PLoS ONE: miR-24 Regulerer Apoptose ved Målretning Open Reading Frame (ORF) Region FAF1 i Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

microRNA (miRNA) er små ikke-kodende RNA, der regulerer beslægtede mRNA på post-transkriptionel fase. Flere undersøgelser har vist, at miRNA modulere genekspression i pattedyrceller ved baseparring til komplementære sites i 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af mål-mRNA’er.

Metodologi /vigtigste resultater

i den foreliggende undersøgelse blev mIR-24 syntes at målrette fas associeret faktor 1 (FAF1) ved binding til dets aminosyre- kodende sekvens (CDS) region for derved at regulere apoptose i DU-145-celler. Dette resultat understøtter en augmented model, hvor dyr miRNA kan udøve deres virkning ved binding til CDS region af målet mRNA. Transfektion af miR-24 antisenseoligonukleotid (miR-24-ASO) også induceret apoptose i HGC-27, MGC-803 og HeLa-celler.

Konklusioner /Betydning

Vi fandt, at miR-24 regulerer apoptose ved at målrette FAF1 i kræftceller. Disse resultater antyder, at MIR-24 kunne være et effektivt lægemiddel mål for behandling af hormon-ufølsomme prostatacancer eller andre former for kræft. Det fremtidige arbejde kan videreudvikle miR-24 til terapeutiske anvendelser i kræft biologi

Henvisning:. Qin W, Shi Y, Zhao B, Yao C, Jin L, Ma J, et al. (2010) miR-24 Regulerer Apoptose ved Målretning Open Reading Frame (ORF) Region FAF1 i kræftceller. PLoS ONE 5 (2): e9429. doi: 10,1371 /journal.pone.0009429

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: Januar 19, 2010; Accepteret: 4 Februar 2010; Udgivet: 25 februar 2010

Copyright: © 2010 Qin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Key Basic Research and Development Program (2005CB724602) og programmer fra Chinese Academy of Sciences (KSCX-2-SW-228 og KSCX1-YW-R-64). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mikroRNA (miRNA) er endogene, evolutionært bevaret lille (ca. 22 nt) ikke-kodende RNA, som har vist sig at regulere genekspression post-transkriptionelt [1], [2]. miRNA normalt regulerer ekspressionen af ​​deres målgener ved at nedbryde target mRNA-transkripter eller inhibering mRNA translation [3], [4]. miRNA er blevet impliceret i forskellige biologiske processer, herunder udviklingstoksicitet timing, mønsterdannelse og embryogenese, differentiering og organogenese, immunrespons, vækstkontrol og apoptose. Imidlertid målgenerne og funktioner fleste miRNA er stadig uklart [5] -. [9]

Tidligere undersøgelser har vist, at miRNA modulere genekspression i pattedyrceller ved baseparring til komplementære sites i 3′ utranslateret region (3′-UTR) af deres mål mRNA’er [4], [10], [11]. For nylig er det blevet påvist, at miRNA kan regulere target mRNA’er ved binding til aminosyresekvensen kodende sekvens (CDS) [12] – [14]

Apoptose er en form for programmeret celledød (PCD) at. forekommer i flercellede organismer. Visse typer af skader udløse en række biokemiske begivenheder, der fører til en karakteristisk cellemorfologi og død [15], [16]. Det er en veltilrettelagt cellulære mekanisme, der afbalancerer virkningerne af celleproliferation og celledød [17]. Det synes klart, at den stramme regulering af apoptotisk funktion gennem miRNA er kritisk i udvikling og andre cellulære processer. Adskillige miRNA, der regulerer apoptose, er blevet identificeret, men ingen af ​​dem regulerer apoptose ved at binde CDS region deres mål [17] – [22]. For nylig er det blevet påvist, at miRNA kan fungere som onkogener og tumor undertrykkere ved at målrette vigtige regulatorer af cellevækst [23] – [25].

en ny klasse af kemisk manipuleret oligonukleotider, betegnes som “antagomirs”, kan effektivt lukke munden endogene miRNA og er blevet brugt til at afskaffe afvigende ekspression af kræftpsykologisk miRNA [26], [27]. Dette viser en potentiel terapeutisk anvendelse til effektiv dæmpning af kræftpsykologisk miRNA i behandlingen af ​​visse former for kræft [9].

