PLoS ONE: epidermal vækstfaktor stimulerer Nuclear Factor-KB-aktivering og Hæm oxygenase-1 Expression via c-Src, NADPH oxidase, PI3K, og Akt i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

Forrige rapport viste, at epidermal vækstfaktor (EGF) fremmer tumorprogression. Flere undersøgelser viste, at vækstfaktorer kan fremkalde hæm oxygenase (HO) -1 udtryk, beskytter mod cellulær skade og kræft celleproliferation. I denne undersøgelse undersøgte vi inddragelsen af ​​c-Src, NADPH-oxidase, reaktive oxygenarter (ROS), PI3K /Akt, og NF-KB signalveje i EGF-induceret HO-1 ekspression i humane HT-29 coloncancer-celler . Behandling af HT-29-celler med EGF forårsagede HO-1 udtrykkes i koncentrations- og tidsafhængig opførsel. Behandling af HT-29 celler med AG1478 (en EGF-receptor (EGFR) inhibitor), lille interfererende RNA af EGFR (EGFR siRNA), en dominant negativ mutant af c-Src (c-Src DN), DPI (et NADPH oxidase inhibitor) , glutathion (en ROS inhibitor), LY294002 (a PI3K-inhibitor), og en Akt DN inhiberede EGF-induceret HO-1-ekspression. Stimulering af celler med EGF forårsagede en stigning i c-Src-phosphorylering ved Tyr406 i en tidsafhængig måde. Behandling af HT-29-celler med EGF inducerede en stigning i P47

phOx

translokation fra cytosolen til membraner. EGF-induceret ROS-produktion blev inhiberet af DPI. Stimulering af celler med EGF resulterede i en stigning i Akt phosphorylering ved Ser473, der blev inhiberet af c-Src DN, DPI, og LY 294002. Endvidere behandling af HT-29-celler med en dominant negativ mutant af IKB (IκBαM) inhiberede EGF -induceret HO-1-ekspression. Stimulering af celler med EGF induceret p65 translokation fra cytosolen til kerner. Behandling af HT-29-celler med EGF inducerede en stigning i KB-luciferaseaktivitet, der blev inhiberet af en c-Src DN, LY 294002, og en Akt DN. Endvidere blev EGF-induceret coloncancer celleproliferation inhiberes af Sn (IV) protoporphyrin-IX (SnPP, en HO-1-inhibitor). Samlet set viser disse resultater antyder, at c-Src, NADPH-oxidase, PI3K, og Akt signalveje spiller vigtige roller i EGF-induceret NF-KB-aktivering og HO-1-ekspression i HT-29-celler. Desuden overekspression af HO-1 medierer EGF-induceret tyktarmskræft celledeling

Henvisning:. Lien GS, Wu MS, Bien MY, Chen CH, Lin CH, Chen BC (2014) epidermal vækstfaktor stimulerer Nuclear Factor -κB Aktivering og Hæm oxygenase-1 Expression via c-Src, NADPH oxidase, PI3K, og Akt i Human Colon Cancer Cells. PLoS ONE 9 (8): e104891. doi: 10,1371 /journal.pone.0104891

Redaktør: Chuen-Mao Yang, Chang Gung University, Taiwan

Modtaget: Marts 25, 2014 Accepteret: 29 juni 2014; Udgivet: 14 August, 2014

Copyright: © 2014 Lien et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inkluderet i papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud (101TMU-WFH-02-1, 102TMU-WFH-01-1, og 103TMU-WFH-02-1) fra Taipei Medical University-Wan Fang Hospital. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Omkring en million tilfælde af tyktarmskræft er diagnosticeret på verdensplan hvert år, og en stigende tendens i forekomsten af ​​tyktarmskræft i asiatiske lande blev rapporteret i de senere år [1]. Tidligere rapporter viste, at indtagelsen af ​​rødt og forarbejdet kød er forbundet med en øget risiko for tyktarmskræft fordi rødt kød indeholder ca. 10 gange højere niveauer af hæm end hvidt kød [2]. Hæm oxygenase (HO) spiller afgørende roller i fysiologisk jern homeostase, antioxidant forsvar, og kræft celledeling [3]. HO katalyserer omdannelsen af ​​hæm til biliverdin, frigive ækvimolære mængder carbonmonoxid, og samtidig induktion af jern-sekvestrerende ferritin [4]. Tre isoformer af HO (HO-1, -2 og -3) blev identificeret [5]. HO-1 er et inducerbart enzym forårsaget af vækstfaktorer, herunder transformerende vækstfaktor (TGF) -β og epidermal vækstfaktor (EGF), hvilket afspejler den vigtigste rolle af dette enzym i beskyttelse mod oxidativ skade [6], [7]. Desuden HO-1 er ofte højt opreguleret i tyktarmskræft sammenlignet med omgivende normale væv, hvilket antyder, at kræftceller stærkt udtrykker HO nyde en vækst fordel og give cellulær modstand mod reaktive ilt arter (ROS) medierede anticancer behandlinger [8] – [10 ].

