PLoS ONE: Wnt og Hedgehog er kritiske Mediators af cigaretrøg-induceret Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald i verden, og mere end 90 % af lungekræfttilfælde er cigaretrøg-relaterede. Aktuelle behandlingsmuligheder er utilstrækkelige, fordi det molekylære grundlag for cigaret-induceret lungekræft er dårligt forstået.

Metodologi /vigtigste resultater

Her viser vi, at humane primære eller udødeliggjort bronkiale epitelceller udsat for cigaretrøg i otte dage i kultur hurtigt formere sig, show forankringsuafhængig vækst og danne tumorer i nøgne mus. Under anvendelse af denne model af de tidlige stadier af røg tumordannelse, undersøgte vi de molekylære ændringer, der fører til lungekræft. Vi observerede, at de embryonale signalveje medieret af Hedgehog og Wnt aktiveres af røg. Farmakologisk hæmning af disse veje blokeret den transformerede fænotype.

Konklusioner /Betydning

Disse eksperimenter giver en model, hvor de tidlige stadier af røg-induceret tumorigenese kan fremkaldes, og bør tillade os at identificere molekylære forandringer, denne proces. Resultater opnået hidtil viser, at røg-induceret lunge tumorer er drevet af aktivering af to embryonale regulatoriske veje, Hedgehog (Hh) og Wnt. Baseret på den nuværende og kommende tilgængelighed af lægemidler til hæmme Hh og Wnt signalering, er det muligt, at en forståelse af den rolle, Hh og Wnt i lungekræft patogenese vil føre til udvikling af nye behandlingsformer

Henvisning.: Lemjabbar-Alaoui H, Dasari V, Sidhu SS, Mengistab A, Finkbeiner W, Gallup M, et al. (2006) Wnt og Hedgehog er kritiske Mediators af cigaretrøg-induceret lungekræft. PLoS ONE 1 (1): E93. doi: 10,1371 /journal.pone.0000093

Academic Redaktør: Carl-Philipp Heisenberg, Max Planck Institut for Molekylær Cellebiologi og genetik, Tyskland

Modtaget: Oktober 4, 2006; Accepteret: November 9, 2006; Udgivet: December 20, 2006

Copyright: © 2006 Lemjabbar-Alaoui et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud R01 HL075602 og P01 HL024136 fra National Institutes of Health

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

The World Health Organization rapporterer, at cirka 1250 millioner mennesker ryger cigaretter på [1] daglig basis, og at rygning forårsager omkring 10 millioner dødsfald om året inden år 2030 [2]. Ca. en fjerdedel af disse dødsfald vil være fra lungekræft. Den molekylære patogenese for lungekræft er stadig uklar, men en gang forstået, kunne bane vejen for behandlinger.

Flere fremgangsmåder er blevet anvendt til at evaluere molekylære patogenese af cigaretrøg-induceret lungekræft [3]. Én fremgangsmåde anvender dyremodeller, hvor mus udsættes for røg dagligt i fem til ti måneder (for oversigt se [4]. Selv om tumorer udvikle sig i mus, de grundlæggende trin i tumorigenese har allerede fundet sted, og tumorer vise en mangfoldighed af genetiske abnormiteter. Endvidere , ingen dyrearter ryger cigaretter den måde mennesker gør. Gnavere, for eksempel, er obligate næse breathers, hvilket resulterer i en meget anderledes mønster for filtrering af partikler i næseborene og øvre luftveje end det, gennem munden vejrtrækning (dvs. cigaretrygning i . mennesker) således disse

in vivo

dyreforsøg giver ufuldkomne modeller for human eksponering Andre undersøgelser har vurderet de enkelte bidrag fra bestemte røgkomponenter, som menes at bidrage til tobak carcinogenese (f.eks 4- (methylnitrosamino). – 1- (3-pyridyl) -1-butanon (NNK), [5], [6] og benzo (a) pyren [7]. Denne fremgangsmåde er problematisk på grund af den iboende kompleksitet af cigaretrøg. det er således sandsynligt at den biologiske reaktion på en kompleks blanding, såsom cigaretrøg er ikke blot summen af ​​flere uafhængige toksiciteter.

