PLoS ONE: Specifik Thiazolidinedionerne Inhibit kræft i æggestokkene cellelinje spredning og Årsag cellecyklusstop i en PPARy Uafhængig Manner

Abstrakt

Baggrund

peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma (PPARy) agonister, såsom de thiazolinediones (TZD’er), er blevet undersøgt for deres potentielle anvendelse som cancer terapeutiske midler. Vi undersøgte effekten af ​​fire TZD’er-rosiglitazon (Rosi), ciglitazon (CGZ), troglitazon (TGZ), og Pioglitazon (Pio) -on æggestokkræft celleproliferation, PPARy udtryk og PPAR luciferase reporter aktivitet. Vi udforskes, om TZD’er handle på en PPARy afhængig eller uafhængig måde ved at udnytte molekylære metoder til at hæmme eller overudtrykke PPARy aktivitet.

vigtigste resultater

Behandling med CGZ eller TGZ i 24 timer nedsat proliferation i tre æggestokkene cancercellelinjer OVCAR3, CaOV3, og SKOV3, hvorimod Rosi og Pio havde ingen virkning. Dette fald i OVCAR3 celleproliferation skyldtes en højere fraktion af celler i G

0 /G

1 fase af cellecyklussen. CGZ og TGZ behandling øget apoptose efter 4 timers behandling, men ikke efter 8 eller 12 timer. Behandling med TGZ eller CGZ forøget PPARy mRNA-ekspression i OVCAR3 celler; dog proteinniveauer var uændrede. Overraskende viste luciferase promotor- assays at ingen af ​​de TZD’er forøget PPARy-aktivitet. Overekspression af vildtype PPARy øget reporter aktivitet. Dette blev yderligere forstærket af TGZ, Rosi, og Pio indikerer, at disse celler har den endogene kapacitet til at mægle PPARy transaktivering. For at bestemme om PPARy medierer TZD-inducerede formindskelse i proliferation blev celler behandlet med CGZ eller TGZ i fravær eller nærvær af en dominant negativ (DN) eller vildtype overekspression PPARy-konstruktionen. Hverken vektor ændrede TZD-medieret celleproliferation tyder denne effekt af TZD’er på kræft i æggestokkene celler kan være PPARy uafhængig.

Konklusioner

CGZ og TGZ forårsage et fald i kræft i æggestokkene celledeling, der er PPARy uafhængig. Dette koncept understøttes af den konstatering, at en DN eller overekspression af vildtype gjorde PPARy ikke påvirker ændringerne i celledeling og cellecyklus

Henvisning:. Al-Alem L, Southard RC, Kilgore MW, Curry TE (2011) specifik Thiazolidinedionerne Inhibit kræft i æggestokkene cellelinje Proliferation og Årsag cellecyklusstop i en PPARy uafhængig måde. PLoS ONE 6 (1): e16179. doi: 10,1371 /journal.pone.0016179

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: August 17, 2010; Accepteret: December 14, 2010; Udgivet: 21 Jan 2011

Copyright: © 2011 Al-Alem et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (tilskud numre CA95609, HD057446 og RR15592). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræft død hos kvinder. Af de tre hovedtyper af kræft i æggestokkene (epitel, kim celle, og køn ledningen stromale kræft), epitelial ovariecancer tegner sig for omkring 90% af alle tilfælde, og er den første dødsårsag fra gynækologiske maligniteter [1], [2] . Trods intens forskning i kræft i æggestokkene med nye mål bliver konstant undersøges, behandlingsmål forblive sparsomme. En af udfordringerne i æggestokkene kræftforskning er fraværet af en eksperimentel dyremodel, der rekapitulerer den menneskelige sygdom, der kan eksperimentelt manipuleres [1], [3]. Således har ovariecancer cellelinier blevet anvendt til at forstå de grundlæggende processer involveret i cancer cellevækst, differentiering og proliferation. Den foreliggende undersøgelse udnyttes tre ovariecancerceller, OVCAR3, CaOV3 og Skvo3, som er afledt af human epitelial ovariecancer [4], [5] for yderligere at udforske terapeutiske modaliteter i kræft cellevækst og proliferation.