betydningen af ​​EGF i udviklingen af ​​tyktarmskræft blev understreget i de senere år [11]. En voksende mængde beviser tyder på, at EGF regulerer flere biologiske funktioner såsom kræft celle progression, celledeling, og metastase [11]. EGF-receptoren (EGFR) blev vist at deltage i tyktarmskræft udvikling [11]. EGF binder til det ekstracellulære domæne af EGFR som aktiverer nedstrøms signalveje herunder c-Src og phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt pathways [12], [13]. En tidligere rapport viste, at overekspression af HO-1 spiller en beskyttende rolle i formildende cellulære skader og kræft celle overlevelse [6], [7]. Imidlertid vides der kun lidt om, hvordan EGF regulerer induktionen af ​​HO-1-protein-ekspression.

Angivelse af

HO-1

gen er primært reguleret på transkriptionsniveauet ved at aktivere transkriptionsfaktorer, herunder nukleare faktor (NF) -κB, aktiverende protein (AP) -2, og varmechok-responsive element (HSE) [14], [15]. NF-KB er en vigtig transkriptionsfaktor til regulering HO-1-ekspression [16]. I hvile, NF-KB-binding til kBa forhindrer NF-KB nuklear translokation og transkription aktivitet [17]. Imidlertid vækstfaktorer inducerer IKB kinase (IKK) aktivering, kBa phosphorylering, og kBa nedbrydning. Denne proces frigiver aktive NF-KB, som derefter translokeres fra cytosolen til kerner, til at binde HO-1-promotorområdet og inducere

HO-1

genekspression [16], [18]. Adskillige rapporter har vist, at EGF-induceret NF-KB-aktivering sker gennem flere EGFR-afhængig signalmolekyler, herunder PI3K, proteinkinase C (PKC), og IKK signalveje [19]. Vores tidligere undersøgelse viste, at TGF-β inducerede HO-1-ekspression via PI3K /Akt-afhængig NF-KB-signalering pathway [6]. Imidlertid vides der kun lidt om signaltransduktionshændelse; i særdeleshed er c-Src, NADPH oxidase, ROS, og PI3K /Akt veje, der fører til aktivering af NF-KB og udtryk for HO-1 ved EGF-stimulering, ikke velbeskrevet.

Flere undersøgelser viste, at c-Src og NADPH oxidase spiller vigtige roller i at inducere genekspressioner [20], [21]. En tidligere rapport demonstrerede, at thrombin inducerede HO-1 ekspression og var afhængig af c-Src-medieret NF-KB-aktivering [20]. Det blev for nylig opdaget, at NADPH-oxidase af ROS produktion er en defensiv reaktion af en vært for apoptose og celletransformation [22]. NADPH oxidase reguleres af p47

phOx

som er i stand til at understøtte aktivering af NADPH oxidase [23]. Det kendt, at EGF stimulerer NADPH oxidase aktivitet til fremstilling superoxid, og det dannede superoxid er hurtigt dismutated til H

2O

2, hvilket fører til EGF-inducerede fysiologiske reaktioner [24]. Men lidt oplysninger om den rolle af NADPH oxidase i regulering af NF-KB-aktivering og HO-1-ekspression efter EGF-stimulering i humane colon cancerceller. Vores resultater viste, at EGF udløsning af c-Src, NADPH-oxidase, ROS, og PI3K /Akt signalveje, der fører til aktivering af NF-KB spiller en vigtig rolle i EGF-induceret HO-1-ekspression i human lunge colon cancerceller. Desuden HO-1 er involveret i EGF-induceret coloncancer celleproliferation.