Fas-associeret faktor 1 (FAF1) er en komponent af død-fremkaldende signalering kompleks ( DISC) og interagerer med caspase-8 og FADD selvom det mangler “død motiver” typiske for apoptose proteiner [28]. Adskillige nyere undersøgelser har vist, at overekspression af FAF1 stimuleret apoptose i Jurkat-celler, L-celler og BOSC23 celler trods mangel af ydre død signal [28] – [30]. FAF1 har vist sig at spille en vigtig rolle i normal udvikling og neuronal celleoverlevelse, hvorimod FAF1 nedregulering kan bidrage til flere aspekter af tumorigenese [31]. Brug små interfererende RNA (siRNA) at målrette FAF1, blev det observeret, at nedregulering af FAF1 forbedret modtagelighed for apoptose udløst af CP [32].

Indtil videre vides det ikke, om FAF1 er reguleret af miRNA. Så vidt vi ved, har ingen undersøgelse undersøgte hvordan miRNA, der er målrettet CDS region af målgenet bidrager til tumor apoptose. I denne undersøgelse, viser vi, at miR-24 kan regulere menneskelig FAF1 (hFAF1) udtryk gennem binding til CDS region hFAF1 mRNA. Endvidere viser vi, at MIR-24 regulerer apoptose og proliferation i DU-145, HGC-27, MGC-803 og HeLa-celler ved at målrette FAF1 genet. Disse resultater antyder, at MIR-24 kunne være et potentielt lægemiddel målgen til behandling af hormon-ufølsomme prostatakræft og andre kræftformer.

Resultater

MIR-24-ASO-medieret Down -forordning af miR-24 fremkalder apoptose og Påvirker spredning i DU-145 celler

at udforske den funktionelle effekt af miR-24 på celle overlevelse, vi målte apoptose i DU-145 celler transficeret med miR-24-ASO . Nedregulering af MIR-24 ved MIR-24-ASO øget apoptose i DU-145-celler, som målt ved FACS-analyse af celler til propidiumiodid og annexin V-farvning (Fig. 1A). Staurosporin blev anvendt til at inducere apoptose 48 timer efter MIR-24-ASO transfektion. Apoptose var meget højere i DU-145 celler transficeret med miR-24-ASO end i celler transficeret med Negative Control NC-ASO (fig. 1B). Dernæst blev virkningen af ​​MIR-24 på proliferation af DU-145-celler undersøgt med en CCK8 optælling kit. Som forudsagt blev proliferationen af ​​DU-145-celler stærkt reduceret efter MIR-24 blev nedreguleret af MIR-24-ASO, muligvis på grund af apoptose induceret af MIR-24-ASO (fig. 1C). Ekspressionen af ​​caspase-8 blev også forhøjet i celler transficeret med MIR-24-ASO, mens caspase-8 var lidt beskyttet mod aktivering i celler overudtrykker MIR-24 (fig. 1D). Disse data antyder, at MIR-24 nedregulering i DU-145-celler kan inducere apoptose, eventuelt gennem caspase-8 pathway.