En af de terapeutiske mål, der undersøges for kræft i æggestokkene er nukleare receptorer. Lægemidler, der aktiverer eller hæmmer nukleare receptorer er blevet anvendt til behandling af mange sygdomme. Faktisk omkring 13% af de lægemidler på markedet målrettet nukleare receptorer [6]. PPARy er et stærkt bevaret nuklear receptor [7] udtrykt i hele [8] krop og er overudtrykt i mange kræftformer, herunder æggestokkene og brystkræft, hvilket gør det en potentielt vigtig aktør i udviklingen af ​​kræft.

Endogen PPARy ligander er stadig ukendt, men godt karakteriserede kandidater omfatter flerumættede fedtsyrer, prostaglandin J

2 (PGJ

2) og arachidonsyre [9]. Syntetiske PPARy-ligander indbefatter thiazolidindioner (TZD’er), som består af Rosiglitazon (Avandia®), troglitazon (Rezulin®), Pioglitazone (Glustin ® /Actos®), og Ciglitazon, som alle er blevet udviklet og /eller anvendes til behandling af type II diabetes [10], [11], [12]. Brugen af ​​TZD’er som en terapeutisk tilgang i kræft er blevet undersøgt, men resultaterne har været kontroversielle [13], [14], [15]. I denne undersøgelse udnyttet vi molekylære, fysiologiske og farmakologiske metoder til at undersøge effekten af ​​de fire forskellige TZD’er på æggestokkene cancerceller og afgøre, om disse effekter er PPARy afhængige eller uafhængige.

Resultater

OVCAR3, CaOV3 og SKOV3 ovariecancer cellelinjer udtrykker PPARy

for at afgøre, om æggestokkene cancerceller udtrykker PPARy blev real time PCR og western blot analyse udført. Der var differentiel PPARy-ekspression i de tre forskellige cellelinier både på mRNA’et og proteinniveauer. Mens PPARy mRNA-ekspression var højest i SKOV3-celler (figur 1A), SKOV3-celler havde de laveste PPARy proteinniveauer (figur 1B). I modsætning hertil OVCAR3 havde lave niveauer af PPARy-mRNA-ekspression, men rigelig ekspression af PPARy-protein (figur 1A og 1B henholdsvis). PPARy aktivitet i de tre cellelinier blev undersøgt ved hjælp af celler transficeret med en 3XPPRE-Luc-

Renilla

konstruere og sammenlignet med celler transficeret med luciferase og

Renilla

konstruktioner mangler PPRE. OVCAR 3 celler udviste ca. 2 gange mere endogen PPRE aktivitet sammenlignet med Caov3 celler, mens SKOV3 celler viste 50% mere PPRE aktivitet sammenlignet med OVCAR3 celler (figur 1C).

(A) mRNA-ekspression (B) Proteinekspression og (C) PPRE luciferaseaktivitet. Dataene blev normaliseret til niveauer på PPARy-ekspression og aktivitet i OVCAR3 celler. Resultaterne er middelværdier ± SEM i mindst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer, som ikke deler et brev betegnelse er signifikant forskellige (

s

0,05). Celler transficeret med Luc og Renilla konstruerer mangler PPRE (PPRE -) var signifikant lavere end samme cellelinje transficeret med PPRE-Luciferase-Renilla konstruktioner (PPRE +) af Welch t-test (

s

0,05) .

retinsyrereceptor (RXR) er ikke en begrænsende faktor i PPARy aktivitet

PPARy bindes til sin heterodimere partner RXR før binding til DNA [16]. RXR vides at være konstitutivt udtrykkes i celler og er blevet vist at heterodimerisere med andre receptorer foruden PPARy, såsom vitamin D-receptoren [17]. For RXR skal aktiveres, dens ligand 9-

cis

retinsyre (9-

Cis

-Ra) skal være til stede. For at sikre at aktiverede RXR er ikke en begrænsende faktor i vore forsøg blev celler behandlet med 9-

Cis

-Ra. I disse eksperimenter blev celler transficeret med forskellige PPARy-konstruktioner, herunder Δ467 som er en dominant negativ (DN) form af PPARy [18], [19], samt en overekspression form af vildtype PPARy (OE), som bruges til at øge PPARy-ekspression. En DN form af PPARy blev anvendt i alle disse baseret på indledende eksperimenter, afslørede, at DN transfektion reducerede PPRE aktivitet 40% under niveauerne i celler transficeret med shRNA PPARy (data ikke vist). For at sikre, at PPARy blev overudtrykt enten i DN eller OE formular sammenlignet med kontrolceller (dvs. celler transficeret med pGL3), blev PPARy proteinekspression måles ved anvendelse af Western blot-analyse. Som forventet var der en markant induktion af både DN og OE form af PPARy (figur 2A insert). Efter transfektion med kontrollen, DN eller OE-vektor, celler blev efterfølgende behandlet med vehikelkontrol eller 1 uM af 9-

