PLoS ONE: Mitochondrial Dynamics Protein Drp1 er overudtrykt i Oncocytic skjoldbruskkirtlen tumorer og Regulerer Cancer Cell Migration

Abstrakt

Oncocytic celletumorer er karakteriseret ved ophobning af morfologisk abnorme mitokondrier i deres celler, hvilket tyder på en rolle for unormal mitokondrie biogenese i oncocytic celle transformation. Der vides kun lidt om årsagen til dysmorfologi af akkumulerede mitokondrier. Proteinerne regulerer morfologien af ​​mitokondrier, de “mitochondrierne-formning” proteiner, kan modulere deres størrelse og antal; dog intet vides hidtil om en mulig inddragelse af mitokondrie dynamik i oncocytic celletransformation i tumorer. Vores mål var at vurdere status for mitokondrier morfologi og dens rolle i oncocytic celle transformation. Vi evaluerede derfor ekspressionsmønsteret for de vigtigste mitochondrielle fusion og fission proteiner i en serie af skjoldbruskkirtlen celle tumorprøver, samt i skjoldbruskkirtlen tumorcellelinjer, med og uden oncocytic celletræk. Ekspressionen af ​​mitokondrie fusion (Opa1, Mfn1 og Mfn2) og fission (Drp1 og Fis1) proteiner blev vurderet ved immunohistokemi (IHC) i en serie af 88 humane skjoldbruskkirteltumorer.

In vitro

undersøgelser, til sammenligning, og at uddybe undersøgelsen blev udført ved hjælp af TPC1 – en papillær thyreoideakarcinom afledt cellelinje-og XTC.UC1, en oncocytic follikulært thyreoideakarcinom-afledt cellelinje. Både IHC og

in vitro

protein analyser viste en samlet stigning i niveauerne af “mitokondrie-forme” proteiner i oncocytic skjoldbruskkirtlen tumorer. Endvidere blev fundet overekspression af pro-fission protein Drp1 at være forbundet med ondartede oncocytic skjoldbruskkirteltumorer. Interessant, genetiske og farmakologiske blokering af Drp1 aktivitet var i stand til at påvirke skjoldbruskkirtlen kræftceller ‘migration /invasion evne, en funktion af tumor malignitet. I denne undersøgelse viser vi, at ubalancerede mitokondrie dynamik karakterisere de maligne funktioner i skjoldbruskkirtlen oncocytic celletumorer, og deltage i købet af vandrende fænotype

Henvisning:. Ferreira-da-Silva A, Valacca C, Rios E, Populo H, Soares P, Sobrinho-Simões M, et al. (2015) Mitochondrial Dynamics Protein Drp1 er overudtrykt i Oncocytic skjoldbruskkirtlen tumorer og Regulerer Cancer Cell Migration. PLoS ONE 10 (3): e0122308. doi: 10,1371 /journal.pone.0122308

Academic Redaktør: Marc Liesa, Boston University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Oktober 1, 2014 Accepteret: 19 februar 2015; Udgivet: 30 Marts 2015

Copyright: © 2015 Ferreira-da-Silva et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af projektet PIC /IC /83037/2007 (til VM), projektet MFAG-12120 fra AIRC og GR-2011- 02351643 fra det italienske sundhedsministerium (til SC). Yderligere støtte blev opnået fra projektet ‘mikromiljø, metabolisme og kræft’ baseret på IPATIMUP og delvist støttet af Programa Operacional Regional do Norte (ON.2-O Novo Norte), under Quadro de referencia Estratégico Nacional (QREN), og gennem Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (EFRU). IPATIMUP er en Associate Laboratory i den portugisiske Ministeriet for Videnskab, teknologi og videregående uddannelse og er delvist støttet af den portugisiske Foundation for Science and Technology (FCT). Undersøgelsen var også FCT gennem en ph.d.-stipendium til AFS (Ref .: SFRH /BD /39104/2007)