en anden fremgangsmåde er at udvinde komponenter i røgen fra brændende cigaretter ved at boble den gennem en vandig opløsning. Sådanne præparater, betegnet cigaretrøg ekstrakt (CSE), er ofte blevet brugt som udgangsmateriale i forskellige systemer [8], [9]. Vigtigere, CSE indeholder de fleste af forbindelserne inhaleret af rygere. Således brug af denne type præparat røg i kultur er en vigtig og nyttig model til vurdering af cigaretrøg toksicitet.

I denne undersøgelse har vi udviklet en

in vitro

model til at vurdere fænotypisk ændringer i røg induceret tumorigenese, der er en hurtig, nem og reproducerbar assay, hvor dyrket bronchieepithelceller celler udsættes for CSE.

Resultater

Kronisk røg eksponering inducerer fænotypiske ændringer karakteristisk for tumorceller

Vi først efterlignede virkningerne af kronisk cigaretrøg eksponering ved gentagne gange at behandle ikke-kræft menneskelige bronchieepithelceller BEAS-2B celler [10] med CSE i kultur. Vi behandlede BEAS-2B celler til 0 til 8 dage med CSE efterfulgt af et opsving periode på tre uger. CSE inducerede en tidsafhængig toksicitet i BEAS-2B-celler (figur 1A). Vi genererede syv cellepopulationer, betegnet B1, B2, B3, B5, B6, B7 og B8, der hver repræsenterer celler, der forblev levedygtige efter den angivne eksponeringstid punkt i dage. B0 celler repræsenterer ubehandlede celler. De cellepopulationer, som følger af de få celler, der overlevede de toksiske virkninger af røg eksponering i 8 dage (B8 celler) erhvervede fænotypiske forandringer, som omfattede forbedret celleproliferation (figur 1B), og kortere fordobling gange.

Kronisk røg eksponering inducerer toksicitet og ændringer i forbindelse med cellulær transformation. A: Toksicitet forårsaget af røg eksponering. Vist er dyrkede BEAS-2B celler efter 0, 4 og 8 dages vækst i medium indeholdende røgekstrakt. B: Proliferation assay på cellelinjer dyrket i 1-5 dage, afledt af CSE-eksponerede celler ved 4 tidspunkter (0,3,7 og 8 dage). Fejl søjler repræsenterer ± middelfejl. * P 0,001. C: Cell-substrat adhæsionsassays på plast, placental collagen og fibronectin ved anvendelse af dyrkede BEAS-2B-celler efter det angivne tidspunkt i dages vækst i medium indeholdende røgekstrakt. Assays blev analyseret efter 60 minutter i kultur. Fejl- søjler repræsenterer S.E.M. n = 4 * P 0,001. D: cellemigration assays ved anvendelse af etablerede cellelinier efter 24 timer i kultur. Fejl søjler repræsenterer ± middelfejl. n = 4 * P 0,001. E: aktincytoskelet cellelinier B0 og B8 afbildes af fluorescerende mikroskopi under anvendelse af Alexa Fluor 594 phalloidin. Scale søjler repræsenterer 20 um.

CSE-eksponerede celler viste nedsat celle-substrat vedhæftning (figur 1C), øget celle migration (figur 1D) og ændrede morfologi og cytoskeletal struktur. B8 celler var mere afrundet og havde øget aggregering og viste ændrede fordeling af actin stress fibre, når farvet med Alexa Fluor 594-konjugeret phalloidin sammenlignet med de parentale modstykker (B0) (figur 1E). Ændringer blev også observeret for B6 og B7, men ikke for celler behandlet i kortere perioder. I overensstemmelse med disse data, RNA-analyse ved PCR, sammenligne B8 og deres forældres modstykke B0, viste aktivering af gener, der styrer celledeling, herunder cyklin D1 og c-myc (figur S1).