Cis Salg -Ra i 24 timer i mørke. Vi observerede, at tilstedeværelsen af ​​9-

Cis Salg -Ra påvirkede ikke aktiviteten af ​​PPARy reporter assay, OVCAR 3 celler, hvilket indikerer, at aktiveret RXR er ikke en begrænsende faktor i denne cellelinie (figur 2A). Tilsætningen af ​​9-

Cis Salg -Ra til Caov3 celler ændrede ikke PPRE aktivitet indtil PPARy blev overudtrykt (figur 2B) antyder, at aktiverede RXR er ikke hastighedsbegrænsende indtil PPARy er meget rigeligt i denne cellelinie. Overraskende, i SKOV3-celler, 9-

Cis Salg -Ra øgede PPARy reporter aktivitetsassay i kontrolceller (pGL3), men havde ingen virkning, når PPARy løbet blev udtrykt sammenlignet med kontrol (figur 2C).

Celler blev dobbelt transficeret med en PPRE konstrukt og en af ​​følgende: tom vektor (pGL3), DN form af PPARy (DN) eller vildtype form af PPARy (OE). Efter de dobbelte transfektioner blev celler behandlet i 24 timer med kontrol vehikel (DMSO) eller 1 uM af 9-

Cis

-Ra i mørke. PPRE luciferaseaktivitet er illustreret for (A) OVCAR3, (B) CaOV3, og (C) SKOV3. Controls repræsenterer celler, der var transficeret med tom vektor og behandlet med vehikelkontrol, vist som den første bar i hvert panel. Resultater for PPRE luciferaseanalyse er middelværdier ± SEM i mindst 9 målinger. Barer, som ikke deler et brev betegnelse er signifikant forskellige (

s

0,05). Indsæt Panel A: Western blot af PPARy protein i OVCAR3 celler dobbelt transficeret med et PPRE konstruktion og enten tomme vektor, DN eller OE PPARy konstruktioner og behandlet med kontrol køretøj i 24 timer

CGZ og TGZ årsag. et fald i celledeling

for at definere virkningerne af PPARy-ligander på celleproliferation blev MTS analyser udført. OVCAR3 celler blev behandlet med koncentrationer på 0, 0,1, 1 eller 10 uM Rosi, CGZ, TGZ eller Pio i 24 timer. Den maksimale TZD anvendte koncentration var 10 uM siden PPARy specifikke handlinger er rapporteret med TZD’er ved koncentrationer ≤10 pM [20], og højere koncentrationer er kendt for at inducere celledød [21]. Indgivelse af de fire TZD’er resulterede i forskelle i celleproliferation. Behandling med CGZ nedsat proliferation 80%, TGZ forårsagede et fald på 65%, mens Rosi og Pio havde ingen virkning på proliferation (figur 3A-D sorte søjler). I et forsøg på at forstå, hvorvidt faldet i proliferation efter TZD behandling er fælles på tværs andre ovariecancerceller blev TZD behandling af CaOV3 og SKOV3 udforsket. En tilsvarende reduktion i proliferation blev set i disse cellelinier, når de behandles med CGZ og TGZ ved 10 uM. Caov3 celler udviser en 80% og 30% fald i celleproliferation, når de behandles med CGZ og TGZ henholdsvis (figur 3A-B). SKOV3 celler udviser en 45% og 35% fald, når de behandles med 10 pM CGZ og TGZ henholdsvis (figur 3A-B). Svarende til OVCAR3 celler, Caov3 og SKOV3 celler behandlet med Rosi eller Pio udviste ikke en ændring i proliferation (figur 3C-D).