Konkurrerende interesser:. Det medforfatter Luca Scorrano ikke længere en PLoS ONE Editorial bestyrelsesmedlem, da han er fratrådt datoen for forfatternes indsendelse. intet ændrer således forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Kræftceller er kendt for at gennemgå et skift i deres basale metaboliske veje, en proces, der ofte beskrives som “

Warburg effekten

“, hvorved selv under høj ilt de producerer det meste af deres ATP ved glykolyse [1]. Dette skift i metabolisme er blevet rapporteret at være ledsaget af en ændring i mitokondrie morfologi og størrelse, selv de molekylære detaljer ledsager de morfologiske forandringer forbundet med Warburg effekten forbliver uopklaret, også da lidt er kendt om, hvordan mitokondrie morfologi reguleres [2,3 ]. De seneste år har set identifikationen af ​​de centrale komponenter i mitokondrie dynamik maskiner, en voksende gruppe af proteiner, som, blandt andre cellulære funktioner, regulerer mitokondrie fusion og fission. Mitokondrie dynamik dysfunktion er gradvist blevet afsløret i en lang række patologier, især neurodegenerative sygdomme og kræft [4].

En særlig gruppe af ualmindelige tumorer er blevet rapporteret i stort set alle organer, med en højere frekvens i skjoldbruskkirtlen og nyre [5,6]. Sådanne tumorer har celler med en tydelig meget eosinofile, kornet og hævede cytoplasma, med store kerner og fremtrædende nucleoli [7,8,9,10]. Elektronmikroskopi viser, at denne opsvulmede udseende skyldes en unormal akkumulering af mitokondrier, der udviser abnorm morfologi [11,12,13]. Disse tumorer er beskrevet som oncocytic-, oxyphilic-, eosinofil, “Hürthle-celle (når der henvises til skjoldbruskkirtlen) tumorer” eller som “oncocytomas”. For nemheds skyld vil vi betegne dem som “oncocytomas” eller “oncocytic celletumorer” [10]. I nuværende klinisk praksis, kriterierne for diagnosticering af de oncocytic celle varianter af papillær skjoldbruskkirtlen karcinom (PTC) og follikulært skjoldbruskkirtlen karcinom (FTC) omfatter nukleare egenskaber, tegn på kapsulær og /eller vaskulær invasion som deles med de ikke-oncocytic celletumorer af samme art, samt den mitokondriske proliferation typisk for oncocytic celletumorer [5,6,7]. Faktisk denne idé, at den oncocytic transformation sker på toppen af ​​”konventionelle” tumorer er bakket op af de tilsvarende genetiske ændringer af oncocytic carcinomer og deres ikke-oncocytic modstykker, som viser en tilsvarende forekomst af de forskellige genetiske abnormiteter, såsom RET /PTC omlejringer og BRAFV600E mutationer [6,14,15,16,17,18]. Selvom de første anbefalinger overvejet alle oncocytic skjoldbruskkirtlen tumorer ondartede, senere undersøgelser har vist, at så længe sagerne korrekt stratificeret i henhold til deres klinisk-patologiske træk-såsom patienternes alder, iscenesættelse af tumorerne og kirurgisk procedure- prognosen for patienter med oncocytic celle PTC og FTC varianter svarer til patienter med respektive konventionelle, ikke-oncocytic karcinomer [3,5,17,19].

de væsentligste forskelle mellem oncocytic og ikke-oncocytic tumorer bor i hyppigheden af ​​variationer i mitokondrie-DNA (mtDNA) og kerne-DNA gener, der koder mitokondrielle proteiner [2,5,20,21]. Af disse store 5 kb deletion, der ofte omtales som den “fælles sletning”, der fjerner en række mtDNA gener og forstyrrer mtDNA replikation og transkription, findes hyppigt i oncocytic skjoldbruskkirteltumorer og er forbundet med en stigning i mitokondriemasse [20, 22,23,24].

data om rekord tyder på, at mutationer i oxidative fosforylering (OXPHOS) gener, nemlig i komplekse i gener, kan resultere i OXPHOS svækkelse og kan føre til ophobning af unormale mitochondrier [ ,,,0],20,25]. Ved hjælp af bioinformatiske værktøjer, har vi for nylig vist, at høj patogenicitet mtDNA mutationer, nemlig i gener for Complex I, føre til oncocytic fænotype [21].