Kronisk røg eksponering inducerer forankring -uafhængige cellevækst og tumordannelse nøgne mus

Da de morfologiske vækst, vedhæftning og migration ændringer produceret af kronisk eksponering for CSE var minder om fænotyper er karakteristiske for oncogenically transformerede celler, næste spurgte vi, om CSE-behandlede celler var i stand til af forankringsuafhængig vækst ved dyrkning deraf i blød agar. Vi fokuserede på B8 celler, som havde den længste eksponering for CSE. Ved 10 dage, kolonier af CSE-eksponerede celler dannet i blød agar, hvilket bekræfter forankringsuafhængig vækst, hvorimod B0 celler ikke danne kolonier (figur 2A).

Kronisk røg eksponering inducerer vækst i blød agar og tumordannelse i nøgne mus. A: Anchorage uafhængighed blev analyseret ved evnen af ​​CSE-eksponerede celler til at vokse i blød agar. B0 eller B8 celler (1 x 10

3) blev dyrket i blød agar i 15 dage før fotografering. Kvantificering af kolonier er vist til højre. Resultater er repræsentative for 5 forsøg. B: tumordannelse i nøgne mus, 4 uger efter inokulation med B0 eller B8 celler. Pile viser store tumormasser dannet i mus injiceret med B8 celler. C: Afsnit af en repræsentativ tumor fra en mus podet med B8 celler farvet med H og E. D: Billeder af blød agar assays ved anvendelse HBE celler efter ingen røg eksponering (P0) eller inddrives HBE celler efter 8 dages CSE eksponering (P8) . Kvantificering af kolonier er vist til højre. Resultater er repræsentative for 5 forsøg. E: tumordannelse i nøgne mus, 4 uger efter inokulation med P0 og P8 celler. Pile viser store tumormasser dannet i mus injiceret med P8 celler. F: Afsnit af en repræsentativ tumor fra en mus podet med P8 celler farvet med H og E. Scale søjler repræsenterer 50 um.

Vi næste implanteret B0 eller CSE-behandlede (B1 til B8) celler i immundefekte mus (nøgen) at bestemme, om den onkogene transformation skred hele vejen til tumorigenicitet. Ingen tumorer blev dannet selv efter 3 måneder i nøgne mus injiceret med kontrolceller (B0) eller B1-B7-celler (data ikke vist) (n = 5 for hver cellelinie). Men alle mus (n = 5) implanteret med B8 celler udviklede tumorer med en latenstid på ca. 4 uger, hvilket indikerer en høj effektivitet af murin tumorigenicitet (figur 2B). Histologisk karakterisering bekræftede, at B8 cellerne dannede carcinomer. Tumorerne blev sammensat af variabelt mellemstore reder af polyhedrale celler, som var forbundet med tynde stromale tråde. Disse tumorceller var moderat pleiomorphic med former fra runde til aflange. Kerner blev fremtrædende og ofte flere. Mitotiske tal blev let ses (Figur 2C). Vi etableret fire tumorcellelinier fra B8 tumorer som beskrevet i Materialer og Metoder. Når disse celler blev inokuleret i nøgne mus dannede de tumorer på det injicerede sted med en kortere latenstid (1-2 uger) end de parentale celler (data ikke vist).

Røgeksponering inducerer transformation af humane primære epithelial celler

Da BEAS-2B er en SV40-immortaliserede bronkial epitelcellelinje, spurgte vi om røgen inducerede ændringer observeret i BEAS-2B celler kunne reproduceres i primære humane bronchiale epithelceller (HBE). CSE eksponering førte til en hurtig forandring i primære HBE celler som bekræftet af både

in vivo

og kultur eksperimenter. Vi isoleret cellelinjer fra HBE udsat for røg i 0-8 dage og betegnet dem P0-P8. P8 celler erhvervet evnen til at vokse i blød agar, mens ueksponerede kontrolceller ikke gjorde (figur 2D). P8 celler, men ikke deres parentale modstykker P0, viste aktivering af gener, der styrer celledeling, herunder cyclin D1 og c-myc (fig S1). Vigtigere, otte dages eksponering til CSE tilstrækkelig til at medføre malign transformation af HBE celler; P8 celler dannede tumorer i nøgne mus i 5 uger efter inokulering, hvorimod ueksponerede P0 kontrolceller ikke gjorde (figur 2E og 2F). Tilsammen viser disse data, at CSE kan forvandle ikke-kræft humane bronchieepithelceller ind i en kræft fænotype.