Æggestokkræftceller blev serum sultet i 24 timer og behandlet i yderligere 24 timer med vehikelkontrol (DMSO) eller 0,1, 1,0 eller 10 uM CGZ (A), TGZ (B), Rosi (C), eller Pio (D). Celleproliferation blev vurderet med MTS-assayet. Resultaterne er middelværdier ± SEM i mindst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Statistisk analyse blev udført inden for hver cellelinie. Barer, som ikke deler et brev betegnelse er signifikant forskellige inden for en behandlingsgruppe (

s

0,05). Sorte bjælker: OVCAR3, Grå: CaOV3, lysegrå:. SKOV3

CGZ og TGZ fald BrdU DNA inkorporering

MTS assay måler mitokondrie-aktivitet i celler, hvilket er tegn på deres levedygtighed [22] og som en indirekte vurdering af celleproliferation. Men der er en rapport, som TZD’er kan interferere med MTS-assayet [23]. Derfor målte vi også hastigheden af ​​DNA-replikation i OVCAR3 celler ved hjælp BrdU inkorporering som en anden indeks for celleproliferation. OVCAR3 celler blev behandlet med 0, 0,1, 1 eller 10 uM Rosi, CGZ, TGZ eller Pio i 24 timer. BrdU analyser viser lignende resultater som dem i MTS-analysen. Der var ca. et fald 70% i proliferation i celler behandlet med 10 pM CGZ eller TGZ, og ingen virkning af Rosi eller Pio på celleproliferation (figur 4A-D).

OVCAR3 celler blev serumudsultet i 24 timer og behandlet i yderligere 24 timer med vehikelkontrol (DMSO) eller 0,1, 1,0 eller 10 uM CGZ (A), TGZ (B), Rosi (C), Pio (D). Celleproliferation blev vurderet med BrdU assay. Resultaterne er middelværdier ± SEM i mindst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer, som ikke deler et brev betegnelse er signifikant forskellige inden for en behandlingsgruppe (

s

0,05).

PPARy mRNA-ekspression forstærkes af TZD behandling af kræft i æggestokkene celler

for at vurdere sammenslutning af disse ligander med regulering af PPARy undersøgte vi effekten af ​​TZD’er på ekspressionen af ​​PPARy i OVCAR3 celler. Celler blev behandlet med eller uden 10 uM TZD’er og PPARy-mRNA og protein niveauer blev analyseret 24 timer senere. PPAR (ekspression blev øget i OVCAR3 celler behandlet med CGZ (6,9 gange) og TGZ (18,1 gange) (figur 5A). Overraskende var der en stigning i PPAR (protein efter Rosi men ikke CGZ eller TGZ behandling (figur 5B). I et forsøg på at forklare denne uoverensstemmelse mellem mRNA og proteinekspression, undersøgte vi et tidsforløb for PPAR (mRNA og proteinekspression. Celler blev behandlet med de forskellige TZD’er til 4, 8, 12 eller 24 timer og både real time PCR og Western blot-analyse blev udført. Vi observerede ikke en korrelation mellem ekspressionsmønstre for PPAR (mRNA og protein på tværs af tid, der indikerer, at der er potentielt andre mekanismer, som påvirker niveauerne af PPAR (protein i disse celler. en mulighed er, at TZD’er øge omsætningen og nedbrydning af PPAR (protein som set i andre systemer [24], [25].

PPARy mRNA og proteinekspression blev målt i OVCAR3 celler under anvendelse af (A) Real time PCR og (B) Western blot-analyse efter TZD . behandling Cellerne blev serum sultet i 24 timer og behandlet i yderligere 24 timer med køretøj kontrol (DMSO) eller en af ​​følgende: 10 uM Rosi, CGZ, TGZ eller Pio. Resultaterne er middelværdier ± SEM i mindst 3 målinger fra to individuelle eksperimenter. Barer med forskellige hævet er signifikant forskellige (

s

0,05).

Da CGZ og TGZ forårsagede et fald i celleproliferation i Caov3 og SKOV3 celler, vi målte mRNA-ekspression af PPARy i disse celler. I Caov3 celler, mRNA ekspressionen af ​​PPAR efter CGZ og TGZ behandling var 3,6 og 4,4 gange over kontrollen køretøjet henholdsvis selv om disse ændringer ikke nåede signifikans. SKOV3-celler viste ingen ændringer i PPARy-ekspression efter behandling med TZD’er (data ikke vist). Kollektivt, vores data tyder på, at PPAR (mRNA er til stede og er reguleret af TZD’er i æggestokkene kræftceller omend i forskelligt omfang afhængigt af celletype og liganden bruges til at aktivere PPARg.