(A) DU-145-celler blev behandlet med 20 nM MIR-24-ASO eller NC-ASO i 48 timer. Apoptose blev målt ved FACS med Annexin V og propidiumiodid-farvning (n = 3 ± SE; *

s Restaurant 0,01). Nedregulering af MIR-24 induceret apoptose i DU-145-celler. (B) Apoptose blev induceret i 2 timer med 1 uM staurosporin, 48 timer efter transfektion 20 nM MIR-24-ASO eller NC-ASO (n = 3 ± SE; *

s Restaurant 0,01). Apoptose følsomhed steg betydeligt efter transfektion med miR-24-ASO. (C) Celleproliferation blev målt ved CCK-8 kit i de angivne tidspunkter efter transfektion med 20 nM MIR-24-ASO eller NC-ASO (n = 3 ± SE). Nedregulering af MIR-24 påvirkede proliferationen af ​​DU-145-celler. (D) Caspase-8-aktivering blev påvist ved western blot-analyse af pro-caspase 8 og den modne form af caspase-8 efter 24 timers behandling (som ovenfor). Caspase-8 blev aktiveret efter transfektion med MIR-24-ASO.

MIR-24 Regulerer FAF1 Gene ved binding til ORF regionen FAF1

Brug fremgangsmåder beskrevet af Karginov og kolleger [33] med nogle ændringer, fandt vi, at FAF1 er et formodet mål for miR-24. Analyse med RNA22 software (IBM) indikerede, at der ikke er nogen miRNA-bindingssted i 3’UTR region af FAF1 genet, men to formodede MIR-24 bindingssteder blev fundet i den åbne læseramme (ORF) region FAF1 (fig. 2A). Endvidere MIR-24 målsekvenser, især ‘seed-regionen «, på ORF regionen FAF1 viste sig at være yderst konserveret blandt otte arter (Fig. 2B),.

(A) RNA22 software blev anvendt at forudsige, at CDS region FAF1 mRNA huser to formodede mIR-24-bindingssteder. Sekvensen af ​​MIR-24, dets bindingssteder, og energier er vist. (B) De forudsagte bindingssteder FAF1 blev konserveret i otte forskellige arter. Baserne ændret i de mutante FAF1 konstruktioner er også vist. Rød: parrede baser; grøn: G: U pair; blå: mutant baser. (C) 293T-celler blev transficeret med et reporter vektor bestående af en luciferasegenet indeholdt vildtype eller muteret MIR-24 bindingssteder) i sin 3′-UTR-regionen (FAF1 /pGL3 eller FAF1-M12 /pGL3, 20 ng /brønd i hver plade med 24 brønde). Cellerne blev også transficeret med en CMV-Renilla luciferase vektor (20 ng /brønd i hver 24-brønds plade) som intern standard. Ekspression af luciferase indeholdende forudsagte MIR-24 bindingssekvenser blev reduceret ved behandling med 20 nM MIR-24-mimic sammenlignet med behandling med NC-mimic, medens luciferase indeholdende muterede sekvenser kunne ikke nedreguleret (n = 3 ± SE; *

s

0,01). (D) MIR-24 regulerer FAF1 genet. 293T-celler blev behandlet som angivet og transficeret med 100 ng pcDNA3.1-FAF1. Ekspressionen af ​​FAF1 blev nedreguleret efter transfektion med 20 nM MIR-24-efterligning og reddet efter 100 nM MIR-24-ASO transficeres. (E) Dosisafhængig undertrykkelse af FAF1 af miR-24 i 293T-celler. 293T-celler blev co-transficeret med 100 ng pcDNA3.1-FAF1 og 1, 5 eller 20 nM MIR-24-mimic efter 24 timer og immunblottet som ovenfor. (F) Mutant FAF1 kunne ikke nedreguleres ved transfektion med 1 nM eller 5 nM MIR-24-mimic i 24 timer. FAF1 blev nedreguleret smule efter transfektion med 20 nM MIR-24-mimic; dette måske fordi mutationen til FAF1 var noget lille.

