PLoS ONE: en matematisk model af Bimodal Epigenetisk Kontrol af miR-193a i kræft i æggestokkene Stem Cells

Abstrakt

Akkumulerende data viser, at kræft stamceller bidrager til tumor kemoresistens og deres vedholdenhed ændrer kliniske resultat. Vores tidligere undersøgelse har vist, ovariecancer kan indledes af ovariecancer initierende celler (OCIC), kendetegnet ved overfladeantigen CD44 og c-kit (CD117). Det er blevet eksperimentelt påvist, at en microRNA, nemlig MIR-193a målretter c-KIT mRNA for nedbrydning og kan spille en afgørende rolle i æggestokkene cancerudvikling. Hvordan miR-193a er reguleret er dårligt forstået, og den spirende billedet er kompleks. For at udrede denne kompleksitet, foreslår vi en matematisk model til at undersøge, hvordan østrogen-medieret opregulering af et andet mål for miR-193a, nemlig E2F6, kan dæmpe funktionen af ​​miR-193a på to måder, en gennem en konkurrence på E2F6 og c -KIT transkripter for mIR-193a, og det andet ved binding af E2F6-protein i association med en Polycomb kompleks, til promotoren af ​​mIR-193a at nedregulere dens transkription. Vores model forudsiger, at denne bimodale kontrol øger ekspressionen af ​​c-KIT, og at den anden form for epigenetisk regulering er nødvendig for at generere et skift adfærd i c-kit og E2F6 udtryk. Yderligere analyse af TCGA ovariecancer datasæt viser, at kræft i æggestokkene patienter med lavt udtryk for EZH2, en Polycomb-gruppe familie protein, viser positiv korrelation mellem E2F6 og c-KIT. Vi formoder, at en samtidig EZH2 hæmning og anti-østrogenbehandling kan udgøre en effektiv kombineret terapeutisk strategi mod kræft i æggestokkene

Henvisning:. Cheng FHC, Agudath BD, Tsai JC, Kochańczyk M, Lin JMJ, Chen GCW, et al. (2014) en matematisk model af Bimodal Epigenetisk Kontrol af miR-193a i æggestokkene Cancer Stamceller. PLoS ONE 9 (12): e116050. doi: 10,1371 /journal.pone.0116050

Redaktør: David Wai Chan, The University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: September 22, 2014 Accepteret: November 30, 2014; Udgivet: December 29, 2014

Copyright: © 2014 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af forskningsbevillinger fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (NSC102-2320-B-194-006, NSC102 -2115-M-194-007-MY2, MOST103-2911-i-194-504 og MOST103-2320-B-194-002), National center for Teoretisk Sciences (NCTS), og National Chung Cheng University (NCCU Interdisciplinary Science bevilge 103-03), Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Medforfatter Baltazar D. Aguda er ansat af DiseasePathways LLC. DiseasePathways LLC ydet støtte i form af løn for forfatteren BDA, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Specifikke rolle denne forfatter artikuleres i afsnittet “forfatter bidrag”

Konkurrerende interesser:. Medforfatter Baltazar D. Aguda er ansat af DiseasePathways LLC. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske malignitet og 5. hyppigste årsag til kræft dødsfald blandt kvinder [1]. Som ovariecancer har få symptomer tidligt i sin bane, er de fleste patienter diagnosticeret med sene stadier (III og IV) af sygdommen. Det 5-års overlevelse er generelt mindre end 20% for patienter med fremskreden-stadie sygdommen trods terapeutiske fremskridt, mens overlevelsesraten for patienter med stadium I eller II sygdom er mere end 80% i samme periode [2]. Selvom de nuværende kemoterapeutika demonstrerer en mere end 90% komplet respons rate i den tidlige fase tumorer, er kun en 20-30% delvis respons observeret i fremskredne stadie tumorer samt i kemo-resistente tilbagefald tumorer [3]. En bedre forståelse af de molekylære ændringer i æggestokkene carcinogenese kan føre til bedre terapeutiske strategier for denne dødelige sygdom.