CGZ og TGZ ikke inducere apoptose

i dette og efterfølgende eksperimenter undersøgte vi kun OVCAR3 celler som disse celler viste de mest bemærkelsesværdige effekter, når de behandles med TZD’er. Endvidere er disse celler almindeligt anvendt i studiet af ovariecancer, lette sammenligning med tidligere undersøgelser. i et forsøg på bedre at forstå den mekanisme mediering faldet i celleproliferation, vi undersøgte, om apoptose bidrager til dette fald. vi observerede et fald i celleproliferation efter 24 timers behandling (figur 3 og 4). Hvis dette fald skyldes apoptose, derefter dette celledød skulle have fundet sted på et tidligere tidspunkt. Derfor undersøgte vi virkningen af ​​TZD’er på OVCAR3 celler og afgøres, om cellerne enten levedygtige eller undergår apoptose og var døde på 4, 8 eller 12 timer efter behandling under anvendelse af FACS-analyse. Der var en svag stigning i apoptotiske og døde celler efter 4 timers behandling med CGZ og TGZ (figur 6A). Imidlertid blev denne stigning ikke detekteret i prøver behandlet i 8 eller 12 timer (figur 6B og 6C). Trypanblåt eksperimenter for at bekræfte levende versus døde celler viste lignende resultater (data ikke vist).

OVCAR3 celler blev serum sultet i 24 timer og behandlet med vehikelkontrol (DMSO) eller 10 pM CGZ eller TGZ for (A ) 4 timer, (B) 8 timer, eller (C) 12 timer. Resultaterne er middel ± SEM af 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Lysegrå søjler repræsenterer levedygtige celler; mørkegrå søjler repræsenterer celler, som undergår tidlig og sen apoptose såvel som dem, der er døde. Barer, som ikke deler et bogstav eller tal betegnelse er signifikant forskellige (

s

0,05)

CGZ og TGZ årsag cellecyklusstop

I en. forsøg på at klarlægge årsagen bag faldet i proliferation, blev virkningerne af TZD’er på cellecyklusprogression også vurderet. En betydelig stigning i celler i G

0 /G

1 fase blev set efter behandling med TGZ og CGZ (figur 7A). CGZ administration resulterede i et signifikant fald i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus (figur 7B), medens ingen ændringer i S-fasen blev set i celler behandlet med CGZ eller TGZ (Fig 7C). Celler behandlet med Rosi eller Pio viste ikke nogen ændring i cellecyklusfordeling sammenlignet med kontrol (data ikke vist).

OVCAR3 celler blev serum sultet i 24 timer og behandlet i yderligere 24 timer med vehikelkontrol (DMSO ) eller 10 uM af CGZ eller TGZ. (A) G

0 /G

1, (B) G

2, (C) S-fase. Resultaterne er middelværdier ± SEM i mindst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer, som ikke deler et bogstav eller tal betegnelse er signifikant forskellige (

s

0,05).

Effekter af TZD’er på PPRE luciferaseaktivitet

For at klarlægge om de antiproliferative og cellecyklusstop effekter ses med udvalgte TZD’er er en direkte virkning af PPARy transaktivering, vi forbigående transficeret celler med et 3XPPRE-MTK-pGL3-reporter plasmid. To yderligere konstruktioner blev cotransficeret, nemlig et DN form af PPARy og en overekspression (OE) af en vildtype PPARy-konstruktion. Celler blev derefter behandlet i 24 timer med 10 pM af Rosi, CGZ, TGZ, eller Pio. Ingen af ​​TZD behandlinger alene øgede PPRE aktivitet (figur 8). Celler, der var transficeret med DN viste en omtrentlig 40% reduktion i PPRE medieret aktivitet i både ubehandlede og TZD behandlede celler. Endvidere øger ekspressionen af ​​vildtype PPARy viste en stigning i luciferaseaktivitet, når celler blev behandlet med en af ​​de fire forskellige TZD’er sammenlignet med celler, der kun blev behandlet med TZD’er (figur 8A-8D).