Materialer og metoder

Materialer

EGF opnåedes fra PeproTech (London, UK). LY 294002, diphenyleneiodonium chlorid (DPI), glutathion, og 2 ‘, 7’-dichloroflurorescein diacetat (DCF-DA) blev købt hos Sigma (St. Louis, MO, USA). En dominerende negativ mutant (DN) i kBa (IκBαM) blev købt fra Clontech (Mountain View, CA, USA). pGL2-ELAM-Luc (som er under kontrol af en NF-KB-bindingssted) og pBK-CMV-Lac Z blev venligst stillet til rådighed af Dr. Wan-Wan Lin (National Taiwan University, Taipei, Taiwan). En DN af Akt (Akt DN) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Che-Ming Teng (National Taiwan University, Taipei, Taiwan). PcDNA plasmidet blev tilvejebragt af Dr. M.-C. Chen (Taipei Medical University, Taipei, Taiwan). A c-Src DN blev erhvervet fra Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Føtalt kalveserum (FCS), penicillin /streptomycin, og Lipofectamine Plus reagens blev købt hos Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). Sn (IV) protoporphyrin-IX (SnPP) blev indkøbt fra Frontier Scientific (Logan, UT, USA). Styr lille forstyrrende (si) RNA, EGFR siRNA, og antistoffer specifikke for HO-1, c-Src, P47

phOx

, Akt1 /2, EGFR, Na

+ /K

+ ATPase, p65, kBa, og anti-muse og anti-kanin-immunoglobulin G (IgG) -konjugerede peberrod peroxidaser (HRPs) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Akt phosphoryleret ved Ser473 og c-Src phosphoryleret ved Tyr416 blev erhvervet fra New England Biolabs (Beverly, MA, USA). Lamin A /C blev købt fra GeneTex (Ipswich, CA, USA). AG1478 og BrdU celleproliferationsassay kit blev indkøbt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Alle materialer til natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) blev indkøbt fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA).

Cellekultur

HT29 humane coloncancer-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Livingstone, MT, USA), og cellerne blev opretholdt i RPMI 1640 indeholdende 10% FCS, 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin i en befugtet 37 ° C inkubator. Efter at have nået konfluens blev celler podet på 6 cm-skåle til Western blotting og en revers transkription polymerasekædereaktion (RT-PCR), på plader med 12 brønde til celletransfektion og KB-luciferaseaktivitet assay og på plader med 96 brønde for BrdU celledeling og ROS generation analyser.

Western blot-analyse

for at bestemme udtryk for HO-1, c-Src phosphoryleret ved Tyr416, Akt phosphoryleret ved Ser473, c-Src, Akt1 /2, og EGFR i HT-29-celler blev proteiner ekstraheret, og et Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [6]. Kort fortalt, HT-29-celler blev dyrket i 6 cm-skåle. Efter at have nået konfluens, blev vækstmediet fjernet og erstattet med 2 ml RPMI 1640 uden FCS i 24 timer. Cellerne blev behandlet med køretøjet og EGF, eller forbehandlet med specifikke inhibitorer som angivet efterfulgt af EGF. Efter inkubation blev cellerne vasket to gange i iskold phosphatpufret saltvand (PBS) og solubiliseret i lysepuffer indeholdende 10 mM Tris (pH 7,0), 140 mM NaCl, 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 5 mM dithiothreitol, 0,5% NP-40, 0,05 mM pepstatin A, og 0,2 mM leupeptin. Prøver af lige store mængder af protein (50 ug) blev underkastet SDS-PAGE og derefter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran, som derefter blev inkuberet i Tris-bufret saltvand med 0,1% Tween-20 (TBST) puffer indeholdende 5% bovint serum albumin. Proteiner blev visualiseret ved specifikke primære antistoffer og derefter inkuberet med HRP-konjugeret sekundære antistoffer. Immunoreaktiviteten blev påvist under anvendelse forøget kemiluminescens i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kvantitative data blev opnået ved hjælp af en computer densitometer videnskabelige billeddannende systemer (Eastman Kodak, Rochester, NY, USA).