En spirende hypotese, at kræft opstår fra en lille population af selvfornyende kræft initierende celler (CIC) [4 ]. Disse CIC menes at besidde tumorigent potentiale og forbedret resistens inden for en tumor, og er i stand til at genskabe tumor kolonier

in vivo

. Vi har tidligere isoleret æggestokkene CIC’er (OCICs) fra patienter med ovariecancer [5]. Disse OCICs udviser forøget resistens i retning cisplatin og taxol, og er kendetegnet ved ekspressionen af ​​adskillige celleoverflademarkører, herunder c-KIT (CD117, eller stamcellefaktor receptor). Men den mekanisme for, hvordan OCICs opstår, og hvordan disse celleoverflademarkører er transkriptionelt styres er ikke fuldt forstået.

Østrogen er en vigtig regulator af vækst og differentiering i normale ovarier [6] og er involveret i udviklingen af ovariecancer [7]. I denne henseende har undersøgelser undersøgt risikoen for kræft i æggestokkene hos kvinder, der anvender hormonerstatningsterapi (HRT) til behandling af menopausale symptomer [8], [9], [10]. For eksempel viser en undersøgelse, der involverer en million kvinder foreslog, at kvinder behandlet med HRT var forbundet med en øget risiko for ovariecancer [11]. Imidlertid er rollen af ​​østrogen i æggestokkene carcinogenese ikke fuldt klarlagt.

Epigenetisk modifikationer i genomet spiller en afgørende rolle i transkriptionel kontrol og afvigende epigenetisk modifikation er nu betragtes et kendetegn for cancer [12]. Epigenetiske modifikationer er ansvarlige for at kontrollere gen udtryk, der giver mulighed for specifikke fænotyper [13], [14]. Blandt dem, DNA-methylering er en af ​​de mest kendetegnet epigenetiske modifikation, som finder sted i 5′-stillingen af ​​cytosin i CpG-dinukleotider resulterer i dannelsen af ​​5-methylcytosin. DNA-methylering, der forekommer ved de klynger af bindingssteder for CpG (kaldet CpG øer) i promotorregionen af ​​et tumorsuppressorgen resulterer i transkriptionel repression og tumorigenese i visse tilfælde [15]. Også betragtet som afgørende regulatorer af genekspression, er Mirs benævnt tumor suppressor-Mirs hvis de regulerer ekspressionen af ​​et onkogen [14]. Undersøgelser vist, at tumor suppressor-Mirs ofte nedreguleres af genetiske eller epigenetiske mekanismer, der fører til opregulering af onkogener og fremskyndelse af tumorigenese [16]. For eksempel blev fundet MIR-34b /c (som befinder sig det promotoren CpG øen af ​​et gen), der skal epigenetisk tavse af DNA-methylering i metastatiske cancerceller [17]. Re-ekspressionen af ​​miR-34b /c undertrykt kræft invasion

in vitro

in vivo

.

Vi er interesseret i miR-193a, som er placeret på kromosom 17q11. 2 og indlejret i et CpG island. Undersøgelser har vist, at MIR-193a epigenetisk blev stille ved promotor-hypermethylering i akut myeloid leukæmi (AML) og lungecancer [18], [19]. Vigtigere er det, miR-193a er rettet mod stamcellemarkør, c-KIT, for undertrykkelse i AML [18], [20]. En anden eksperimentelt bekræftet mål for miR-193a er E2F6 [21]. Opregulering er blevet observeret af E2F6 i brystkræftceller ved behandling med østrogen [22]. Inden E2F transkriptionsfaktorer, der er involveret i cellecyklus kontrol gennem transkriptionel aktivering eller repression [23], blev E2F6 fundet at være en transkriptionel repressor stand til at associere med histon-lysin N-methyltransferase EZH2, som er en vigtig bestanddel af den Polycomb kompleks [24], [25], og med DNA methyl-transferase DNMT3b, der giver mulighed for dets rekruttering til den undertrykkende kompleks [26].