Varianter af translocase af Indre mitokondriemembranen 44 homolog (TIMM44), som er en del af det mitokondrielle protein ordning, er også blevet beskrevet i familiære former for oncocytic skjoldbruskkirteltumorer; dette tyder på, at deregulering af mitokondrie import maskiner og derfor af den mitokondriefunktionen er forbundet med unormal mitokondrie biogenese [26].

Et slående træk ved de akkumulerede mitokondrier i oncocytic celletumorer er deres unormal ultrastruktur og morfologi. Dette indikerer en deregulering også i de proteiner, der styrer mitokondrielle dynamik, de “mitokondrierne-forme” proteiner, en proces afhængig af mitokondrie fusion og fission og uløseligt forbundet med mitokondrie biogenese, distribution, signalering og apoptose [27,28,29]. Interessant, ubalance i mitokondrierne fænotype mod fragmentering orchestrates den vandrende kapacitet i celler, hvor indvandringen udgør en afgørende fysiologisk funktion, såsom T-celle lymfocytter og tumorale metastatiske celler [30,31]. Faktisk for at gøre bevægelse muligt, skal fragmenteres til at favorisere deres relocalization og rekruttering til specifikke subcellulære regioner mitokondrier. I tilfælde af tumorceller, har en direkte sammenhæng påvist mellem den metastatiske graden og Drp1-afhængige fragmentering af mitokondrier i brystcancer [31]. Mitokondrie fission kræver cytosoliske dynamin relateret protein 1 (Drp1) og dets mitokondrie receptorer fission 1 (Fis1), mitokondrie fission faktor (FFR) og mitokondrier Division (Mid) 49 og 51. Omvendt er den ydre membran mitofusin (MFN) 1 og 2 og den indre membran dynamin-lignende protein opticusatrofi 1 (Opa1), medierer mitokondrie fusion [32,33]. På trods af de kendte mitokondrie morfologiske ændringer observeret i oncocytic celletumorer, viden om niveauerne og den rolle, disse mitokondrier-forme proteiner er sparsom. Vi har derfor sat sig for at undersøge, om mitokondrie dynamik ændres i oncocytic skjoldbruskkirtlen celletumorer. Vores data viser, at mitokondrie fission proteiner Drp1 og Fis1 er overudtrykt i oncocytic celletumorer, og at Drp1 ekspressionsniveauerne korrelerer med oncocytic celle tumor malignitet

ex vivo

med migration evne en oncocytic skjoldbruskkirtel tumorcellelinie

in vitro

. Interessant, genetiske og farmakologiske blokering af Drp1 reducerer migrationen af ​​oncocytic tumorcellelinie, der tilbyder en ny behandlingsmetode til at tackle metastatisk oncocytic celletumorer.

Materialer og metoder

Etik Statement

den foreliggende undersøgelse blev udført under den nationale etiske og regulative lov for brug af biologiske prøver. Den anvendes i denne undersøgelse materiale stammer fra “Banco de Tecidos e Tumores” (Tumorer og væv Bank) i Hospital de São João, Porto, der samler alle prøver efter skriftlig informeret samtykke fra patienterne eller deres værger i tilfælde af mindreårige. At have adgang til disse prøver, skal forskerne indsende et projekt til den etiske komité i Hospital de São João til godkendelse. Vores projekt er blevet godkendt.