RNA ekstraktion og RT-PCR

For at forstærke menneskelig coloncancer celle HO- 1-mRNA, specifikke primere syntetiseret. De HO-1 anvendte primere var: sense 5′-CTG TGT AAC CTC TGC TGT TCC-3 ‘og antisense 5′-CCA CAC TACCTG AGT CTA CC-3’. p-actin mRNA-niveauer blev anvendt som en intern kontrol. P-actin anvendte primere var: sense 5′-GAC TAC CTC AAG ATC CT-3 ‘og antisense 5′-CCA CAT CTG CTG GAA GGT GG-3’. HT-29 celler podedes på 6 cm-skåle. Efter at have nået konference blev mediet aspireret og erstattet med basalt medium uden FBS natten over, hvorefter cellerne blev stimuleret med EGF i forskellige tidsintervaller. Totalt RNA blev oprenset under anvendelse af TRI REAGENT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA), og en RT-PCR udført ved anvendelse af en RT-PCR-kit (Epicentre, Madison, WI, USA), ifølge producentens anvisninger ved hjælp 10 pi total RNA som en skabelon. Lige store mængder (10 ug af cDNA) af hvert PCR-produkt blev PCR-amplificeret med Tag-polymerase i 35 cykler bestående af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 58 ° C, og 1 min ved 72 ° C. Det amplificerede cDNA blev kørt på 2% agarosegeler og visualiseret med ethidiumbromid. RT Prøverne blev også anvendt til at generere β-actin PCR-produkter og deres mængde blev anvendt som en intern kontrol. Salg

transfektion og den KB-luciferase assay

HT-29-celler (2 x 10

5) podedes på plader med 12 brønde, og celler blev transficeret den følgende dag under anvendelse af lipofectamin Plus reagens indeholdende 0,5 ug pGL2-ELAM-Luc og 0,5 ug pBK-CMV-Lac Z. Efter 24 timer mediet blev aspireret og erstattet med frisk RPMI 1640 uden FCS, og derefter blev cellerne stimuleret med EGF (0,3-10 ng /ml) i yderligere 24 timer før de blev høstet. For at vurdere virkningerne af de angivne inhibitorer, blev medikamenter tilsat til celler 20 minutter før tilsætning af EGF. For at vurdere virkningerne af c-Src DN og Akt DN blev celler cotransficeret med pGL2-ELAM-Luc og pBK-CMV-Lac Z. Luciferaseaktivitet blev bestemt med et luciferase-assay-systemet (Promega, Madison, WI, USA), og blev normaliseret på grundlag af Lac Z-ekspression. Niveauet af induktion af luciferaseaktivitet blev sammenlignet i forhold til celler med og uden stimulering.

Analyse af P47

phOx

translokation

For at detektere P47

phOx

translokation, blev cytosoliske og membranfraktioner adskilt som tidligere beskrevet [25]. Kort fortalt blev HT-29-celler behandlet med EGF i de angivne koncentrationer eller for de forskellige tidsintervaller. Efter inkubering blev celler anbragt på is, skyllet med PBS, resuspenderet i homogeniseringsbuffer (20 mM Tris-HCI, 0,5 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF og 10 pg /ml leupeptin (pH 7,5) ) og sonikeret. Lysatet blev adskilt i cytosol og membranfraktioner ved centrifugering ved 40.000 ×

g

i 45 min. Niveauer af P47

phOx

protein i cytosoliske og membranfraktioner blev bestemt ved en Western blot-analyse. α-tubulin og Na

+ /K

+ ATPase blev henholdsvis anvendt som den interne kontrol af cytosol og membran fraktioner.

Analyse af p65 translokation

For at detektere p65 translokation , HT-29-celler blev behandlet med EGF i de angivne koncentrationer eller for de forskellige tidsintervaller. De cytosoliske og nukleare proteinfraktioner blev derefter separeret som tidligere [25] beskrevne. Kort fortalt blev HT-29-celler vasket med iskold PBS, og pelleteret. Cellepellets blev resuspenderet i hypotonisk puffer (10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCI, 0,5 mM DTT, 10 mM aprotinin, 10 mM leupeptin, og 20 mM PMSF) i 15 minutter på is, og hvirvelbehandlet i 10 s. Kerner blev pelleteret ved centrifugering ved 15.000 ×

g

i 1 min. Supernatanter indeholdende cytosoliske proteiner blev opsamlet. En pellet indeholdende kerner blev resuspenderet i hypertonisk puffer (20 mM HEPES (pH 7,6), 25% glycerol, 1,5 mM MgCl

2, 4 mM EDTA, 0,05 mM DTT, 10 mM aprotinin, 10 mM leupeptin, og 20 mM PMSF ) i 30 minutter på is. Supernatanter indeholdende nukleare proteiner blev opsamlet ved centrifugering ved 15.000 ×

g Salg i 2 min. Proteinniveauer af p65 i de cytosoliske og nukleare fraktioner blev bestemt ved Western blot analyse. α-tubulin og lamin A /C blev henholdsvis anvendt som cytosolen og nukleare interne kontroller.