Som rolle miR-193a i kræft i æggestokkene er i øjeblikket ukendt vi hypotesen, at E2F6 protein kan undertrykke ekspressionen af ​​miR-193a, både direkte som en DNA-bindende transskriptionsrepressor og indirekte gennem fremme af Polycomb kompleks samling. Eksistensen af ​​bindingsstederne for E2F6-protein i promotoren af ​​MIR-193a som vist ved Encode chip-Seq data [27] tyder på, at langvarig suppression af MIR-193a ved E2F6 kan føre til epigenetisk inaktivering af miR -193a. Disse begivenheder kan føre til opregulering af c-KIT og udløse begyndelsen af ​​den OCIC fænotype og dermed fremme ovarie carcinogenese. I denne undersøgelse, bruger vi en matematisk model til at udforske de snørklede af denne epigenetiske kontrol over miR-193a, som kunne vise sig at være betydelig, da det forudsiger et skifte adfærd i c-KIT, der kunne være afgørende for æggestokkene carcinogenese.

Materialer og metoder

Cellekultur

Ovariecancer cellelinie A2780 blev opformeret i RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% FBS, og 50 enheder /ml penicillin /streptomycin. Cellen blev inkuberet ved 37 ° Cwith 5% CO

2.

Kloning af MIR-193a udtrykkende vektor

Sekvenserne, der transskriberer MIR-193a pre-miRNA blev amplificeret ved PCR under anvendelse specifikke primere F: 5′-CGCGGATCCAGTTTCTCGGCGCATAACTC-3 ‘og R: 5′-CCCAAGCTTCGCTATTTCTCCAGCGAAGTG-3’, under anvendelse af genomisk DNA fra IOSE celler, som udtrykker mIR-193a. PCR-produkterne blev ligeret ind YT en kloningsvektor (Yeastern Biotech, Taiwan) til sekventering bekræftelse. MIR-193a-YT A blev fordøjet med BamH I og Hind III, og indsat i multiple kloningssted på p

Lyddæmper

4.1-CMV puro siRNA ekspressionsvektor, som blev præfordøjet med BamHI og HindIII

.

ekstraktion af RNA og kvantitativ RT-PCR

RNA-ekstraktion blev udført under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. At fjerne potentielle kontaminerende DNA fra den komplementære DNA, 1 ug totalt RNA blev behandlet med DNase I (Amplification Grade, Invitrogen) før revers transkription. RNA blev derefter omvendt transskriberet hjælp tilfældige primere (for c-KIT eller E2F6 udtryk) eller TaqMan revers transkription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitativ real-time RT-PCR blev herefter udført ved anvendelse af ABI StepOne real-time PCR-system (Applied Biosystems). Primere er tilgængelige efter anmodning. Relativ udtryk for miR-193a, c-KIT og E2F6 blev beregnet ved hjælp af den sammenlignende Ct-metoden.

Resultater

miR-193a mål c-KIT og E2F6

For at undersøge forholdet mellem miR-193a og c-KIT /E2F6 i kræft i æggestokkene (fig. 1A), vi overudtrykt miR-193a i A2780 ovariecancerceller som har lave niveauer af miR-193a udtryk. Ekspression af MIR-193a resulterede i en signifikant nedregulering af c-kit-mRNA og E2F6 mRNA, hvilket antyder, at c-KIT mRNA og E2F6 mRNA er mål for MIR-193a i ovariecancerceller (fig. 1B).

(A) Skematisk diagram af c-kit og E2F6 mRNA viser forudsagte mIR-193a bindingssted på deres 3’UTR. De detaljerede bindende sekvenser (MRes) af disse steder er også vist sammen med miRNA sekvensopstillinger. (B) qPCR-analyse af miR-193a, c-KIT og E2F6 i A2780 æggestokkene cancerceller. Overekspression af miR-193a i A2780 celler fører til nedregulering af c-KIT og E2F6 mRNA.