Patient valg

En serie af 88 skjoldbruskkirtlen tumorer blev hentet fra filer af Patologisk Institut for Hospital S. João (HSJ), Porto. Thyroid prøver blev opnået fra patienter med aldre spænder fra 15 til 83 år. Den histologi af alle tumorprøver blev revideret uafhængigt af to patologer (ER og MSS), og den endelige Klassificeringen stemmer overens med WHO kriterier [34]. Diagnosticering af skjoldbruskkirtlen tumorer var følgende: follikulært skjoldbruskkirtel adenom (FA, n = 19; 12 oncocytic og 7 ikke-oncocytic), follikulært skjoldbruskkirtlen carcinom (FTC, n = 7; 1 oncocytic og 6 ikke-oncocytic), follikulært variant af papillær thyreoideakarcinom (FVPTC, n = 30; 8 oncocytic og 22 ikke-oncocytic), konventionel papillær thyroidcarcinom (CPTC, n = 32; 9 oncocytic og 23 ikke-oncocytic).

grund af den korte opfølgning af sagerne i denne serie, og til den deraf følgende begrænsede antal dødsfald begivenheder, var den samlede overlevelse ikke analyseret. Den foreliggende undersøgelse blev udført under den nationale etiske og regulative lov for brug af biologiske prøver.

Tissue Microarray (TMA)

Repræsentative områder af forskellige læsioner blev nøje udvalgt på hæmatoxylin og eosin-farvede sektioner og blev markeret på individuelle paraffinblokke. To vævskerner (3 mm i diameter hver) blev opnået fra alle de valgte prøver og blev nøjagtigt deponeres i dublerede TMA recipient paraffinblokke bruger tissue array instrument (Beecher Instruments, Silver Spring, MD) som beskrevet andetsteds [35]. I hvert væv microarray blok, var områder af ikke-neoplastisk thyreoideavæv også inkluderet som kontroller. Multiple 3 um snit blev skåret fra TMA blokke og overføres til ultrafrost dias.

immunhistokemisk analyse

immunhistokemisk analyse (IHC) blev udført i 3 um formalin-faste, paraffinindlejrede sektioner. Snit blev afparaffiniseret og rehydreret i en serie af faldende koncentration af ethanolopløsninger. Deparaffinerede enkelt prøver samt TMA Sektionerne blev underkastet varme-induceret antigen-genvinding enten i 10 mM pH 6 citratbuffer (natriumcitrat) eller i 1 mM pH 8 ethylendiamintetraeddikesyre puffer (EDTA) (LabVision Corporation, Fremont, CA, USA), i en mikroovn fastsat til 300watts i 10 minutter.

efter hentning opløsninger var afkølet, væv var underlagt i 10 minutter til blokering af endogen peroxidaseaktivitet og af ikke-specifik binding med 3% af H

2O

2, og med den store Volume Ultra V Block reagens (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, USA), afhængigt af påvisning system, der anvendes.

sektionerne blev derefter inkuberet i et fugtigt kammer med følgende primære antistoffer og følgelig med fabrikantens specifikationer: kanin polyklonale antistof specifikt for Fis1 (1: 100) ref. ALX-210-907 fra Alexis Biochemicals, nu Enzo Life Sciences (Farmingdale, New York, USA), mus monoklonalt antistof specifikt for Drp1 (1: 100) ref. 611.112 og muse monoklonalt antistof specifikt for Opa1 (1: 100) ref. 612.607, begge fra BD Biosciences (Franklin Lakes, New Jersey, USA), kanin-polyklonalt specifikt for Mfn1 (1: 250) ref. sc-50330 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA), muse monoklonalt antistof specifikt for Mfn2 (1: 400) ref. 9927-M03 fra Abnova, (Jhongli City, Taiwan). Som en kontrol for mitokondrie indhold musepolyklonalt antistof specifikt for SDHA (1: 2000) ref. MS203, fra Mitosciences, nu ABCAM (Cambridge, UK) blev anvendt. Tidligere testede positive kontroller fra skjoldbruskkirtlen, bryst og muskler blev inkluderet for alle antistofferne i serien. Negative kontroller blev udført ved at udskifte det primære antistof med ikke-immunt museserum.

