorescerende protein (RFP). Celledød begyndte ca. 4 timer efter bestråling og fortsatte indtil 10 timer efter bestråling. UVC eksponering undertrykt også cancercellevækst i nøgne mus i en model for minimal residual cancer (MRC) [7], [9]. Vi viste også, at murin Lewis lungecarcinoma (LLC) og humane U87 gliomaceller, som udtrykker GFP i kernen og RFP i cytoplasmaet, var mere følsomme over for UVC lys end ikke-farvede LLC og U87 celler, hvilket antyder, at ekspression af fluorescerende proteiner i cancerceller kan forbedre den fotodynamiske effekt af UVC på cancerceller.

i den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at UVC-bestråling anvendes til at irradicate MRC efter FGS er mere effektiv til human pancreascancer i ortotopisk musemodeller end FGS alene og resultater i tilsyneladende helbredelsesmetoder.

Materialer og metoder

Etablering af Green Fluorescent protein mærket Cancer Cell Linje

for grønt fluorescerende protein (GFP) gen transduktion af kræftceller, 70% sammenflydende MiaPaCa-2 humane pancreas-cancerceller [11], [12] blev anvendt. Kort fortalt blev celler inkuberet med en 1:01 udfældede blanding af retrovirale supernatanter af PT67-GFP-celler, der udtrykker GFP-genet bundet til G418-resistens-genet og RPMI 1640-medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT) i 72 timer. Frisk medium blev genopfyldes på dette tidspunkt. Celler blev høstet med trypsin /EDTA 72 timer efter transduktion og subdyrket i et forhold på 1:15 i medium, som indeholdt 200 ug /ml af det selektive middel G418. Niveauet af G418 blev forøget trinvis op til 800 ug /ml [11], [13] – [15].

Cell Culture

MiaPaCa-2-GFP og BxPC-3 [16 ] humane pankreatiske cancerceller blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 i luft. Cellerne blev opsamlet efter trypsinisering og farvet med trypanblåt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Kun levedygtige celler, som udelukkede trypanblå blev talt med et hæmocytometer (Hausser Scientific, Horsham, PA).

Dyr

athymiske

nu /nu

nøgne mus (AntiCancer Inc. , San Diego, CA), 4-6 uger gamle, blev anvendt i denne undersøgelse. Mus blev holdt i en barriere facilitet under HEPA filtrering. Mus blev fodret med autoklaveret laboratorium gnaver kost. Alle mus kirurgiske procedurer og billeddannelse blev udført med dyrene bedøvet ved intramuskulær injektion af en 0,02 ml opløsning af 50% ketamin, 38% xylazin, og 12% acepromazinmaleat. Alle dyr blev udført med et anticancer Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) -protokol specifikt er godkendt til denne undersøgelse og i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er skitseret i National Institute of Health Guide for pasning og anvendelse af dyr under Assurance Number A3873-1.

Subkutan tumorcelleimplantation

MiaPaCa-2-GFP-celler blev høstet ved trypsinisering og vasket to gange med serum-frit medium. Celler (2 x 10

6 i 100 pi serumfrit medium) blev injiceret subkutant inden for 30 min af høsten, over højre og venstre flanker hos mandlige nøgne mus. Subkutane tumorer fik lov at vokse i 2-4 uger, indtil store nok til at levere tilstrækkeligt tumor at høste til efterfølgende ortotopisk implantation.

ortotopisk tumorimplantation

En lille 6- til 10-mm tværgående snit blev foretaget på den venstre flanke af musen gennem huden og peritoneum. Halen af ​​pancreas blev eksponeret gennem denne incision, og en enkelt tumor fragment (3 mm

3) fra subkutane tumorer blev syet til halen i bugspytkirtlen hjælp 8-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon, Ethicon Inc., NJ, USA). Ved afslutningen blev halen i bugspytkirtlen returneres til abdomen, og snittet blev lukket i et lag under anvendelse af 6-0 nylon kirurgiske suturer (Ethilon) [17] – [19].