Model ligninger

Interaktioner mellem komponenterne i miR-193a-E2F6- c-KIT regulerende modul er vist i fig. 2A. Tæt kobling af netværkskomponenter og potentielle ikke-lineær kinetik kan give anledning til komplekse systemets dynamik, som kan forstås ved hjælp af en matematisk model. I vores kinetisk model (. Figur 2B) er der seks komponenter, der repræsenterer: miR-193a (

R

m), E2F6 mRNA (

R

e), c-KIT mRNA (

R

c), komplekset af miR-193a med E2F6 mRNA (

R

em), kompleks af miR-193a med c-KIT mRNA (

R

mc), og E2F6 protein (

P

). De kemiske masse-action ligninger for den respektive koncentration af disse molekyler eller komplekser,

R

m,

R

e,

R

c,

R

em,

R

mc, og

P

, er angivet som følger: (1) (2) (3) ( 4) (5) (6)

(A) Aktivering af østrogen receptor (ER) signalering kan øge stigningen transkriptionen af ​​E2F6 som efterfølgende kan øge ekspressionen af ​​c-KIT gennem mIR-193a medieret Cerna mekanisme . På den anden side, udover transskriptionsrepressor, kan E2F6 føre til epigenetisk inaktivering af MIR-193a-promotoren resulterer i opregulering af c-KIT. Beskrivelsen for hvert nummer i reaktionsvejen er anført i S1 tabel. (B) Den biokemiske interaktion for denne foreslåede miR-193a regulatoriske netværk. Model variabler navne for molekyle er også givet.

Her foreningen på miR-193a-E2F6 mRNA er

k

1 og forening på miR-193a -c-KIT mRNA er

k

2; dissociation rate af komplekser miR-193a-E2F6 mRNA er

k

m1 og miR-193a-c-KIT mRNA er

k

m2; oversættelse på E2F6 protein er

k

3; omskrivning på miR-193a er

k

4, af E2F6 mRNA er

k

5 og c-KIT mRNA er

k

6; nedbrydningshastigheden af ​​miR-193a er

δ

m, af E2F6 mRNA er

δ

e, af c-KIT mRNA er

δ

c, af miR-193a-E2F6 mRNA er

δ

em, og miR-193a-c-KIT mRNA er

δ

mc og nedbrydningshastigheden af E2F6 protein er

δ

s; og styrken af ​​miR-193a transskription hæmning af E2F6 protein betegnes som

K

4.

Den første led på højre side af Eq. (1) svarer til pil 9 i fig. 2A udtrykker MIR-193a transkription inhibering med primært E2F6-protein, men også ved Polycomb komplekse proteiner aktivitet. Værdien af ​​parameteren

K

4 har således til formål at redegøre for både den direkte transskription undertrykkelse E2F6 og for den langsigtede gene silencing udført af og afhængige af indholdet af EZH2 og DNMT3b. (Koncentrationen af ​​E2F6 er en variabel af den dynamiske model, mens niveauer af essentielle Polycomb proteiner, som ikke udtrykkeligt er til stede i model ligninger, er ikke emner til regulering af modulet og deres niveauer antages konstant i det mindste på det modul ligevægtstidspunktet skala .) den anden (henholdsvis tredje) led på højre side af Eq. (1) er hastigheden af ​​miR-193a frigivelse fra komplekset med E2F6 mRNA (henholdsvis kompleks med c-KIT mRNA). Interaktioner svarende til pile 6 og 7 i fig. 2A, der udtrykker hybrid mRNA kompleksdannelse, er givet henholdsvis ved den fjerde og den femte led på højre side af Eq. (1). Det sidste ord i Eq. (1) er en første ordens miR-193a nedbrydning sigt.

Hastigheden af ​​konstitutive E2F6 gen transskription (pil 1 i Fig. 2A) er

k

5 (Eq. (2)). Denne afhænger af niveauet af hormonal stimulation, og som vores model beskriver forenklet regulering i æggestokkene celler, vil vi direkte forbinder

k

5 med niveauet af østrogen. Den anden periode i Eq. (2) repræsenterer frigivelsen af ​​E2F6 mRNA fra komplekset med miR-193a, mens tredje periode er hastigheden af ​​det modsatte bindende reaktion. Det sidste ord i Eq. (2) er en nedbrydning af E2F6 mRNA. Vilkårene på højre side af Eq. (3) er analoge. Den første periode i Eq. (4) er den sats for bindingen af ​​E2F6 mRNA og miR-193a. Den anden periode i Eq. (4) står for den modsatte reaktion, og den tredje periode repræsenterer nedbrydningen af ​​

R

em. Vilkårene på højre side af Eq. (5) er analoge. Den sidste ligning udgør E2F6 oversættelse (pil 8 i fig. 2A) og nedbrydning.