Bestemmelse af ROS produktion

ROS blev bestemt som tidligere [26] beskrevet. Kort fortalt blev HT-29-celler podes på 96-brønds plader i RPMI 1640 indeholdende 10% FCS natten over. Den næste dag blev mediet aspireret og erstattet med frisk RPMI 1640 uden FCS. Efter 24 timer blev celler behandlet med ROS-sensitive DCF i 15 min, og derefter stimuleret med EGF i angivne koncentrationer eller til forskellige tidsintervaller. For at analysere virkningen af ​​DPI (10 uM) blev lægemidlet tilsat til celler 20 minutter før tilsætning af EGF. Fluorescensen blev bestemt med et Varioskan Flash fluorescens-pladelæser (Thermo Electron Corporation, Marietta, OH, USA) med excitation ved 485 nm og emission ved 528 nm.

BrdU celleproliferationsassay

HT -29 celler (7,5 x 10

3 celler /brønd) blev podet på plader med 96 brønde i RPMI 1640 indeholdende 10% FCS. Den næste dag blev mediet aspireret og erstattet med frisk RPMI 1640 uden FCS natten over. Celler blev forbehandlet med SnPP (3 uM) i 20 minutter, og derefter stimuleret med EGF (10 ng /ml) i yderligere 48 timer. BrdU blev tilsat til cellerne i de sidste 2 timer af inkubation. Efter fjernelse mærkning medium blev celler fikseret og DNA blev denaturized. Den inkorporerede BrdU blev mærket med et monoklonalt anti-BrdU-antistof og et gede-anti-muse-antistof konjugeret med peroxidase. Immune komplekser blev detekteret ved den efterfølgende substratreaktionen og kvantificeres ved måling af absorbansen ved 450 nm under anvendelse af en mikropladelæser.

Statistisk analyse

Resultater er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien ( SEM) fra mindst tre uafhængige forsøg. En envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af, når det er passende, blev Dunnetts multiple sammenligninger test anvendes til at bestemme den statistiske signifikans af forskellen mellem middel. En

s

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

EGF inducerer HO-1-ekspression i HT-29 celler

Mange undersøgelser afslørede, at HO-1-ekspression spiller en vigtig beskytte aganist cancer celledød. Humane HT-29 coloncancer-celler blev valgt til at undersøge signalveje af EGF i HO-1-ekspression. Behandling med EGF (1~10 ng /ml) i 18 timer inducerede HO-1 protein ekspression i en koncentrationsafhængig måde (figur 1A.); denne induktion forekom også i en tidsafhængig måde, der begynder ved 8 h og når et maksimum på 12~18 timer (fig. 1B). Efter 18 timers behandling med 10 ng /ml EGF, havde HO-1 protein steg med 185 ± 11% (fig. 1B). Dernæst vi afgøres, om EGF kan fremkalde HO-1 mRNA-ekspression. Efter behandlingen var induktion af HO-1-mRNA blev påbegyndt i 2 timer og nåede et maksimum på 4 timer efter EGF (10 ng /ml) behandling (fig. 1C). Som tidligere nævnt, EGFR er nødvendig for EGF responser. For at undersøge, om EGFR er involveret i EGF-induceret HO-1-ekspression blev AG1478 brugt. Figur 1D viser, at forbehandling af HT-29-celler med AG4178 (10 uM) inhiberede fuldstændigt EGF-induceret HO-1 ekspression (

n =

3). For yderligere at bekræfte rolle EGFR i EGF-induceret HO-1-ekspression, blev EGFR siRNA anvendes. Som vist i fig. 1E, transfektion med EGFR siRNA (25 nM) også fuldstændig hæmmet EGF-induceret HO-1 ekspression (

n

= 3) (fig. 1E). For at bekræfte resultaterne af EGFR siRNA eksperiment, vi også brugt EGFR siRNA til at undertrykke EGFR protein-ekspression i HT-29 celler. Vi fandt, at EGFR siRNA markant inhiberede EGFR-proteinekspression (fig. 1F). Disse resultater antyder, at EGFR er involveret i EGF-induceret HO-1-ekspression i HT-29-celler.