For at teste, om miR-24 kunne regulere FAF1 ved binding til disse to forudsagt sites, fragmenter, der indeholder disse to sekvenser eller muterede sekvenser blev klonet i tre UTR region af luciferasegenet af reporter vektor pGL3, opkaldt FAF1 /pGL3 eller FAF1-M12 /pGL3 (fig. 2C). Disse luciferase reporter vektorer indeholdende MIR-24 responselementer eller muterede sekvenser blev co-transficeret ind 293T-celler med en NC-mimic kontrol eller MIR-24-mimic. Efterfølgende blev luciferase og Renilla-aktivitet i hver brønd målt. Det blev konstateret, at MIR-24 var i stand til at mindske luciferaseaktiviteten af ​​reporter vektor indeholdende MIR-24 responselementer, mens reporter indeholdende muterede sekvenser blev ikke nedreguleret (fig. 2C). Disse data viser, at MIR-24 kan nedregulere sine mål ved at binde til disse to forudsagte bindingssteder.

For at teste om MIR-24 formindsker ekspressionen af ​​FAF1, 293T-celler blev co-transficeret med MIR-24 efterligner og pcDNA3.1-FAF1. Som kontrol blev nogle celler co-transficeret med NC-efterligninger og pcDNA3.1-FAF1. Det blev konstateret, at MIR-24 efterligner faldt FAF1 proteinniveauer i en koncentrationsafhængig måde (fig. 2D og E). Desuden MIR-24-ASO, MIR-24 efterligner og pcDNA3.1-FAF1 blev co-transficeret ind i 293T-celler. Den nedregulering af FAF1 blev vendt af miR-24-ASO, men ikke af NC-ASO (fig. 2D).

For at bekræfte, at miR-24 regulerede FAF1 gen ved binding til de to forudsagde bindende lokaliteter af ORF, blev synonyme mutanter af disse to steder konstrueret (fig. 2B). De 293T-celler blev co-transficeret med MIR-24-efterligning og pcDNA3.1-FAF1. Mutanten FAF1 blev ikke nedreguleres ved transfektion af MIR-24 efterligner så meget som FAF1 /pCDNA3.1 gjorde (fig. 2F). Tilsammen antyder disse data, at miR-24 kan binde og regulere disse to respons elementer i CDS region af FAF1 genet.

miR-24 Regulerer Apoptose i DU-145 Celler ved Målretning af FAF1 Gene

for at teste hypotesen om, at mIR-24 regulerer apoptose i DU-145-celler ved at målrette FAF1 genet, anvendte vi FACS-analyse for at undersøge apoptose af celler transficeret med en række reagenser. Over-ekspressionen af ​​FAF1 induceret apoptose, som gjorde nedregulering af miR-24. Når FAF1 og MIR-24-ASO blev co-transficeret i DU-145-celler, den apoptose sats var meget højere, når FAF1 blev transficeret og MIR-24 blev nedreguleret samtidigt, sammenlignet med resultaterne af transfektion enten FAF1 eller MIR-24 -ASO alene. Faktisk kunne apoptose induceret af FAF1 reddes af over-ekspression af MIR-24 (fig. 3). Disse data indikerer, at apoptose induceret af nedregulering af MIR-24 kan virke gennem regulering af FAF1.

DU-145-celler blev behandlet med de angivne reagenser og apoptose blev målt ved FACS 48 timer efter transfektion (n = 3 ± SE, *

s

0,01). Ikke kun nedregulering af MIR-24 inducerer apoptose, men overekspression af FAF1 også apoptose i DU-145-celler. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev meget højere, når pcDNA3.1-FAF1 og MIR-24-ASO blev cotransficeret. Apoptose induceret af overekspression af FAF1 kunne reddes af MIR-24-mimic. Disse data viser, at overekspression af MIR-24 kan beskytte DU-145-celler fra FAF1-induceret apoptose, og at nedregulering af MIR-24 kan forøge apoptose induceret af FAF1 i DU-145-celler. Vektorer blev transficeret i en koncentration på 100 ng per brønd; efterligner og ASO blev transficeret ved koncentration på 20 nM per brønd i en 12-brønds plade.