Steady Stater

Steady stater giver den langsigtede opførsel af systemet. De stabile tilstande af systemet (1) – (6) kan opnås ved at sidestille de højre sider af ligninger til nul. Lad

S

= (

R

m,

R

e,

R

c,

R

em,

R

mc,

P

), være stabil tilstand af systemet (1) – (6). Steady state

S

opfylder følgende ligninger (7) (8) (9) (10) (11) (12), hvor

og (13)

Vi bemærker, at når

R

m bestemmes af ligning. (12), så de andre komponenter i steady state

S

kan bestemmes ved ligning. (7) – (11). Derfor betingelse for eksistensen af ​​den steady state

S

er, at

k

4 ligger i

h

[0, ∞), rækken af ​​funktionen

h

. Vi er interesseret i tærskel eller skifte adfærd systemet (1) – (6), navnlig i omskiftning af ekspressionen af ​​c-KIT mRNA. Således forholdene på parametrene for eksistensen af ​​flere stabile stater er relevant. Her giver vi et kriterium for eksistensen af ​​tre stabile tilstande i modellen som følger: (14) (15) hvor er den maksimale værdi på intervallet [0, ∞), og er givet ved

beviset for kriteriet (14) – (15). findes i S1 Text

den Steady State Bifurcation Diagram i (

k

5,

R

c) fly

i betragtning af miljøkvalitetskrav. (7) – (8), den stadige tilstande af

R

e og

R

c stigning eller et fald i samme retning. Denne model forudsigelse er i overensstemmelse med Cerna hypotese [28], [29], at ekspressionen af ​​E2F6 positivt korrelerer med den for c-KIT.

Som nævnt før,

k

5 er en eksperimentelt styrbar parameter forbundet med tilsætning af hormoner (f.eks østrogen), og

K

4 er et mål for inhibering effektivitet, primært, E2F6-protein mod mIR-193a. Som vi skal se i diskussionen nedenfor, samspillet mellem

k

5 og

K

4 kan generere en overekspression af c-KIT mRNA. Derfor ville det være interessant at se afhængigheden af ​​steady state på parameteren

k

5 for forskellige værdier af

K

4 – det er vist i fig. 3. Dette diagram omtales som en “steady state bifurkationsdiagrammer”, og

k

kaldes

5 som en tvedeling parameter. For at generere eksperimentelle kurver svarende til de i fig. 3, kan man designe et forsøg, hvor cellerne dyrkes ved forskellige koncentrationer af østrogen, og derefter måle de langsigtede mRNA niveauer.

afhængighed af de stationære tilstande med variabel

R

c (RNA niveau af c-KIT) af parameter

k

5 (transskription på E2F6) til forskel værdier af parameteren

K

4 (hæmning effektivitet af E2F6). Værdien af ​​parametrene er angivet i S2 Text.

Med parametre opfylder Eq. (14) – (15), modellen forudsiger, at der er en række af

k

5 for hvilken systemet indrømmer tre sameksisterende stationære tilstande. For eksempel til

K

4 = 0,0001 (dvs. en lavere hæmning effektivitet. Figur 3, grøn linje) og

k

5 er mellem 0,0556 og 0,1585, modellen giver tre stationære tilstande (hvoraf den høje

R

c og den lave

R

c stater er stabile, se kurven forbundet med

K

4 = 0,0001 i fig. 3). Betydningen af ​​det højre knæ i en steady-state bifurkation diagram ligger i følgende kendsgerning: som kontrol parameter

k

5 forhøjes fra den lave værdi op gennem den kritiske værdi

k

5

R er forbundet med højre knæ, den tilsvarende steady state niveau af

R

c vil stige, og på grund af den af ​​de stationære tilstande ustabilitet (henholdsvis stabilitet) på den midterste gren (henholdsvis øvre gren) i steady-state bifurkation diagram, vil systemet hoppe til den stationære tilstand på den øverste gren ved den kritiske værdi

k

5

R og derefter bo på den øverste gren (se fig. 3). Der er en skarp forskel i c-KIT mRNA niveauer mellem de stabile tilstande af