CSE inducerer Wnt og Hedgehog signalveje

Vi undersøgte næste mulige molekylære mekanismer bag overgangen til tumorvækst fremkaldt ved udsættelse for CSE. Den upassende genaktivering af embryonale signalveje i voksne celler, såsom Wnt [11], Hedgehog [12] og Notch [13], kan give en drivkraft for tumorvækst. Derfor har vi analyseret for Wnt, pindsvin og Notch aktivitet ved hjælp af luciferase journalister, som reagerer på de transkriptionsfaktorer, der repræsenterer den distale effektor arm af hver vej, beskæftiger TOPFLASH, Gli-luciferase og Hes-luciferase journalister henholdsvis.

Vi fandt, at størrelsen af ​​TOPFLASH reporter aktivitet steg progressivt med røg eksponering fra 1 til 8 dage (figur 3A), med B8 celler viser en 25 fold induktion sammenlignet med B0 celler. Gli-luciferase reporter aktiviteten også forøget ved langvarig eksponering tid til CSE, med B8 celler giver en 7 gange induktion løbet B0 celler (figur 3B). Derimod CSE-eksponering havde ingen virkning på Hes1-luciferaseaktivitet (figur 3C), hvilket indikerer, at Notch pathway ikke blev aktiveret i CSE-eksponerede celler.

Kronisk røg eksponering inducerer Wnt og hedgehog signalering pathways A : Wnt signaling assay af røg udsat Beas-2b cellepopulationer efter transfektion med TOPFLASH /FOPFLASH luciferase reporterkonstruktioner. B: Beas-2B-celler blev transficeret med Gli-TK eller TK alene at analysere Hh-signalering. C: Notch signalering assay i Beas-2b celler under anvendelse HES luciferase reporter. D, E og F: Samme som i A, B og C, under anvendelse af HBE cellepopulationer. Fejl søjler repræsenterer ± middelfejl. n = 6 * P 0,001.

Disse mønstre af reporter aktivitet blev også gentaget for forsøg udført med primære HBE-celler udsat for CSE. Både TOPFLASH (figur 3D) og Gli (figur 3E) reporter aktivitet steg progressivt med røg eksponering fra P1 til P8, mens der sås ingen signifikante forskelle for Hes-1 luciferaseaktivitet (figur 3F).

For at bekræfte, at reporteraktivitet afspejler et øget Wnt signalering, undersøgte vi subcellulære lokalisering af β-catenin. I overensstemmelse med et aktiveret Wnt /β-catenin pathway, observerede vi nukleare akkumulering af β-catenin i B8 og P8 celler ved immuncytokemi (figur 4A og B). Endvidere ved immunocytokemi var det klart, at Gli1 translokeres til kernerne i B8 og P8 celler demonstrerer Hh-aktivering (figur 4C og D).

Wnt og hedgehog signalering er knyttet til fænotypiske ændringer induceret ved kronisk eksponering røg. A: immunfarvning shows forhøjede niveauer af β-catenin (grøn) i kernen af ​​B8 celler sammenlignet med B0 celler og B: i kernen af ​​P8 celler sammenlignet med P0. C: Immunfarvning viser forøget ekspression af Gli (rød) i kernen af ​​B8 celler sammenlignet med B0 celler og D: i P8 celler i sammenligning med P0. Scale bar repræsenterer 20 um.