Mutation af MIR-24 Bindende steder i FAF1 Gene sensitizes Celler til Apoptose

bindingsstederne af mIR-24 inden for FAF1 ORF blev muteret med henblik på yderligere at bekræfte, at mIR-24 regulerer apoptose i DU-145-celler ved at målrette ORF regionen af ​​FAF1 genet. Resultaterne af dette forsøg viser, at DU-145-celler med mutante FAF1 var mere modtagelige for apoptose end celler, der indeholder vildtype FAF1 genet. For at bestemme hvorvidt mutant FAF1 kunne reguleres af MIR-24 en mutant FAF1 gen og et MIR-24-mimic blev co-transficeret i DU-145-celler. Over-ekspression af MIR-24 kunne ikke redde cellerne fra apoptose induceret af mutant FAF1 genet (fig. 4). Disse data understøtter vores hypotese, at MIR-24 regulerer apoptose ved binding ORF region af FAF1 genet.

DU-145-celler blev behandlet som angivet og apoptose blev målt ved FACS 36 timer efter transfektion (n = 3 ± SE, *

s

0,01, **

s

0,05). Synonyme mutationer ved de forudsagte miR-24 bindingssteder inden FAF1 inducerede større grad af apoptose. Over-ekspression af MIR-24 ikke beskyttede DU-145-celler fra apoptose induceret af mutant FAF1. Vektorer blev transficeret ved en koncentration på 100 ng per brønd; efterligner og ASO blev transficeret ved en koncentration på 20 nM per brønd i en plade med 12 brønde.

MIR-24-ASO-Mediated nedregulering af MIR-24 også apoptosis og påvirker proliferation i HGC-27, MGC-803 og HeLa celler

Vi næste ansat den livmoderhalskræft cellelinie HeLa og to typer af humane gastrisk karcinom cellelinier (HGC-27 og MGC-803) for at undersøge, om miR-24 kunne regulere apoptose i andre cancerceller. Apoptose blev induceret ved 20 nM MIR-24-ASO uden anden induktion efter 48 timer i HGC-27 og MGC-803-celler (fig. 5A). I HeLa-celler, blev apoptose induceret with1 nM staurosporin. Hastigheden af ​​apoptose i var meget højere i celler transficeret med 20 nM MIR-24-ASO end i celler transficeret med NC-ASO (fig. 5B). Dataene ovenfor antyder, at regulering af apoptose af miR-24 kunne være en fælles mekanisme i forskellige typer af kræftceller.

(A) HGC-27 og MGC-803 celler blev behandlet med 20 nM miR-24- ASO eller NC-ASO og apoptose blev målt ved FACS med Annexin V og propidium iodfarvning efter 48 timer (n = 3 ± SE; *

s Restaurant 0,01). Nedregulering af miR-24 induceret apoptose i HGC-27 og MGC-803 celler. (B) Apoptose blev induceret med 1 pM staurosporin i 2 timer efter 48 timers transfektion under anvendelse af 20 nM MIR-24-ASO eller NC-ASO (n = 3 ± SE; *

s Restaurant 0,01). Den apoptotiske respons på staurosporin blev forøget efter transfektion med MIR-24-ASO.

Discussion

miRNA er kendt for at inhibere genekspression ved binding til 3’UTR’er af deres mål-transkripter [34]. For nylig er det blevet vist, at denne miRNA også kan modulere genekspression ved baseparring til CDS region af target mRNA’er. For eksempel lad-7 miRNA direkte retter sig mod miRNA-enzym Dicer til dens kodende sekvens, således indføre en mekanisme til en miRNA /Dicer autoregulatorisk negativ feedback loop [12] – [14].

Tidligere undersøgelser har fundet, at nedregulering af FAF1 gennem RNA-interferens kan øge modtageligheden for apoptose [32]. I nærværende undersøgelse fandt vi, at MIR 24 virker som en endogen siRNA for FAF1, og apoptose induceret af FAF1 kan reddes ved overekspression af miR-24.