OVCAR3 celler blev dobbelt transficeret med et PPRE konstruktion og en af ​​følgende: Tøm vektor, DN, eller OE PPARy. Efter de dobbelte transfektioner blev celler behandlet i 24 timer med vehikelkontrol (DMSO) eller 10 pM (A) CGZ, (B) TGZ, (C) Rosi, (D) eller Pio. Resultaterne er middelværdier ± SEM i mindst 3 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer, som ikke deler et brev betegnelse er signifikant forskellige (

s

0,05).

Analyse af TZD medieret PPARy afhængige og uafhængige handlinger

For at afgøre, om virkningerne af TZD’er er PPARy afhængige blev cellerne behandlet med 10 pM TZD’er i fravær eller tilstedeværelse af PPARy antagonister (GW9662, T007). MTS assay blev udført for at bestemme, om tilstedeværelsen af ​​antagonister kunne vende virkningerne af TZD’er på ovariecancer celleproliferation. Resultaterne viste, at der var en partiel ‘rescue’, når celler blev behandlet med GW9662 (figur 9A) eller T007 (figur 9B) forbindelser i kombination med CGZ eller TGZ. Men mønstret af aktion var inkonsekvent mellem de to antagonister og selv med den samme antagonist i nærvær af forskellige TZD’er. For eksempel T007 var i stand til fuldstændigt at blokere virkningerne af CGZ på celleproliferation, men havde ingen effekt på TGZ medieret fald i proliferation. Desuden har brugen af ​​GW9662 eller T007 forbindelser alene ikke påvirke spredning på egen hånd som var forventet. Dette kan skyldes det faktum, at disse antagonister kan blandes agonister eller ikke PPARy specifik [9], [26]. Disse resultater indikerer, at anvendelsen af ​​en farmakologisk tilgang med rapporterede PPARy-antagonister alene ikke besvare spørgsmålet om, hvorvidt virkningen af ​​TZD’er handle gennem PPARy. Dette førte os til at bruge en molekylær tilgang med DN eller OE PPARy konstruerer at undersøge, om de observerede virkninger på celledeling og cellecyklus var PPARy afhængige eller uafhængige.

Celler blev behandlet med GW9662 (A) eller T007 (B ) i 24 timer og celleproliferation blev vurderet. Resultaterne er middelværdier ± SEM i mindst 4 målinger. Barer, som ikke deler et brev betegnelse er signifikant forskellige (

s

0,05).

transfektion af celler med DN eller OE former for PPARy uden tilstedeværelse af ligander ændrede sig ikke celleproliferation som vist ved BrdU-assays (figur 10). Mere vigtigt blev virkningerne af CGZ og TGZ på proliferation ikke overvindes ved tilstedeværelsen af ​​DN form af PPARy (figur 10). Luciferaseassays blev kørt på prøver i de samme plader med henblik på at sikre, at cellerne blev transficeret og ekspression af DN forårsagede den forventede nedgang mens overekspression af vildtype PPARy øget PPRE aktivitet, henholdsvis (data ikke vist). I overensstemmelse med de i BrdU-assays, cellecyklus data indikerer også, at virkningen af ​​CGZ og TGZ ikke PPARy afhængig (data ikke vist).

OVCAR3 celler blev dobbelt transficeret, serum sultet i 24 timer og behandlet for en yderligere 24 timer med køretøj kontrol (DMSO) OR10 uM CGZ eller TGZ. Celleproliferation blev vurderet med en BrdU-assay. Resultaterne er middelværdier ± SEM i mindst 9 målinger fra tre individuelle eksperimenter. Barer, som ikke deler et brev betegnelse er signifikant forskellige inden for en behandlingsgruppe (

s

0,05).

Diskussion

TZD’er har vist sig at have en bred vifte af virkninger på kræftceller. Den formodede mål for TZD’er, PPARy, overudtrykkes i en række af cancere, herunder bryst-, lunge-, tyktarms-, prostata- og ovarie [2], [27], [28], [29]. Selv de nøjagtige rolle TZD’er og PPARy spille i kræft i æggestokkene er stadig ukendt, denne undersøgelse viser, at CGZ og TGZ har anti-proliferative handlinger på tre æggestokkene kræftceller, mens Rosi og Pio har ingen virkning. Den omstændighed, at disse anti-proliferative aktioner ses i alle tre cellelinier antyder, at dette er et almindeligt fænomen og ikke begrænset til et enkelt ovariecancer cellelinie. De beskrevne eksperimenter heri viser også, at de fire TZD’er har forskellige handlinger på æggestokkene kræftceller eventuelt gennem både PPARy afhængige samt uafhængige veje. Selv om flere rapporter viser, at forskellige cellelinier reagerer forskelligt på TZD’er, [30], [31], [32], [33], så vidt vi ved, en direkte sammenligning mellem disse fire TZD’er i æggestokkræft og afgrænser, om disse virkninger er PPARy afhængig bruge molekylære, fysiologiske og farmakologiske metoder er ikke blevet undersøgt.