immunhistokemi teknik blev udført under anvendelse af et mærket streptavidin-biotin immunoperoxidase detektionssystem (Thermo Scientific /Lab Vision, Fremont, USA) eller Envision G /2 System /AP (K5355, Dako, Danmark) ifølge producentens instruktioner.

i MFN1 og SDHA den immunhistokemisk farvning blev udviklet med DAB (3,3′-diaminobenzidin) substrat. For de resterende antistoffer den immunfarvning blev udført med eller Envision G /2 System /AP (K5355, Dako, Danmark), og prøverne blev fremkaldt med en permanent rød chromogen.

Immunfarvning var blindt semikvantitativt evalueret af to observatører (VM og AFS) uden kendskab til nogen kliniske oplysninger af tilfældene; en IHC score blev opnået gennem summen af ​​intensiteten af ​​farvning (0- fraværende; 1- svag, 2- moderat 3- stærk) ved udvidelsen af ​​farvede tumorceller (1-0 til 25%, 2-25 til 50% ; 3-50 til 75%; 4- 75%). Evaluering af procentdelen af ​​immunoreaktive celler for alle antistofferne blev foretaget ved at tælle 300 tumorceller i tilfældige felter. I alle afvigende tilfælde blev nået til enighed. Som mitokondrie markering, og som et middel til at vurdere mængden af ​​mitokondrier, SDHA ekspressionsniveauer blev tilgået og anvendt til at normalisere vores resultater. I hvert prøve, sammenlignede vi ekspressionen af ​​proteinerne af interesse, både i normale og tumorvæv, mod SDHA farvning. Således for hver enkelt sag, var vi i stand til at vurdere i en individuel og præcis måde ændringerne i ekspressionen af ​​proteinet i studiet uafhængigt af mængden af ​​mitokondrier, angivet af SDHA udtryk.

Cellelinjer

kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinier: TPC1 (venligt leveret af Dumont JE og Mareel M-National cancer center Research Institute, Tokyo, Japan), en PTC-afledt cellelinje, og XTC.UC1 (fra Wong MG og Savagner F- kirurgi service, Veterans Affairs Medical center, San Francisco, Californien), en cellelinie opnået fra et oncocytic variant af follikulært carcinom, blev anvendt i denne undersøgelse. Begge cellelinier var tidligere blevet karakteriseret på molekylært og genotypiske niveau [36,37]. TPC1 celler blev dyrket med RPMI medium med Glutamax suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS), 1% (v /v) Pen Strep og 0,5% (vol /vol) fungizon (alle fra GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA); XTC.UC1 blev opretholdt med DMEM /F12 (GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, USA) suppleret med 10% (vol /vol) FBS, insulin på 10 ug /ml, TSH på 10mU /ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA ), 1% Pen Strep (v /v) og 0,5% (v /v) fungizon. Begge cellelinier blev autentificeret ved hjælp af dna-profil-analyse, opnået med PowerPlex 16-systemet (Promega, Madison, USA), i henhold til de DNA-profiler til rådighed i American Type Culture Collection og Sundhedsvidenskab Research Resource Bank.

konstruktioner og transfektioner

cytoplasmatisk GFP (ctGFP), mitokondrier målrettet dsRed (mtRFP), mitokondrier målrettet YFP (mtYFP) og pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 plasmider blev beskrevet tidligere, og var en gave fra T. Pozzan (Venetian Institut for Molekylær Medicin, Padua, Italien) [33]. Den tomme pcDNA3.1 blev opnået fra BD-Clontech og pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 plasmid generation er tidligere beskrevet [33]. XTC.UC1 cellelinier blev kortvarigt transficeret ved elektroporering under anvendelse af Neon transfektionssystemet (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). I co-transfektioner eksperimenter blev 1.5μg af markør luftfartsselskab (ctGFP i transwell eksperimenter) plus 3 ug pcDNA 3.1 eller pcDNA3.1-HA-K38A-DRP1 bruges pr 2.0×10

6 celler. Den specifikke kombination af plasmider transficeret i hvert forsøg er angivet i figurteksterne. Efter 24, blev transficerede celler sorteret ved FACS og anvendt til eksperimenter 24h senere.