A blev HT-29-celler inkuberet med forskellige koncentrationer af EGF i 18 timer, og derefter HO-1 og a-tubulin-proteinniveauer blev bestemt. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± SEM. *

s

0,05, sammenlignet med kontrolgruppen. B blev celler inkuberet i forskellige tidsintervaller med EGF (10 ng /ml), og derefter HO-1 og a-tubulin proteinniveauer blev bestemt. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± SEM. *

s

0,05, sammenlignet med kontrolgruppen. C, Celler blev behandlet i forskellige tidsintervaller med EGF (10 ng /ml). Totalt RNA blev fremstillet, og en RT-PCR blev udført som beskrevet i “Materialer og metoder”. Taces repræsenterer resultater fra tre uafhængige eksperimenter. D, Celler blev forbehandlet i 30 minutter med 10 uM AG1478 og derefter stimuleret med 10 ng /ml EGF i yderligere 18 timer. Efter inkubation blev HO-1 og a-tubulin proteinniveauer bestemt. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± SEM.

* p

0,05, sammenlignet med behandling EGF. E, Celler blev kortvarigt transficeret med 25 nM kontrol siRNA (con siRNA) eller 25 nM af EGFR siRNA i 24 timer og derefter stimuleret med EGF (10 ng /ml) i yderligere 18 timer. Celler lysater blev fremstillet og derefter immunoblottedes med antistoffer for HO-1 eller α-tubulin. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± S.E.M.

* p

0,05, sammenlignet med behandling EGF. F, Celler blev forbigående transficeret med 25 nM kontrol siRNA (con siRNA) eller 25 nM af EGFR siRNA i 24 timer. Helcellelysater blev fremstillet og derefter immunoblottedes med antistoffer for EGFR eller α-tubulin. Spor repræsenterer resultater fra tre uafhængige forsøg.

c-Src er involveret i EGF-induceret HO-1-ekspression i HT-29 celler

For at undersøge, om c-Src, en downstream proteinet af EGFR [12], kan spille en afgørende rolle i EGF-induceret HO-1-ekspression, blev en c-Src DN anvendte plasmid. Som vist i fig. 2A, transfektion af HT-29-celler med c-Src DN (0,5 ug) inhiberede EGF-inducerede stigning i HO-1-ekspression med 91 ± 6% (

n

= 3). Desuden blev niveauet af c-Src-protein stærkt udtrykt i c-Src DN plasmid-transficerede HT-29 celler sammenlignet med pcDNA plasmid-transficerede HT-29-celler (fig. 2B). Regulering af c-Src-aktivering forekommer som et resultat af phosphorylering af multiple sites på specifikke rester, herunder Tyr416 [25]. Dernæst vi undersøgt yderligere c-Src-phosphorylering ved Tyr416 af EGF-stimulering i HT-29-celler under anvendelse af anti-phospho-c-Src antistof ved Tyr416. Figur 2C viser, at behandling af HT-29 celler med 10 ng /ml EGF inducerede en stigning i phosphorylering af c-Src ved Tyr416 i en tidsafhængig måde. Phosphorylering af c-Src på Tyr416 begyndte på 0,5 min og blev opretholdt indtil 30 min efter EGF stimulering (Fig. 2C, øverste panel). Proteinet niveau af c-Src blev ikke påvirket af EGF-stimulering (Fig. 2C, nederste panel). Disse resultater antyder, at c-Src aktivering kræves for EGF-induceret HO-1-ekspression.

A blev HT-29-celler transient transficeret med 0,5 ug pcDNA eller 0,5 pg af en dominant negativ mutant af c- src (c-src DN) i 24 timer. Celler blev behandlet med EGF (10 ng /ml) i yderligere 18 timer. Efter inkubation blev HO-1 og a-tubulin proteinniveauer bestemt. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± SEM.

* p

0,05, sammenlignet med behandling EGF. B, Celler blev transient transficeret med enten 0,5 ug pcDNA eller 0,5 ug af c-Src DN i 24 timer. Niveauer af C-Src eller a-tubulin protein udtryk blev bestemt ved en Western blot-analyse. Spor viser resultater fra tre uafhængige eksperimenter. C, HT-29-celler blev inkuberet med 10 ng /ml EGF i 0~30 min. Cellelysater fremstilledes, og c-Src Tyr416 phosphorylering blev bestemt ved immunblotting under anvendelse af en phospho-c-Src Tyr416 antistof. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg med lignende resultater.