i den foreliggende undersøgelse, 10 uM CGZ og TGZ faldt celledeling i alle tre æggestokkene kræftceller undersøgt. Disse observationer er i konkordans med andre forsøg med kræft i æggestokkene celler samt andre cellelinjer hvor CGZ og /eller TGZ faldt MTT aktivitet [20], [21], [34]. Men vores resultater er i modsætning til cancercellelinier fra andre væv, såsom bryst, skjoldbruskkirtel, blære og andre, som normalt kræver meget højere koncentrationer af TZD’er at fremkalde en biologisk respons. Faktisk doser op til 100 uM, der overstiger de rapporterede ligandspecifikke koncentrationer på 10 uM eller derunder [12], kan der kræves før en inhibering af proliferation ses [35], [36], [37], [38] , [39]. Dog kan disse forskelle skyldes til dels, at anvendelsen af ​​forskellige cellelinier eller forskellige celledyrkningsbetingelser, hvor for eksempel har forskere anvendt 1% FBS [39], 5% FBS [35], [36], [37 ], [38], [39] eller 10% FBS [21]. De foreliggende resultater viser, at dette fald i proliferation skyldes en stigning i cellecyklusstop ikke en stigning i apoptose. Tilsvarende har andre rapporter vist, at TZD’er fører til nedbrydningen af ​​cyclin D1 i prostatacancer [40], som forårsager standsning af cellecyklus, og et fald i tumorcelleproliferation. Ligeledes i A2780 ovariecancerceller, CGZ nedsætter cyclin D1 sammen med andre pro-overlevelse faktorer, som resulterer i cellecyklusstop [21]. Yang og kolleger [20] rapporterede, at CGZ og TGZ behandling af ES-2 og PA-1 ovariecancerceller resulterede i cellecyklusstop; dog blev denne ændring i cellecykluskinetikken forbundet med forøgede niveauer af apoptose. Selvom vores undersøgelser understøtter de tidligere resultater i forskellige ovariecancerceller at TZD’er mindske celleproliferation ved standsning celler i G0 /G1 fase af cellecyklussen, eksisterer muligheden for, at højere koncentrationer af TZD’er anvendes i disse tidligere undersøgelser medfører induktion af apoptose [20].

den foreliggende undersøgelse viser, at hver af de TZD’er har forskellige handlinger på ovariecancer celleproliferation. CGZ og TGZ forårsage en dramatisk nedgang i æggestokkræft celledeling mens Rosi og Pio havde ingen effekt. Dette er ikke uventet, da hver TZD har en anden affinitet og binding til PPAR [7], [41], rekrutterer forskellige coaktivatorer [42] og kan fremkalde distinkte cellulære responser. Disse unikke handlinger har ført til konceptet at TZD’er er selektive modulatorer af PPARy og derfor målrette distinkte gener resulterer i vævsselektivitet [12], [42], [43], [44]. Desuden TZD’er har forskellige specificiteter for PPAR’er. For eksempel er Rosi og Pio betragtes som den mest potente PPARy-agonister ud af de fire TZD’er anvendt i denne undersøgelse [11]. Resultaterne at disse potente PPARy-agonister ikke hæmmer celledeling yderligere støtte vores hypotese, at aktionerne i TZD’er kan være uafhængig af PPAR. Endvidere Rosi, CGZ og TGZ er specifikke for PPARy mens Pio har vist sig at også aktivere PPARa [45], [46]. Derfor kan vores data afspejler forskellene i den selektive modulering af PPARy, forskelle i specificitet for PPARy, eller aktiveringen af ​​distinkte PPARy uafhængige veje.