Da Wnt og HH veje er vigtige i embryonal og stamceller udvikling, vi spurgte, om nogen embryonale markører blev genaktiveret efter kronisk CSE eksponering. Især CSE-transformerede HBE og BEAS-2B celler udtrykte to stamcelle-specifikke markører, Stellar og Oct4 [14] (figur S2). Taget sammen indikerer disse resultater, at kronisk CSE eksponering inducerer de embryonale Wnt og HH signalveje samtidig at cellerne erhverver evnen til at vokse i blød agar og danne tumorer i nøgne mus.

Inhibitorer af Wnt og Hh påvirke transformation ved CSE

Vi næste brugte hæmmere til at afgøre, om disse aktiverede signalveje var ansvarlige for de funktionelle ændringer i CSE transformerede bronchiale celler. HH forløb-specifik inhibitor, cyclopamin undertrykte signifikant evne B8 og P8 celler til at danne kolonier i blød agar (figur 5A og B). Sulindac, et Wnt pathway-specifik inhibitor, også faldet kolonidannelse, men var noget mindre effektiv end cyclopamin. Derimod tomatidine, en inaktiv cyclopamin analog, NS-398 (a COX-2 blokker) og GSI (en potent Notch pathway inhibitor) var uden virkning.

Inhibitorer af Hh og Wnt-signalering blokeret forankringsuafhængig vækst og celle hyperproliferation af CSE eksponerede celler. A: Evnen af ​​kroniske røg udsatte celler (B8), eller B: (P8), til at vokse i blød agar i 15 dage blev analyseret efter behandling med tomatidine, cyclopamin, sulindac, NS398, GSI eller kontrol køretøj. Kvantificering af kolonier er vist til højre. Resultater er repræsentative for 5 forsøg. C: B0 og B8 celler i kultur efter behandling med tomatidine, cyclopamin, sulindac eller kontrol køretøj.

Behandling af B0 celler i monolagskultur med cyclopamin eller sulindac ændrede ikke ændringer i celle tæthed eller morfologi efter 6 dage i kultur i forhold til kontroller, der omfattede ubehandlede celler eller celler behandlet med tomatidine, NS 398 eller GSI (figur 5C). I modsætning hertil observerede vi en markant reduktion i celledensitet i B8 celler behandlet med cyclopamin eller sulindac, sammenlignet med ubehandlede celler eller celler behandlet med tomatidine. Celler behandlet med NS-398 eller GSI (data ikke vist) var uændrede. Størstedelen af ​​cyclopaminbehandlede B8 celler løsnet fra kulturen pladen under behandlingsperioden, og de få resterende celler dukkede aplastisk, dvs. ikke udviser vækst eller ændring i strukturen. Den forankringsuafhængig og monolag vækst af CSE-transformerede celler kræver således Hh-vejen og i mindre grad, Wnt-vejen. For at bestemme virkningsmekanismen af ​​Wnt og HH pathway hæmmere, evaluerede vi proliferation, levedygtighed og apoptose (fig S3 og S4). Brug af BrdU-inkorporering og cellelevedygtighedsassays at måle celleproliferation og annexin assays til evaluering celleapoptose, fandt vi, at hverken cyclopamin eller Sulindac producerede ændringer i B0 celler. Imidlertid cyclopamin inducerede markant apoptose i B8 celler, som blev ledsaget af en signifikant reduktion i celleproliferation. Sulindac behandling inducerede et beskedent, men signifikant stigning i B8 celle apoptose (dog mindre end cyclopamin) og en reduktion i celleproliferation. Kontrol behandlinger med kontrol medium indeholdende tomatidine eller DMSO alene var uden effekt. Disse resultater understøtter denne konklusion aktiveringen af ​​embryonale veje Wnt og Hh, men ikke Notch, er en stor bidragyder til spredning og overlevelse af CSE-transformerede celler.