Den største fund af denne undersøgelse er at mIR-24-mål FAF1 ved binding til dets CDS region for derved at regulere apoptose i DU-145-celler. Vores undersøgelse understøtter en udvidet model, hvor dyr miRNA kan regulere mRNA ved at binde til mål uden for såvel som inde i 3 ‘utranslaterede region, og udvider vores forståelse af, hvordan miR-24 og FAF1 regulere apoptose i kræftceller.

funktionen af ​​miRNA er særlig kompliceret, og miR-24 kan have andre end FAF1 der er også involveret i celle overlevelse mål. Tidligere undersøgelser har antydet, at MIR-24 undertrykker initiering og forlængelse faser af translation af mRNA kodende for tumor suppressor p16 (INK4a) [35]. Det har også vist sig, at MIR-24 er nødvendig for at undertrykke apoptose i den udviklende neurale nethinde [36]. Således kan FAF1 være en af ​​flere distinkte mål for MIR-24, som bidrager til dens virkning af apoptose.

DU-145 er den “klassiske” human prostatacancer-cellelinie, afledt af en hjerne metastase. DU-145-celler har moderat metastatisk potentiale, kan ikke hormon-følsomme og ikke udtrykker PSA (prostataspecifikt antigen) [37] – [39]. Hormonfølsomme prostatakræft behandlet med hormonbehandling typisk vise god prognose. Der er dog nogle effektive terapier til behandling af hormon-ufølsomme prostatakræft repræsenteret af DU-145 [40]. I denne undersøgelse fandt vi, at overekspression af FAF1 efter MIR-24 nedregulering induceret apoptose i ca. 70% af DU-145-celler efter 48 timer (fig. 3). Dette indikerer, at MIR-24 kunne være en lovende terapi mål i behandlingen af ​​hormon-ufølsomme prostatacancer.

Desuden MIR-24 er en af ​​de mest udbredte miRNA i cervicale cancerceller [41], og er efter sigende opreguleret i solide mavekræft [42]. Andre undersøgelser har også vist, at FAF1 ekspression reduceres i gastriske carcinomer sammenlignet med ikke-neoplastisk væv, og der var en signifikant korrelation mellem FAF1 reduktion og indholdet af signetring celler i gastriske carcinomer [43]. Disse rapporter tyder på, at ekspressionen af ​​FAF1 omvendt korreleret med mængden af ​​MIR-24 i gastriske carcinomer. Vores undersøgelse viser, at FAF1 er et direkte mål for MIR-24, og at MIR-24 kan regulere apoptose i HGC-27, MGC-803 og HeLa-celler. Disse data indikerer, at regulering af apoptose gennem miR-24 undertrykkelse af FAF1 kan være en fælles mekanisme i flere forskellige former for kræft.

Som konklusion nærværende undersøgelse foreslår, at den pro-apoptotiske faktor FAF1 er negativt reguleret af miR-24 via to specifikke mål motiver i FAF1 ORF regionen. Endvidere nedreguleringen af ​​MIR-24 inducerer apoptose i DU-145-celler. Vores data understøtter en augmented model, hvor miRNA direkte kan målrette udskrifter inden for deres kodende region, og foreslår, at en komplet søgning efter de regulatoriske mål for miRNA bør udvides til de kodende regioner af gener. Vores resultater yderligere afsløre miR-24 at være et potentielt mål for gen og medicinsk behandling til behandling af hormon-ufølsomme prostatakræft. Da tilsvarende resultater blev opnået i HGC-27, MGC-803 og HeLa-celler, er der også en god grund til fremtidige undersøgelser af miR-24 som en terapeutisk behandling for livmoderhalskræft og mavekræft.