Fluorescens Imaging

Olympus OV100 Mindre Husdyrs Imaging System (Olympus Corp.), der indeholder en MT-20 lyskilde (Olympus Biosystems, Planegg, Tyskland) og DP70 CCD-kamera (Olympus Corp., Tokyo, Japan) [20] og Dino-Lite imaging system (AM4113T-GFBW Dino-Lite Premier; Anmo Electronics Corporation, Taiwan) [21] og MVX10 lange arbejdende afstande mikroskop (Olympus Corp.) [22], blev anvendt til billeddannelse af levende mus. Alle billeder blev analyseret med ImageJ v1.440 (National Institutes of Health).

Tumor Resektion og UVC Bestråling

To uger efter ortotopisk implantation af MiaPaCa-2-GFP bugspytkirtelkræft, lys-lys kirurgi (BLS) blev udført på alle tumorbærende mus (n = 24). Det eksponerede bugspytkirtlen tumor blev afbildet præoperativt med OV100 ved en forstørrelse på 0.14x. Resektion af den primære pankreastumor blev udført under standard lys-felt ved hjælp af MVX10 mikroskop. Postoperativt, blev den kirurgiske resektion seng afbildet med OV100 ved en forstørrelse på 0.56x at opdage residual tumor. Den mus, der undergik BLS blev randomiseret i 3 behandlingsgrupper: BLS-only (n = 8), FGS (n = 8), eller FGS-UVC (n = 8) (fig. 1). De resterende tumorer i FGS eller FGS-UVC grupper af mus blev resektion ved hjælp af Dino-Lite imaging system under fluorescens navigation. Efter afslutning af FGS blev kirurgisk resektion seng afbildes med OV100 ved en forstørrelse på 0.89x at detektere mikroskopisk minimal residual cancer (MRC) [23]. Den kirurgiske resektion sengen af ​​FGS-UVC gruppe mus blev bestrålet med 2700 J /m

2 UVC (emission peak 254 nm) fra bunden af ​​kammeret ved anvendelse af en Benchtop 3UV transilluminator (UVP, LLC, Upland, CA) . Snittet blev lukket i et lag ved hjælp af 6-0 nylon kirurgiske suturer. Efter behandling blev musene lov til at komme i deres bure.

To uger efter ortotopisk implantation af MiaPaCa-2-GFP pancreascancer, lys-lys kirurgi (BLS) blev udført på alle tumorbærende mus (n = 24). Postoperativt, blev den kirurgiske resektion seng afbildet med OV100 ved en forstørrelse på 0.56x at opdage residual tumor. Mus, der undergik BLS blev randomiseret i 3 behandlingsgrupper: BLS-only (n = 8), FGS (n = 8), eller FGS-UVC (n = 8). Resterende tumorer i mus i FGS og FGS-UVC grupper blev resektion ved hjælp af Dino-Lite imaging system under fluorescens navigation. Efter afslutning af FGS blev kirurgisk resektion seng afbildes med OV100 ved en forstørrelse på 0.89x at detektere micoscopic minimal residual cancer (MRC). Den kirurgiske resektion seng i musene i FGS-UVC gruppe blev bestrålet med 2700 J /m

2 UVC (emission peak, 254 nm) fra bunden af ​​kammeret ved anvendelse af en Benchtop 3UV transilluminator (UVP, LLC, Upland, CA).

invasiv Imaging af tumor gentagelse og progression

for at vurdere for tilbagefald og til at følge tumorprogression postoperativt, ugentlig non-invasiv hele kroppen imaging af musene blev udført med den OV100 ved en forstørrelse på 0.14x, indtil afslutningen af ​​eksperimentet.

monoklonalt antistof

Monoklonale antistoffer specifikke for carcinoembryonisk antigen (CEA) blev indkøbt fra RayBiotech, Inc. (Norcross, GA ). Antistofferne blev konjugeret med Dylite 488 Protein Mærkning Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) i henhold til producenterne.