Desuden behandling med enten cyclopamin eller sulindac afskaffet transkriptionelle aktivitet af Wnt-vejen bestemmes af TOPFLASH aktivitet i B8 celler (figur 6A), men var uden virkning i B0 celler. Tomatidine-behandlede celler viste ingen signifikante ændringer i TOPFLASH aktivitet, når sammenlignet med ubehandlede celler. Vigtigere, mens cyclopaminbehandling forårsagede signifikant reduktion i Hh pathway transcriptional aktivitet som målt med Gli-luciferaseaktivitet i B8 celler, sulindac var uden effekt på TOPFLASH aktivitet (figur 6B). Ingen af ​​lægemidlerne påvirkes B0 celler. Disse data antyder, at HH-vejen kan drive opstrøms for Wnt-vejen i B8 celler

Inhibering af Wnt og hedgehog signalering reducerer tumorstørrelse i nøgne mus A:. Virkning af Wnt og HH-inhibitorer på Wnt signalering i B0 vs . B8 celler under anvendelse TOPFLASH /FOPFLASH luciferase reporterkonstruktioner. B: Virkning af Wnt og HH inhibitorer på Hh-signalering i B0 vs B8 celler transficeret med Gli-TK eller TK alene. C: Repræsentative tumorer udskåret fra mus efter ingen behandling (con) eller efter 15 dages behandling med lægemidler som angivet. Grafer viser sammenligning af tumor volumen (cm

3) og vægt (gm). VEH er bærer alene. Fejl søjler repræsenterer ± middelfejl. n = 5 * P 0,001. D:. H og E farvning af repræsentative tumorer dannet i mus injiceret med B8 celler og behandlet med lægemidler, som angivet

CSE-behandlede HBE celler viste også eksponering tidsafhængig aktivering af hh og Wnt signalveje i reporter assays (figur 3) og ved nuklear akkumulering af β-catenin og Gli1 (figur 4). Igen inhibitorer af Hh og Wnt-signalering, men ikke Notch signalering inhibitorer (figur 5B og figur S5) blokerede deres forankringsuafhængig vækst og celle hyperproliferation. Disse resultater indikerer, at den transformerede fænotype af røg transformerede primære HBE-celler er også Hh og Wnt signalering afhængig.

Behandling med inhibitorer af Wnt og Hedgehog pathways reducerer væksten af ​​tumorer som følge af røg-transformerede bronchiale epithelceller i mus

Vi derefter bestemmes, hvis hæmme Wnt og HH veje vil påvirke

in vivo

vækst af tumorer induceret af CSE-transformerede celler. Nøgne mus med etablerede subkutane xenotransplantattumorer afledt fra B8 celler viste en 80% og 92% fald i tumormassen og volumen henholdsvis efter 15 dages cyclopaminbehandling sammenlignet med den ubehandlede kontrolgruppe og køretøjet behandlede gruppe (figur 6C). Ligeledes observerede vi en 53% og 72% fald i tumormassen og volumen henholdsvis sulindac-behandlede dyr sammenlignet med de ubehandlede kontroller. Desuden samtidig behandling med sulindac og cyclopamin (begge inhibitorer blev anvendt til halv koncentration anvendt i tidligere eksperimenter), resulterede i signifikant større reduktion i CSE-transformerede celleproliferation sammenlignet med enkelt behandlinger med hver inhibitor alene (figur S6). Histologiske analyser af de høstede tumorer afslørede en fibrotisk degeneration af tumorer i både cyclopaminbehandlede og sulindac behandlede grupper (figur 6D). Disse tumorer viste løs epitel aggregater med en stor mængde afbrudt mesenchyme. Tumorer fra ubehandlede kontroller eller vehikel-behandlede dyr afslørede en kompakt masse af epitelceller. Disse eksperimenter viste, at de embryonale signalveje Hh og Wnt er vigtige bidragydere til spredning, overlevelse og tumor dannelse af CSE transformerede BEAS-2B celler.