R

c på den nedre og øvre grene i steady-state tvedeling diagram, der vil foreslå kræft fænotype-fremmende over- udtryk for c-KIT mRNA for

k

5

k

5

R. På den anden side, hvis man er i første omgang ved en stationær på den øvre gren, som er forbundet med overekspression af c-KIT-mRNA, kan man formindske

k

5 værdi for at reducere den stadige state niveau af

R

c. Desuden, hvis man fortsætter med at mindske

k

5 værdi under den kritiske værdi

k

5

Lassociated med venstre knæ, så den tilsvarende steady state niveau af

R

c vil falde, og på grund af de stationære tilstande på den midterste gren i steady-state tvedeling diagram ustabiliteten (henholdsvis stabilitet) (henholdsvis den nedre gren), systemet vil stige ned til den steady state på den nederste gren på den kritiske værdi

k

5

L (se fig. 3). Dette ville genvinde den normale c-KIT mRNA-niveau.

For at opsummere, modellen forudsiger, at der findes en tærskelværdi

k

5

R (henholdsvis

k

5

L) i den transskriptionelle sats

k

5 for celler at tænde (henholdsvis slukke) udtryk for OCIC markør c-KIT. Derfor er det vigtigt at justere transkriptionelle sats

k

5 for at påvirke ekspressionen af ​​OCIC markør c-KIT.

Betydningen af ​​Parameter

K

4

Selvom reducere værdien af ​​

k

5 (forbundet med lav østrogen niveau) kan reducere ekspressionen af ​​OCIC markør c-KIT, nogle kliniske beviser tyder på, at anti -estrogen terapi er kun delvist effektive i behandlingen af ​​ovariecancer [30], [31]. Modellen viser, at dette kan være på grund af hæmning af miR-193a udtryk ved E2F6 protein som afspejles i værdien af ​​parameteren

K

4 i første led på højre side af Eq . (1). Dette udtryk er begrundet i, at ekspressionen af ​​MIR-193a afhænger af transkriptionelle suppressive aktivitet af E2F6-protein (forbundet med niveauet af EZH2 og DNMTs). Især tilstrækkelig stærk inhibering (tilstrækkeligt stort

K

4) vil føre til en mere langsigtet silencing af ekspressionen af ​​MIR-193a ved DNA-methylering (se ligning (1).), Og således vil medføre overekspression af c-KIT mRNA; mens der for det ekstreme tilfælde

K

4 = 0, at systemet (1) – (6) kan kun støtte højst én stabil tilstand (se S1 tekst), hvilket indebærer den manglende eksistens af højre og venstre knæ i steady state diagram og tab af den bistabile switch.

Lad

k

5

b betegne den basale transskription hastighedskonstanten af ​​E2F6 mRNA. I det følgende, afhængig af samspillet mellem den

k

5

b og

K

4, vil vi beskrive to scenarier, hvor den anden ville svare til den kliniske observation, at anti-østrogenbehandling kun er delvis effektive i behandlingen af ​​ovariecancer [30], [31].

i celler med lav hæmning effektivitet E2F6 (dvs. en lavere

K

4), som parameteren

k

5 øges fra

k

5

b til

k

5

2 (rød ubrudt linie i fig. 4A), steady state af

R

c vil først flytte fra

L

0 til

L

1 via den nederste gren, og på grund af i midten gren fra ustabiliteten af ​​de stationære tilstande, switch

L

1 til

U

1 i den øverste gren, og til sidst bevæger sig langs den øvre gren til

U

2. På den anden side, da parameteren

k

5 faldet fra

k

5

2 til

k

5

b (blå ubrudt linie i fig. 4A), steady state af

R

c vil først flytte fra

U

2 til

U

0 via den øverste gren, og, på grund af ustabilitet af de stationære tilstande i midten gren, derefter skifte fra