Kvantitativ PCR

I cDNA forberedelse, 1 ng af total RNA blev revers transkriberet under anvendelse af RevertAid første streng cDNA syntesekit ( Fermentas, Burlington, ON, Canada). Reverse transskriptionsprodukter blev amplificeret for alle ovennævnte gener ved qPCR vha TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Til analyse af data

Actin

hCyclophilin

blev brugt som endogene kontroller (data vist kun til actin). Data er udtrykt som relative ekspression for hver enkelt gen normaliseret til de tilsvarende kontroller.

ABI PRISM 7500 Fast Sequence Detection System (Applied Biosystems) blev anvendt til at detektere amplifikationen niveau og er programmeret til et indledende trin af 2 min ved 50 ° C, 10 min ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. 50 ng af cDNA for hver prøve blev anvendt, og alle amplifikationer blev udført tre gange. Den relative kvantificering af målgener blev bestemt under anvendelse af ΔΔCT fremgangsmåde, som tidligere blev valideret af Livak s Lineær regression Method (slope¼0.0696) (sekvens Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems).

Subcellulær fraktionering og immunoblotting

Subcellulær fraktionering blev udført som beskrevet i Frezza

et al

. [38]. Mitochondriske og cytosoliske fraktioner blev opnået og blev blottet med en mus monoklonalt antistof anti-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA) og et gede-polyklonalt antistof-anti-Actin (1: 2000) ref sc1616 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Celler blev lyseret i RIPA buffer, i nærværelse af phosphatase og proteasehæmmere. Lignende mængder af totalt protein blev opløst ved SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (GE Healthcare, Little Chalfont, England). Vi har anvendt som primære antistoffer, dem, der allerede er nævnt i immunhistokemi sektion (alle i en fortynding på 1: 1000). For protein detektion blev et peberrodsperoxidasekonjugeret sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) og en luminescens-system (Perkin-Elmer, Foster City, USA) anvendes. Membraner blev igen probet med et monoklonalt muse-antistof anti-TOM20 (1: 5000) ref. FL-145 (Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, USA) til styring af proteinet lastning. Proteinekspression blev kvantificeret under anvendelse af Bio-Rad Mængde One 1-D Analysis software.

Elektronmikroskopi

Celler blev fremstillet ved anvendelse af en traditionel fiksering procedure elektronmikroskopi og billeder blev taget med et Technai 20 ( FEI, Eindhoven, Holland). Forskelle i mitochondrie størrelse mellem cellelinier blev beregnet under anvendelse af hele mitokondrier overfladeareal. Mindst 15 mitochondrier blev målt per celle og mindst 5 forskellige celler pr prøve blev tilfældigt anvendt til størrelse måling. Alle forsøg blev foretaget i tre eksemplarer.

Mitokondriel netværk imaging

For at kvantificere strukturelle mitokondrie netværk fragmentering blev cellerne dyrket i glas-bottom retter, transfekteret med mitokondrie målrettet gule og røde fluorescerende protein, mtYFP og mtRFP henholdsvis og efter 24h blev fikseret med iskold 3,7% formaldehyd i 30 minutter. Celler, der udtrykker mtRFP blev afbildet med Zeiss 510 META konfokal laser scanning mikroskop ved hjælp af en Plan-Apochromat 100 /1.46NA målsætning med en 2x digital zoom (excitation ved 561 nm, emission indspillet over 575nm. For hver cellelinje eller tilstand mindst 25 tilfældigt udvalgte celler blev afbildet og kvantificeret i henhold til dens mitokondrie netværk. En 100x Plan-Apochromat (1.46NA) objektiv og 2x zoom blev brugt til billedet enkelt celler. Digitale billeder blev behandlet ved hjælp ImageJ 1,47 (US National Institutes of Health-NIH, Bethesda, MD, USA).