Diskussion

I dette studie har vi vist, at kronisk eksponering for cigaretrøg ekstrakt let kan beskadige lungeepitelceller, inducere hyperplasisk vækst, malign celletransformation og carcinogenese. Vores resultater viser, at primære humane bronchiale epitelceller og SV40-immortaliserede BEAS-2B-celler overlever 8 dage med gentagen CSE eksponering er udstyret med fænotypiske ændringer der er karakteristiske for oncogen transformation: ændring i vækstkinetik, øget celleproliferation, nedsat celle-substrat-adhæsion , øget migration aktivitet, forankringsuafhængig vækst, og, vigtigst, evnen til at producere tumorer i nøgne mus. Vi viser for første gang, at kronisk CSE eksponering effektivt kan omdanne ikke-kræft primær og udødeliggjort, humane bronchieepithelceller

in vitro

ind i en kræft fænotype. Denne fremgangsmåde giver et nyt værktøj til at studere udviklingen af ​​lunge tumorer.

Tumor progression generelt forekommer i tid og rum overlappende faser, bestående af præmaligne hyperplasi, dysplasi, carcinom

in situ

, og invasive kræft [15]. Virkningerne af røg eksponering forekommer også i etaper. Ved røg eksponering vi først se hyperproliferation af lungeceller. I tidligere arbejde, vi rapporterede, at denne celle hyperplasi blev fremkaldt af røg-induceret aktivering af epidermal vækstfaktor receptor [16]. Den resulterende lunge celle hyperplasi er skadelig, fordi addukter forårsaget af røg kræftfremkaldende producere mutationer under DNA-replikation. Vi har også observeret en tidlig induktion af ekspression af oncoproteinet Bcl2, et anti-apoptotisk protein, der regulerer celleoverlevelse (upubliceret observation). Tilsammen disse data dokumenteret røg-induceret transformation af normale bronchiale epitelceller til tumorigen celler i vores system.

Afvigende reaktivering af de udviklingsmæssige veje hh og Wnt har været impliceret i vækst kræft [11], [17 ]. I lungen, disse veje spiller en mangefacetteret rolle; deres aktivering er kritisk for udvikling af lungerne, mens deres deregulering kan føre til inflammatoriske sygdomme, såsom pulmonal fibrose og cancer transformation. β-catenin er en central aktør i Wnt-vejen, transmission Wnt signaler til kernen og kritisk at bidrage til tumorgenese gennem aktivering af onkogener (f.eks cyklin D1 og c-myc) eller via egne sporadiske mutationer (revideret i [18]. Vigtigere , Wnt /β-catenin komponenter er ofte muteret eller overudtrykt i lungecancerceller og deres inhibering inducerer apoptose i disse celler [19], [20].

Tidligere undersøgelser har vist, at akut luftvejsepitelceller restitution resulterer i udbredt aktivering af intraepithelial Hh-signalering, som angivet ved den markante ekspression af begge Hh ligander og den Gli transskriptionsfaktoren, som er effektoren komponent i Hh-signalering hos pattedyr [11]. i mennesker, småcellet carcinom, en dødelig luftvej malignitet stærkt forbundet med cigaretrøg eksponering, afhænger af aktiveringen af ​​Sonic Hh vej [11]. Denne vej er også aktiveret i humane lunge pladecarcinomer og nogle lunge adenokarcinomer forårsaget af cigaretrøg eksponering [12], [21].

vores resultater viser, at CSE eksponering aktiverer Wnt /β-catenin og Hh-signalering i bronkiale epitelceller. Endvidere stimulering af disse veje falder sammen med den fase, hvor cellerne erhverver evnen til at vokse i blød agar og danne tumorer i nøgne mus. Behandling af disse transformerede celler med Hh eller Wnt-inhibitorer blokeret kolonidannelse i blød agar, og mus inokuleret med røg-transformerede celler viste degeneration af tumorer, når de behandles med en af ​​disse inhibitorer. Disse resultater antyder, at Wnt /β-catenin og HH baner spiller en kausal rolle i initieringen, vedligeholdelse, proliferation og overlevelse af CSE-transformerede epitelceller.

Fra vores studier synes Wnt pathway aktivering at gå forud Hh pathway aktivering under kronisk CSE eksponering, som udledes af de iagttagelser, at cyclopaminbehandling stærkt reducerede Wnt signalering aktivitet i disse celler, men behandling med sulindac påvirkede ikke Hh-signalering. Desuden Hh vej synes at spille en relativt større rolle end Wnt signalering i opretholdelsen af ​​celledeling og celleoverlevelse i CSE-transformerede celler.