U

0 til

T

0 i den nedre gren, og til sidst flytte tilbage til

L

0. Dermed for lav hæmning effektivitet E2F6 (dvs. lav

K

4) og små basal hastighedskonstant (dvs. lille

k

5

b), tilføjelse af østrogen kan tænde overekspression af c-KIT-mRNA, hvorimod tilbagetrækning af østrogen kan slukke overekspression af c-KIT mRNA og gøre cellerne genvinde den normale c-KIT mRNA-niveau.

afhængigheden af de stationære tilstande af variabel

R

c (RNA niveau af c-KIT) af parameter

k

5 (transskription på E2F6) for forskellige værdier af

K

4: (A)

K

4 = 0,1 (dvs. lav hæmning effektivitet E2F6), (B)

K

4 = 1 (dvs. høj inhibering effektivitet E2F6). Den røde og blå pil linje angiver pludselige skift i steady state af

R

c med på forskellige

k

5

værdier, som er angivet nedenfor. Værdien af ​​parametrene er angivet i S2 Text.

I celler med høj hæmning effektivitet E2F6 (dvs. en højere

K

4), som parameteren

k

5 øges fra

k

5

b til

k

5

2 (rød ubrudt linie i fig. 4B), steady state af

R

c vil først flytte fra

L

0 til

L

1 via den nederste gren, og på grund af i midten gren ustabiliteten af ​​de stationære tilstande, skifte fra

L

1 til

U

1 i den øverste gren, og til sidst bevæger sig langs øvre gren til

U

2. På den anden side, da parameteren

k

5 faldet fra

k

5

2 til

k

5

b (blå ubrudt linie i fig. 4B), steady state af

R

c vil først flytte fra

U

2 til

U

0 via øvre gren, og, på grund af det faktum, at

k

5

b er den basale transkription hastighedskonstanten af ​​E2F6 mRNA og

k

5

b er større end

k

5 komponent i venstre knæ punkt, så må stoppe ved

U

0, som er den tilstand er forbundet med over-ekspression af c-KIT mRNA. Dermed for høj hæmning effektivitet E2F6 (dvs. en højere

K

4) og store basal hastighedskonstant (dvs. stor

k

5

b), tilbagetrækning af østrogen kan ikke svække ekspressionen af ​​c-kit-mRNA. Vi gør en vigtig observation: for tilstrækkeligt stort

K

4,

k

5 værdi forbundet med venstre knæ er meget tæt på nul. Dermed for tilstrækkeligt stort

K

4, ville det passe scenariet diskuteret i dette stykke. Dette tyder på, at for tilstrækkeligt stort

K

4, tilbagetrækning af østrogen kan ikke slukke overekspression af c-KIT mRNA, hvilket er i overensstemmelse med den førnævnte klinisk observation.

Validering af modellen i TCGA æggestokkræft datasæt

i lyset af ovenstående model, vi ræsonnerede, at i æggestokkene kræftpatienter med lav EZH2 (dvs. lav

K

4), forøgelse af E2F6 mRNA (som skyldes en stigning af transskription på E2F6,

k

5), kan øge ekspressionen af ​​c-KIT mRNA (

R

c), gennem miR -193a-medieret Cerna mekanisme. Dog kan en sådan sammenhæng ikke eksisterer hos patienter med høj EZH2 (dvs. høj hæmning konstant E2F6 til miR-193a,

K

4) som miR-193 er epigenetisk tavshed. At give en uafhængig støtte til denne hypotese, analyserede vi udtrykket microarray data i TCGA ovariecancer datasæt [32]. Interessant ovariecancer patienter med lav EZH2 niveau viser en positiv korrelation mellem ekspressionen af ​​E2F6 og c-KIT (fig. 5A). Analyse af et andet sæt af microarray data i ovariecancer (GDS2785) demonstrerede også en lignende fænomen (S1 Fig.). Imidlertid er en sådan sammenhæng ikke observeret hos patienter med højt EZH2 (fig. 5B og S1 Fig.) Eller i sammenhængen mellem E2F6 og en ikke-MIR-193a mål (S2 Fig.). Tilsammen har dette fænomen er i overensstemmelse med vores forudsigelse (fig. 3), at mRNA af E2F6 og c-KIT demonstrerer en Cerna forhold ved lav

K

4.