Inddragelse af NADPH oxidase og ROS i EGF-induceret HO-1-ekspression i HT-29 celler

c-Src kunne aktivere en antal signalveje, herunder NADPH oxidase [27]. En tidligere undersøgelse viste, at HT-29-celler overvejende udtrykt NADPH oxidase 1 [28]. For at bestemme om NADPH oxidase spiller en afgørende rolle i EGF-induceret HO-1 ekspression, NADPH oxidase inhibitor, DPI [29], blev anvendt. Figur 3A viser, at EGF-induceret HO-1-ekspression blev inhiberet af DPI (3 og 10 uM) i en koncentrationsafhængig måde. Når HT-29-celler blev behandlet med 10 pM DPI, EGF-induceret HO-1-ekspression blev inhiberet med 86 ± 13% (

n =

3) (fig. 3A). En tidligere undersøgelse viste, at induktion af P47

phOx

translokation fra cytosolen til membraner resulterede i en stigning i NADPH-oxidase-aktivitet [27]. Dernæst forsøgte at bestemme, om EGF aktiverer NADPH-oxidase ved at undersøge translokationen af ​​P47

phOx

fra cytosolen til membranen fraktion anvendelse af Western blot-analyse. Stimulering af celler med 10 ng /ml EGF for 0~30 min resulterede i translokation af P47

phOx

fra cytosol fraktion til fraktion membranen begynder ved 3 min, effekten blev opretholdt til 10 min, og faldt med 30 min (fig. 3B). Endvidere fandt vi, at inkubation af celler med EGF (1~10 ng /ml) frembragte en koncentrationsafhængig stigning i translokationen af ​​P47

phOx

fra den cytosoliske fraktion til membranen fraktion (fig. 3C). En tidligere undersøgelse antydede, at NADPH-oxidase-genereret ROS produktion deltager i signalvejen, der fører til induktion af HO-1 ekspression ved behandling med en cigaret røgekstrakt [29]. For at undersøge, om ROS kunne mægle EGF-induceret HO-1-ekspression blev glutathion brugt. Som vist i fig. 3D, behandling af celler med glutathion (3~10 mM) markant inhiberede EGF-induceret HO-1-ekspression. Når celler blev behandlet med 10 mM glutathion, blev EGF-induceret HO-1-ekspression er svækket ved 91 ± 6% (

n

= 3). (Fig. 3D). Disse resultater antyder, at NADPH-oxidase og ROS er involveret i EGF-induceret HO-1 ekspression i humane coloncancer-celler.

HT-29-celler blev forbehandlet i 30 minutter med 3~10 pM DPI (A) og 3 -10 mM glutathion (D) og derefter stimuleret med 10 ng /ml EGF. Efter en 18 timer inkubation blev HO-1 og a-tubulin proteinniveauer bestemt. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± SEM.

* p

0,05, sammenlignet med behandling EGF. HT-29-celler blev behandlet med 10 ng /ml EGF i de angivne tidsintervaller (B) eller behandlet med forskellige koncentrationer af EGF (C). De cytosoliske og membranfraktioner blev derefter isoleret, og proteinniveauer af P47

phOx

i cytosoliske og membranfraktioner blev bestemt ved en Western blot-analyse. Na

+ /K

+ ATPase og α-tubulin blev henholdsvis anvendt som membranen og cytosol interne kontroller. Typiske spor repræsenterer tre eksperimenter med lignende resultater.

NADPH oxidase er involveret i EGF-induceret ROS produktion i HT-29 celler

En tidligere rapport påvist, at EGF inducerede en stigning i ROS generation i HT-29 celler [30]. Dernæst undersøgte vi rollen af ​​NADPH-oxidase i EGF-induceret ROS-produktion. Figur 4A og 4B viser, at behandling af HT-29-celler med EGF inducerede en forøgelse af ROS-generering i tids- og koncentrationsafhængige måder (fig. 4A, 4B). Efter 20 min af behandling med 10 ng /ml EGF, havde ROS produktion steg med 62 ± 5% (

n

= 3) (fig. 4B). Endvidere forbehandling af celler med DPI (10 uM) markant inhiberede EGF-induceret ROS-generering ved 85 ± 8% (

n

= 3) (fig. 4C). Disse resultater antyder, at NADPH-oxidase medierer EGF-induceret ROS-produktion i HT-29-celler.