Således vores data argumentere for en hierarkisk og synergistisk forhold mellem Hh og Wnt signalveje i cigaretrøg-induceret lungekræft. Dette står i kontrast med en nylig rapport, at indiske Hh antagoniserer Wnt signalering i differentiere colon epitel og colon cancerceller [22]. Således kan eksistere forskellige relationer mellem disse embryonale veje inden for forskellige typer af tumorer.

Et vigtigt, men uløste spørgsmål er, om aktivering af disse embryonale veje er tilstrækkelig til at fremkalde lungekræft udvikling.

Vores resultaterne viser, at Wnt-vejen aktiveres i celler udsat for røg i kortere tid (≥2 dage) (figur 3A og D). Imidlertid kun 8 dages røg udsat celler var i stand forankringsuafhængig vækst og tumordannelse in vivo. Disse resultater indikerer, at Wnt-aktivering alene ikke er tilstrækkelig til at inducere fuld malign transformation af normale lungeceller. Efter aftale med dette, er det blevet vist, at Wnt vej er en fremmende faktor for human papillomavirus (HPV) -induceret menneskelig keratinocyt malign transformation. Alligevel denne undersøgelse viste også, at aktivering af Wnt-vejen i fravær af HPV ikke var tilstrækkelig til at inducere malign transformation [23].

Vores data viser også, at Hh-aktivering forekommer i celler gentagne gange udsat for røg i ≥ 7 dage i immortaliserede BEAS2B celler og ≥2 dage i ubearbejdet HBE-celler (figur 3B og E). Selv celleproliferation og overlevelse af disse celler kræves Hh aktivitet (data ikke vist), blev der ikke tumorer dannet selv efter 3 måneder i nøgne mus injiceret med B0-B7-celler eller P0-P7 celler (data ikke vist). Men alle mus der fik implanteret B8 eller P8 celler udviklede tumorer. Disse observationer hævder også, at Hh aktivering ikke er tilstrækkelig til at fremkalde fuld malign transformation af lungeceller.

Tilsammen vores resultater tyder på, at mens aktiveringen af ​​kanoniske Wnt og Hh vej er nødvendig for tumorigenese, andet røg-induceret genotypiske ændringer er også forpligtet til at skabe den fulde malign transformation af lungeceller.

Endelig vores resultater viser, at CSE-transformerede celler udtrykker stamcelle-specifikke markører. Nylig dokumentation antyder, at stamceller kan være kilden til mutantceller, der giver anledning til tumorer og opretholde deres vækst [24]. Tumorer kan opstå og vokse som et resultat af dannelsen af ​​cancer stamceller, som selv kan omfatte kun et mindretal af celler i en tumor, kan dog være kritisk for formeringen. Dette rejser muligheden for, at CSE udsættelse kan målrette stamceller eller fremkalde kræft stamceller formation. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at teste denne hypotese.

Disse resultater hæve den mulighed, at Wnt og HH pathway hæmmere kan være grundlag for nye lægemidler til behandling af rygning-induceret lungekræft.

Materialer og Methods

Cell Culture

Den humane bronkiale epitelcellelinie BEAS-2B (opnået fra ATCC) blev anvendt i disse undersøgelser. Disse celler er forankringsafhængige og ikke-tumorigen i nøgne mus. BEAS-2B-celler blev udviklet ved transformation med SV40 stort T-antigen. BEAS-2B-celler blev holdt i RPMI-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum og 1% (v /v) 10.000 enheder /ml penicillin /streptomycin i en atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

Primær human bronchial epitel (HBE) celler blev også anvendt i disse undersøgelser. Vi definerede primære (P0) -kulturer som celler udpladet direkte efter isolation. Bronchieepithelceller celler blev isoleret ved anvendelse af fremgangsmåder tidligere beskrevet [25], [26].