Expression microarray data fra 568 Ovariecancerpatienter sorteres efter ekspressionsniveauet for EZH2. Scatter plot viser sammenhængen mellem ekspressionsniveauet af E2F6 og c-kit i patienter med ovariecancer med (A) lav EZH2 (nederst 12,5%) og (B) høj EZH2 (top 12,5%). R og P-værdien af ​​Pearson korrelation er vist. Interessant, som forudsagt af vores model, patienter med lav EZH2 viser en positiv korrelation af E2F6 og c-KIT (A, R = 0,322, P 0,005). En sådan korrelation ikke er observeret i patienter med forhøjet EZH2 (B, R = 0,2148 P . 0,05). Dog kan patienter med højt EZH2 yderligere opdeles i 2 undergrupper baseret på medianværdien af ​​c-KIT (høj, rød farve, lave, blå farve). Ingen af ​​disse undergrupper viser en positiv sammenhæng mellem E2F6 og c-KIT.

Diskussion

Vores matematisk model postulerer eksistensen af ​​en bimodal epigenetisk styring af miR-193a i æggestokkene carcinogenese. I celler med lav hæmning effektivitet E2F6, der er en ~linear forhold mellem transkription af E2F6 og c-KIT-mRNA, hvilket antyder en Cerna forhold mellem disse 2 gener. I denne Cerna hypotese [28], [29], de 3’UTRs i flere mRNA’er indeholder MIR-bindende element (er) (MRE), og derfor konkurrerer om binding med miR. Teoretisk set kan en miR være epigenetisk styret af både promoter hypermethylering og dens Cerna i en bimodal måde.

Det er også bemærkelsesværdigt at påpege, at denne Cerna forhold er en reversibel begivenhed, således at tilbagetrækning af østrogen, som resulterer i lavere ekspression af E2F6, kan reducere ekspressionen af ​​c-KIT (fig. 6, øvre panel). Sådan fænomen kan observeres i normale ovarieepitelceller eller ovariecancerceller, hvor E2F6 hæmning effektivitet er lav. Faktisk er komponenter af transkriptionelle repressorer såsom EZH2 som er nødvendig for transkriptionel undertrykkelse af E2F6 sig at være lav i normale ovarie celler og en sub-sæt af ovariecancer [33], [34]. Vigtigere er det, det er også i overensstemmelse med den kliniske beviser for, at ekspressionen af ​​E2F6 og c-KIT er korreleret i æggestokkene kræftpatienter med lav udtryk for EZH2 men ikke i tilfælde af høj EZH2 udtryk.

Under forudsætning af lav EZH2 og DNMT3b ekspression (øvre panel, som angivet ved lyseblå og rød farve), E2F6 kun fører til en minimal undertrykkelse af mIR-193a (dvs. lav

K

4) og forholdet mellem E2F6 og c-KIT udviser en Cerna forhold. Som et resultat, mængden af ​​c-kit i ovariecancerceller afhænger af mængden af ​​østrogen (denne information er medieret af niveauet af E2F6). Tværtimod på betingelse af højt ekspressionsniveau af EZH2 og DNMT3b (nedre panel, som angivet ved mørke blå og rød farve), E2F6 udøver en høj inhibering effektivitet (dvs. høj

K

4 ). Let tilvækst af E2F6 resultater i epigenetisk inaktivering af miR-193a og efterfølgende en overekspression af c-KIT. Uden MIR-193a, kan cellerne “låst” i en høj c-KIT tilstand resulterer i æggestokkene carcinogenese.

I celler med høj inhibering effektivitet E2F6, vores model forudsiger en særdeles ikke -linear forhold mellem ekspression af E2F6 og c-KIT. På betingelse af lav ekspression niveau af E2F6, der følger en Cerna forhold mellem E2F6 og c-KIT. Ved høje ekspression af E2F6 sammen med høj ekspression af transskriptionsrepressor såsom EZH2, kan E2F6 føre til epigenetisk inaktivering af ekspressionen af ​​MIR-193a gennem trimethyleret H3K27 og DNA-methylering (fig. 6, nederste panel). 3 og fig.