følsomhed af ikke-farvede eller Fluorescent bugspytkirtelkræftceller til UVC bestråling in vitro

for at sammenligne effekten af ​​UVC-bestråling på ikke-farvede BxPC-3 eller fluorescerende bugspytkirtelkræftceller, BxPC-3 celler blev mærket med anti-CEA antistof konjugeret med Dylite 488 (BxPC-3-Ab488) eller GFP (BxPC-3 GFP). BxPC-3-GFP eller BxPC-3-Ab488 eller ikke-farvede BxPC-3-celler (10

3) blev udpladet i 100 pi cellekulturmedium per brønd i 96-brønds plader. Cellerne blev bestrålet med UVC ved forskellige doser (0, 25, 50 og 100 J /m

2) fra en Benchtop 3UV transilluminator (UVP, LLC, Upland, CA). Tyve timer efter UVC bestråling blev cellerne vasket med phosphatbuffer saltvand (PBS) tre gange. Cellen nummer blev bestemt med en IX71 fluorescens mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Statistisk analyse

PASWStatistics 18,0 (SPSS, Inc.) blev anvendt til statistiske analyser. Residual tumor område er udtrykt som middel ± SD. De to-halet Students

t

-test blev anvendt til at sammenligne kontinuerlige variabler mellem 2 grupper. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev anvendt til estimering overlevelse. Overlevelse resultater blev sammenlignet ved hjælp af log-rank test. En

s Drømmeholdet værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant for alle sammenligninger

Resultater

FGS reducerer Tumor Volume, men ikke udrydde enhver resterende Cancer Cells

BLS blev udført på alle tumorbærende mus (n = 24). Det eksponerede pankreatisk tumor blev afbildet præoperativt med OV100 ved en forstørrelse på 0.14x (fig. 2A). Postoperativt blev kirurgisk resektion seng afbildes med OV100 ved en forstørrelse på 0.56x (fig. 2B) for at detektere unresected tumor. Den mus, der undergik BLS blev randomiseret i 3 behandlingsgrupper; BLS-only (n = 8), FGS (n = 8), eller FGS-UVC (n = 8) (fig. 1).

Øvre paneler er lyse-felt (BF), og underpanel viser tumor fluorescens. Den resterende tumor efter BLS blev klart påvist med både OV100 ved en forstørrelse på 0.56x (B) og Dino-Lite ved en forstørrelse på 30x (E). Den resterende tumor efter FGS blev marginalt detekteret med enten OV100 ved en forstørrelse på 0.56x (C) eller Dino-Lite ved en forstørrelse på 30x (F). Den OV100 ved en forstørrelse på 0.89x klart opdaget minimal residual tumor efter FGS (D). (G) Den resterende tumor området efter FGS var signifikant mindre end efter BLS. Alle billeder blev målt for resterende tumor områder ved hjælp ImageJ. **

s

. 0,01

Imaging blev udført på alle 24 dyr efter BLS og før nogen anden behandling. Den gennemsnitlige resterende tumor område i hver gruppe var 3.46 ± 3,45 mm

2 (BLS), 3.26 ± 2.69 mm

2 (FGS), eller 3,30 ± 2,99 mm

2 (FGS-UVC). Omfanget af tilbageværende sygdom var statistisk ækvivalent.

I FGS, blev anvendt Dino-Lite håndholdt bærbar billeddannende system (Video S1). Efter afslutning af FGS blev kirurgisk resektion seng afbildes med OV100 ved en forstørrelse på 0.89x (fig. 2D) for at detektere mikroskopisk MRC. MRC efter BLS-only blev klart påvist med både OV100 ved en forstørrelse på 0.56x (fig. 2B) og Dino-Lite ved en forstørrelse på 30x (fig. 2E). MRC efter FGS blev marginalt detekteret med enten OV100 ved en forstørrelse på 0.56x (fig. 2C) eller Dino-Lite ved en forstørrelse på 30x (fig. 2F). Den OV100 ved stor forstørrelse (0.89x) kunne let påvise mikroskopisk MRC efter FGS (fig. 2D). Den gennemsnitlige resterende tumor området efter FGS (n = 16) var betydeligt mindre end BLS-only (n = 24) (0,135 ± 0,137 mm

2 og 3,338 ± 2,929 mm

2, henholdsvis;

p

= 0,007). Disse resultater antyder, at FGS reducerede signifikant residual tumorvolumen efter BLS-only, men mikroskopisk MRC forblev på den kirurgiske sengen selv efter FGS.