Materialer og metoder

Cell Kultur og transfektion

cellelinier (293T, HeLa, HGC-27, MGC-803 og DU-145) blev opnået fra Cell Bank på China Academy of Science. Celler blev dyrket i DMEM, RPMI-1640 eller DMEM /F12, alle suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Salg

celler ved ca. 70% konfluens blev transficeret under anvendelse INTERFERin (POLYPLUS, til transfektion med oligonukleotider kun) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen, til transfektion med plasmider) med forskellige koncentrationer af syntetiske miRNA efterligner, negative kontroller (NC-efterligner) (Ambion), syntetisk LNA-mærkede oligo-ribonucleotider, mIR-24-ASO og LNA-mærket NC-ASO (Takara) samt plasmider i overensstemmelse med standardprotokoller. Celler blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter transfektion til biokemiske eller biologiske assays. Oligonucleotidsekvenserne anvendte var:

LNA NC-ASO, 5 ‘caCTTATCagtcAGACCAtcGT 3 «

LNA 24-ASO, 5′ ctGTTCCTgctgAACTGAgcCA 3 ‘(små bogstaver angiver LNA-mærkede baser).

Plasmidkonstruktion

A FAF1 proteinekspressionsvektor blev skabt ved PCR kloning af FAF1 cDNA (NM_007051) mellem EcoRI- og Xhol-stederne i pcDNA3.1 (-) (Invitrogen). FAF1 cDNA blev amplificeret fra et humant cDNA-bibliotek under anvendelse af følgende primere:

5′-GAACTCGAGATTGGCGTCCAACATGGAC-3 ‘og 5′-GCGCGAATTCTTACTCTTTTGCTTCAAGG-3’. Plasmider indeholder mutationer i de bindende steder af miR-24 blev konstrueret med en PCR-metode ved anvendelse af følgende mutant primere:

FAF1-Mu-B1-FW: 5′-TTAGCTACCTCACGCAAAATTTTATAACCTGGGCTT-3 ‘

FAF1-Mu-B1-RV: 5′-TGCGTGAGGTAGCTAACAATGGATTCAGCACAAAG -3 “

FAF1-Mu-B2-FW: 5′-CTCCCTCCGGAACCTAAGGAAGAAAATGCTGAGCCTG-3 ‘

FAF1-Mu-B2- RV: 5′-TTAGGTTCCGGAGGGAGGGCTTGCTCTAAGGACAG-3 ‘

luciferase Assay

MIR-24 bindingssteder blev syntetiseret og klonet ind i 3’UTR-regionen af ​​luciferasegenet i pGL3 luciferase vektor (Promega ). Den opnåede konstruktion blev co-transficeret med PRL-SV40 og MIR-24 efterligner eller NC efterligner (Ambion) i 293T-celler som tidligere beskrevet. Efter 48 timer blev luciferaseaktivitet bestemmes som gennemsnittet af tre uafhængige analyser med Dual-Luciferase Reporter-systemet (Promega).

Apoptose Analyse

Hver cellelinje blev transficeret med syntetiserede oligonukleotider eller vektorer . Efter yderligere inkubation på 36 eller 48 timer blev cellerne høstet, farvet med propidiumiodid og FITC-mærket anti-annexin-V-antistof og analyseret ved FACS.

celleproliferationsassay

celleproliferationsassays blev udført med en celle Counting Kit-8 (Dojindo). Celler blev udpladet i plader med 24 brønde i tre eksemplarer ved ca. 5 × 10

4 celler per brønd og dyrkedes i vækstmediet. Ved de angivne tidspunkter blev antallet af celler pr brønd målt ved absorbansen (450 nm) af reduceret WST-8 (2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- ( 2, 4- disulfophenyl) -2H-tetrazolium, mononatriumsalt).

Protein Extraction og Western Blot

Celler blev opsamlet med SDS loading buffer (Sigma). Proteiner blev separeret på SDS-polyacrylamidgeler og overført til en PVDF-membran. Membranen blev derefter blokeret med PBST med 5% mælkepulver i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af hybridisering natten over ved 4 ° C i TTBS indeholdende 1% mælkepulver og primære antistoffer. Primære antistoffer blev påvist ved hjælp af en peroxidase-koblet sekundært antistof (Sigma) og kemiluminescens (Pierce). De følgende primære antistoffer blev anvendt:. Kanin-anti-FAF (cellesignalering Technologies) og GAPDH (Abcam)