HT-29-celler blev inkuberet i forskellige tidsintervaller med EGF (10 ng /ml) (A) eller inkuberet med EGF ( 1~10 ng /ml) i 20 minutter, og derefter ROS-produktion blev bestemt. Data er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± S.E.M. *

s

0,05, sammenlignet med kontrolgruppen. C, HT-29-celler blev forbehandlet i 30 minutter med 10 uM DPI og derefter stimuleret med 10 ng /ml EGF. Efter 20 minutters inkubation blev ROS produktion bestemt. Data er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± S.E.M.

* p

. 0,05, sammenlignet med behandling EGF

PI3K /Akt er involveret i EGF-induceret HO-1-ekspression i HT-29 celler

en tidligere undersøgelse viste, at PI3K /Akt spiller en vigtig rolle i HO-1-ekspression [31]. At forstå sammenhængen mellem HO-1 ekspression af EGF og dens PI3K /Akt signalvej, PI3K-inhibitor (LY 294002) og en Akt DN, blev anvendt. Som vist i figur 5A, EGF-induceret HO-1-ekspression blev inhiberet med 10 pM LY 294002 ved 85 ± 8% (fig. 5A). Endvidere transfektion af HT-29-celler med 0,5 pg af Akt DN også inhiberede EGF-induceret HO-1-ekspression ved 78 ± 8% (fig. 5B). Desuden blev niveauet af Akt protein stærkt udtrykt i Akt DN plasmid-transficerede HT-29 celler sammenlignet med pcDNA plasmid-transficerede HT-29-celler (fig. 5C). Disse resultater antyder, PI3K /Akt-signalvejen er nødvendig for EGF-induceret HO-1-ekspression. Ser473 rest phosphorylering af Akt af en PI3K-afhængig signaleringsvej forårsager enzymatisk aktivering [32]. For at bekræfte den vigtige rolle, PI3K /Akt i HO-1-ekspression, vi bestemt Akt Ser473 fosforylering som reaktion på EGF. Som vist i figur 5D, behandling af HT-29 celler med 10 ng /ml EGF førte til tidsafhængig phosphorylering af Akt Ser473. Akt Ser473 fosforylering toppede på 5~10 min, og derefter var faldet med 20 min efter behandling EGF (fig. 5D, øverste panel). Proteinniveauer af Akt1 /2 blev ikke påvirket af behandling EGF (fig. 5D, nederste panel).

HT-29-celler blev forbehandlet i 30 minutter med 10 uM LY 294002 (A) eller blev kortvarigt transficeret med 0,5 ug pcDNA eller 0,5 pg af en dominant negativ mutant af Akt (Akt DN) (B) i 24 timer. Celler blev derefter stimuleret med EGF (10 ng /ml) i yderligere 18 timer. Efter inkubation blev HO-1 og a-tubulin proteinniveauer bestemt. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg, der præsenteres som middelværdi ± SEM.

* p

0,05, sammenlignet med behandling EGF. C, Celler blev transient transficeret med enten 0,5 ug pcDNA eller 0,5 ug af Akt DN i 24 timer. Niveauer af Akt eller a-tubulin protein udtryk blev bestemt ved en Western blot-analyse. Spor viser resultater fra tre uafhængige eksperimenter. D, HT-29-celler blev inkuberet med 10 ng /ml EGF i 0~60 min. Cellelysater fremstilledes, og Akt Ser473 phosphorylering blev bestemt ved immunblotting under anvendelse af phospho-Akt Ser473-antistof. Immunoblots er repræsentative for tre forsøg med lignende resultater.

c-Src, NADPH oxidase, og PI3K mægle EGF-induceret Akt fosforylering på Ser473 i HT-29 celler

Næste, vi undersøgte roller c-Src, NADPH oxidase, og PI3K i EGF-induceret Akt Ser473 fosforylering. Som vist i fig. 6, transfektion af HT-29-celler med en c-Src DN (0,5 ug) svækkede EGF-induceret Akt Ser473-phosphorylering (fig. 6A). Vi også undersøgt, om NADPH oxidase og PI3K mægle Akt fosforylering. Vi fandt, at EGF-induceret Akt Ser473-phosphorylering blev også inhiberet af DPI (10 uM) (fig. 6B). Tilsvarende blev EGF-induceret Akt Ser473 phosphohrylation også inhiberet af LY294002 (10 uM) (fig. 6C). Disse resultater antyder, at aktivering af c-Src, NADPH-oxidase, og PI3K forekommer opstrøms for Akt i EGF-inducerede signalvej.

HT-29-celler blev transient transficeret med 0,5 ug pcDNA eller 0,5 ug af et Som vist i fig.