UVC Bestråling i kombination med FGS helbredelsesmetoder Metastatisk Humant kræft i bugspytkirtlen

Tilbagevendende tumorer blev detekteret med noninvasiv hele kroppen billeddannelse ved uge 3 til 11 i BLS-only behandlede mus og i uge 11 til 20 i FGS-only behandlede mus (fig. 3A og 4). Gentagelse blev påvist i 8 mus (100%) i BLS-eneste gruppe og 5 mus (62,5%) i FGS-gruppen (fig. 4). Alle tilbagevendende tumorer skred hurtigt og spredt regionalt og fjernt og dræbte musene mellem dag 30 til 156 i mus behandlet med BLS-only og mellem dage 134-195 i mus behandlet med FGS (fig. 3B-3F og 4B). I modsætning hertil blev der påvist nogen tilbagefald eller død i nogen mus behandlet med FGS-UVC (fig. 3G-3J og 4B), hvilket tyder på, at UVC bestråling udryddet mikroskopiske MRC efter FGS.

tilbagefald blev oprindeligt opdaget af ikke -invasive hele kroppen billedbehandling ved hjælp af OV100 ved en forstørrelse på 0.14x ved uge 11 efter FGS (a; hvid pilespids). Den tilbagevendende tumor skred hurtigt (B-D) og dræbte mus ved uge 22 efter FGS (D). Venstre armhulen lymfe-knude metastaser (E, hvid pilespids), stor lokal tilbagevendende tumor og mange udbreder tumor knuder (F) blev påvist i mus ved dødstidspunktet. I modsætning hertil blev ingen gentagelse påvist i FGS-UVC gruppe (G-J). Scale barer:. 10 mm

Survival Virkningen af ​​UVC Bestråling i kombination med FGS

Relapse overlevelse (RFS) og samlet overlevelse (OS) blev anslået i 3 eksperimentelle grupper af mus. Som vist i figur 4A og 4B, 3-måneders RFS i mus efter BLS-only, FGS og FGS-UVC var 0%, 50% og 100%, henholdsvis; og 5-måneders OS var 10%, 90% og 100%, hhv. Median RFS i mus behandlet med BLS-only, FGS og FGS-UVC var 28 dage, 103 dage, og 138 dage, henholdsvis og median OS var 57,5 ​​dage, 188,5 dage, og 195 dage, henholdsvis (tabel 1). Mus behandlet med BLS-kun viste signifikant reduceret overlevelse sammenlignet med mus behandlet med FGS og FGS-UVC for både RFS (

s

0,001 og

s

0,001 henholdsvis) og OS (

s

0,001 og

s

0,001 henholdsvis). FGS-UVC-behandlede mus viste signifikant længere overlevelse sammenlignet med mus behandlet med FGS for både RFS og OS (

s

= 0,008 og

s

= 0,025, henholdsvis) (fig. 4 og tabel 1 ), hvilket tyder på, at UVC bestråling i kombination med FGS udryddet mikroskopiske MRC.

Effekt af UVC bestråling på bugspytkirtelkræftceller Mærkede med Anti-CEA antistof konjugeret med Dylite 488

in vitro

eller GFP Sammenlignet med umærkede celler

effekten af ​​UVC-bestråling på BxPC-3 bugspytkirtelkræftceller mærket med anti-CEA antistof konjugeret med Dylite 488 (BxPC-3-Ab488), BxPC-3-GFP og umærket BxPC-3 blev sammenlignet (fig. 5A). UVC blev bestrålet ved forskellige doser (0, 25, 50 og 100 J /m

2). Sammenlignet med ikke-farvede BxPC-3-celler, antallet af BxPC-3-Ab488 og BxPC-3-GFP-celler faldt betydeligt på grund af UVC bestråling med 25 J /m

2 (p = 0,016 og p = 0,01, henholdsvis ) og 50 J /m

2 (p = 0,001 og p 0,001 henholdsvis). BxPC-3-Ab488 og BxPC-3-GFP-celler blev ligeledes mere følsomme over for UVC lys end ikke-farvede BxPC-3-celler.