For at begynde at forstå den selektive modulering af PPARy ved TZD’er i æggestokkene cancerceller, undersøgte vi mRNA og protein udtryk profiler af PPARy og aktiveringen af ​​PPARy promoter efter TZD behandling. Der er en dramatisk stigning i PPARy-mRNA-ekspression, når OVCAR3 celler blev behandlet med TGZ og i mindre grad med CGZ og Rosi. I modsætning hertil blev der observeret den højeste ekspression af PPARy protein, når celler blev behandlet med Rosi. Denne uoverensstemmelse mellem ekspressionen af ​​PPARy-mRNA og protein efter TZD behandling er ikke blevet observeret eller undersøgt tidligere, men niveauerne af PPARy protein efter TZD behandling har vist sig at være yderst variabel mellem ES-2 og PA-1 ovariecancerceller [ ,,,0],21]. Vi postuleret, at undersøgelsen af ​​en statisk 24 timer tidspunkt måske ikke præcist fange induktion af PPAR mRNA og protein. Vi vurderede derfor niveauet af PPARy mRNA samt proteinmønstre på forskellige tidspunkter efter TZD behandling og observeret en manglende korrelation mellem PPARy-mRNA og proteinekspression ved alle tidspunkter. En alternativ teori til at forklare denne uoverensstemmelse er, at stigningen i ekspression af PPARy-mRNA, når cellerne behandles med TGZ kan øge omsætningen og nedbrydningen af ​​PPARy-protein og derved reducere proteinekspression. Dette er tidligere blevet påvist i andre systemer, hvor det blev vist, at med stigende doser af TZD’er, var der en stigning i PPARy proteinnedbrydning hvilket resulterede i et fald i steady state niveauer af proteinet i endotelceller [24], [25] . Dette antages at opstå som følge TZD’er mediere ændringer i phosphoryleringstilstanden af ​​PPARy ved MEK som forlader PPARy følsomme for nedbrydning [47]. På baggrund af disse oplysninger, kan vores protein data forklares ved det forhold, at TZD’er årsag differentiel nedbrydning af PPAR (efter aktivering, og at turn-over rate of PPAR (protein i celler behandlet med TGZ er hurtigere end den for CGZ og Rosi resulterende i et fald i protein niveauer. Desuden er det muligt, Rosi forøger proteinstabilitet af PPAR (mens virkningerne på proliferation efter behandling med CGZ og TGZ er PPAR (uafhængige. Alternativt kan TZD’er forårsage ændringer i proteinet selv, sådan som phosphorylering, der ændrer andre aktioner af proteinet snarere end blot at ændre sin samlede transaktivering som for nylig blevet vist af Choi et al. [48].

i lyset af vores resultater, der viste en manglende korrelation mellem niveauerne af PPAR (mRNA og protein efter TZD behandling, vi undersøgt ændringer i aktivering af en PPAR (reporter som et indeks for PPAR (aktivitet efter TZD eksponering. Overraskende PPAR (aktivitet blev ikke stimuleret af en af ​​de 4 TZD’er efter 24 timers behandling, i modsætning til tidligere rapporter i andre ovariekræft cellelinier, 50 mM CGZ øget luciferaseaktivitet af en PPRE reporter med 18 timer [21]. Baseret på denne tidligere rapport, vi spekuleret på, at promoter aktivering kan forekommer ved tidligere eller senere tidspunkter. Derfor testede vi virkningen af ​​TZD’er på promotoraktivitet ved 4, 8, 24 og 32 timer. Der var beskedne stigninger i luciferaseaktivitet i celler behandlet med CGZ på 8 og 32 timer (data ikke vist), som var tilstrækkelige til at tage højde for ændringerne i PPAR (udtryk. Diskordans mellem protein niveauer og PPAR (aktivitet har tidligere været set i brystet cancerceller, men den nøjagtige mekanisme bag denne forskel forbliver ukendt [34]. Men en sådan observation tyder, at analyse af kun PPARy proteinniveauer fejlagtigt kan anvendes til at tilskrive cellulære virkninger eller modtagelighed til behandlinger.

TZD’er gjorde ikke øge endogen PPAR-aktivitet i disse celler, men TZD behandling øget luciferaseaktivitet når PPARy blev overudtrykt i OVCAR3 celler. Dette indikerer, at disse celler konstitutivt aktiverer PPARy og, når receptoren er stærkt rigelige, yderligere aktivering er mulig. Denne aktivering er ikke