(A) Repræsentative billeder af ufarvede BxPC-3, BxPC-3 -Ab488 og BxPC-3-GFP in vitro. Celler blev observeret med FV1000 konfokalt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan). Scale barer: 50 pm. (B) UVC blev bestrålet ved forskellige doser (0, 25, 50 og 100 J /m

2). Sammenlignet med ikke-farvede BxPC-3-celler, antallet af BxPC-3-Ab488 og BxPC-3-GFP-celler faldt betydeligt på grund af UVC bestråling med 25 og 50 J /m

2. De eksperimentelle data er udtrykt som middelværdi ± SD. * P 0,05, ** p. 0,01

Diskussion

Den kirurgiske ortotopisk implantation (SOI) musemodel anvendt i den foreliggende undersøgelse er blevet direkte sammenlignet med kliniske resultat af patient donorer i en tidligere undersøgelse af vores. Friske kirurgiske prøver afledt fra patienter med fremskreden mavekræft blev orthotopisk transplanteret i nøgne mus under anvendelse af SOI. Der var statistisk signifikante sammenhænge (p 0,01). For både levermetastaser og peritoneal involvering mellem patienter og mus [24]

I en anden tidligere undersøgelse af vores, blev pancreas-cancer prøver transplanteret til nøgne-mus pancreas ved anvendelse SOI [25]. De resulterende modeller repræsenterede klinisk bugspytkirtelkræft herunder: forlængelse af den lokalt voksende menneskelige bugspytkirtelkræft til den nøgne-mus maven og duodenum; metastaser til leveren og regionale lymfeknuder; og fjerne metastaser til binyrerne, mellemgulvet, og mediastinale lymfeknuder. De transplanterede humane pancreas tumorer udviste et lignende mønster af ekspression af human tumor-associeret glycoprotein 72 og carcinoembryonisk antigen.

Vi har tidligere vist, at SOI af intakt humant mavekræft væv resulterede i dannelsen af ​​metastaser hos 100% af musene med omfattende primær vækst til regionale lymfeknuder, lever og lunge. I modsætning hertil ortotopisk implantation af celle suspensioner af de samme menneskelige mavekræft på det samme sted, opstod metastaser kun 6,7% af musene med lokal tumordannelse. Disse resultater understreger betydningen af ​​at bruge SOI til at tillade fuld udtryk for metastatisk potentiale [26].

Vi har også tidligere sammenlignet den metastatiske sats af menneskets renalcellecarcinom SN12C når transplanteres af SOI eller ortotopisk implantation af cellesuspensioner i nyre. Metastatiske satser i de involverede organer (lunge, lever, og mediastinale lymfeknuder) var 2-3 gange højere med SOI i forhold til cellulære ortotopisk implantation. Median overlevelsestid i SOI model var 40 dage, hvilket var signifikant kortere end for cellulær ortotopisk implantation (68 dage) [27].

I en anden af ​​vores tidligere undersøgelser, vi sammenlignet SOI til cellulær ortotopisk transplantation af blærekræft. Efter SOI af RT-10 blære tumor, forekom metastaser i den regionale og fjernt lymfeknuder, lever, bugspytkirtel, milt, og væv støder op til binyrerne og ureter samt lungerne. Når disaggregerede RT-10 celler blev injiceret transurethralt, dannes ingen metastaser [28], [29].

Med hensyn til nøjagtigheden af ​​lægemiddelrespons, i en anden tidligere undersøgelse af vores, cisplatin (CDDP) havde signifikant effekt på småcellet lungecancer (SCLC) dyrkning orthotopisk i lungen og mitomycin C (MMC) ikke, hvilket afspejlede den kliniske situation. I modsætning hertil, når den SCLC voksede subkutant, tumorerne reagerede på MMC og ikke til CDDP. Disse resultater viste, at tumorer vokser orthotopisk afspejler de kliniske virkninger af narkotika på menneskers SCLC mere nøje end tumorerne vokser subkutant [30]. Derfor bør SOI model ikke påvirke UV følsomhed pancreasceller som de vokser på deres naturlige ortotopisk orgel.

Et stort problem i kirurgisk onkologi er MRC efter indledende kurativ tumor resektion [23]. Vi har tidligere demonstreret den forbedrede visualisering og resektion af primær og metastatisk cancer ved FGS med brug af telomerase-afhængig adenovirus (OBP-401), der udtrykker

GFP

genet kun i cancerceller, der udtrykker telomerase-enzymet [ ,,,0],31] – [33]

FGS undersøgelser har også tidligere været udført i vores laboratorium ved mærkning af tumorer med tumor-specifikke fluorescerende antistoffer, som har direkte klinisk anvendelighed [3] -. [5], [34] – [36]

En fluorofor-konjugeret antistof til CEA blev anvendt til at evaluere FGS af pankreatiske tumorer i SOI musemodeller for human pancreascancer BxPC-3.. Efter intravenøs injektion af anti-CEA-Alexa Fluor 488, blev fuldstændig resektion opnået i 92% af musene i FGS gruppe sammenlignet med 45,5% i BLS gruppen. Cure satser med FGS sammenlignet med BLS forbedret fra 4,5% til 40%, henholdsvis, og 1-årige postoperative overlevelsesrater steg fra 0% med BLS til 28% med FGS. Median DFS steg fra 5 uger med BLS til 11 uger med FGS. Median OS steg fra 13,5 uger med BLS til 22 uger med FGS [37].

Resultaterne af disse tidligere undersøgelser viser det store potentiale i FGS. Dog stadig tekniske problemer at fjerne MRC efter FGS. I den foreliggende undersøgelse påviste vi, at MRC forblev i den kirurgiske sengen selv efter FGS (fig. 2D), som skred hurtigt og kunne dræbe dyrene (fig. 3B-3F). Men UVC bestråling i kombination med FGS fuldstændigt forhindret recidiv (fig. 3G-3J og 4B) og viste signifikant forøget overlevelse sammenlignet med FGS alene for både RFS og OS (

s

= 0,008 og

p

= 0,025, henholdsvis) (fig. 4 og tabel 1). Disse resultater antyder, at UVC-bestråling kunne udrydde mikroskopisk MRC bliver tilbage efter FGS.

Vi har tidligere vist, at UVC-bestråling er i stand til at trænge op til 40 um i tre-dimensionelle histoculture hjælp Gelfoam og i en

ex vivo

tumormodel, samt dræbe overfladiske cancerceller op til en dybde på 40 um

in vivo

uden beskadigelse af dybe væv [7]. I den foreliggende undersøgelse blev MRC visualiseret, men kun under høj forstørrelse, efter FGS (fig. 2D). UVC var i stand til at udrydde MRC uden tilsyneladende bivirkninger og elimineret tilbagefald (fig. 3G-3J og 4B). Disse resultater antyder, at en dybde på 40 um er af tilstrækkelig dybde til at udrydde mikroskopisk MRC efter FGS. UVC-bestråling kan således sterilisere kirurgisk resektion seng af cancerceller efter FGS.

Desuden har vi påvist i denne undersøgelse, at BxPC-3-Ab488 celler var mere følsomme over for UVC lys end ikke-farvede BxPC-3-celler og tilsvarende i følsomhed over for BxPC-3-GFP-celler (fig. 5B). Disse resultater tyder på, at UVC bestråling kunne udrydde mikroskopiske MRC, mærket med en eksogen fluorophor, efter FGS og at den beskrevne i denne rapport teknologi kan anvendes i klinisk praksis.

Støtte Information

Video S1.

Resektion af den resterende tumor efter BLS under fluorescens navigation.

doi:10.1371/journal.pone.0099977.s001

(MP4)

Acknowledgments

Dedication: Dette papir er dedikeret til mindet om A. R. Moossa, M.D.