Scratch-viklet assay

Celler blev dyrket til nær 90% konfluens i plader med 6 brønde. Under aseptisk betingelser en tynd “sår” blev indført ved at skrabe med en 10 pi pipette spids- og løsnede celler blev skyllet med PBS. ved hjælp af en fasekontrast oprettet og en 40x total forstørrelse billeder blev taget hvert 5. minut i i alt 15 timer. Fem forskellige målinger hver mark blev foretaget under anvendelse af de billeder taget ved 0, 3, 6 , 9, 12 og 15 timer ved anvendelse af ImageJ software. Mere detaljerede oplysninger om denne metode er tidligere blevet offentliggjort [39]. Billeder blev behandlet med ImageJ software.

Migration /invasion assays

forbigående transficerede TPC-1 og XTC.UC1 celler blev resuspenderet i serumfrit RPMI og med DMEM /F12, henholdsvis med 0,1 % FBS og podet i det øvre kammer i et Transwell plade med 12 brønde (Corning Costar). Transwell-pladerne blev præ-overtrukket med 5 ug /ml fibronectin (F2006-1MG, Sigma Aldrich) og inkuberet ved 37 ° C 5% CO

2 i 4 timer. Pladerne blev derefter skyllet med PBS1x ved pH 7,4 før tilsætning af 100.000 celler pr. De nedre kamre blev fyldt med det respektive medium suppleret med 10% FBS. Efter 12 timers assay blev Transwell membraner udskåret, vendes om og farvet med DAPI på et objektglas. Kernerne synlig ved vendende-ned side af membranen blev talt. Et minimum af 5 forskellige områder blev talt for hvert dias og et tredobbelt blev lavet for hver eksperimentel indstilling. Mdivi1 inhibitor blev anvendt ved 50 uM baseret på tidligere offentliggjorte data og i mangel af observerbare toksiske eller stress celleforandringer [40]. Ingen forskelle blev fundet mellem celler behandlet med Mdivi1 fra tid nul eller forbehandlet en time før begyndelsen af ​​assayet.

Statistisk analyse

Den statistiske analyse af de ICH resultater blev udført med STAT VIEW -J 5.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). Forholdet mellem den gennemsnitlige udtryk niveau (score) af de immunhistokemiske markører og histopatologi af de forskellige sager blev vurderet af ANOVA; Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant, når p-værdi 0,05. Når passende, flere sammenligning korrektioner blev udført ved hjælp af post hoc Bonferroni /Dunn-test og ved indikation program blev sammenligninger kun betragtet som signifikant, når p-værdi 0,0018.

Hver

in vitro

analyse blev udført i mindst tre eksemplarer og den således opnåede gennemsnit blev brugt til uafhængige t-test. Alle data er udtrykt som gennemsnit ± SE, som angivet i legender af tallene.

Resultater

Mfn2, Opa1, Drp1 og Fis1 er overudtrykt i oncocytic celletumorer og Drp1 overekspression er forbundet med maligne oncocytic celletumorer

de såkaldte “mitokondrier-forme” proteiner er vigtige regulatorer af mitokondrier form og deres dynamik. Mitokondrie netværk faktisk er defineret af stærkt reguleret balance mellem fusion og fission processer, afhængigt af cellens fysiologiske behov. Blandt flere cellulære processer og patofysiologiske forhold, mitokondrierne-forme proteiner også træffe afgørelse på homøostase af organeller størrelse og antal [4,28,29,32]. Når oncocytic celletumorer afviger fra de ikke-ococytic dem ved en unormal akkumulering af mitokondrier med en ændret morfologi i cellecytoplasmaet, vi hypotese, at mitokondrielle dynamik kan have en rolle i den fænotypiske og fysiologiske oncocytic definition [11,12,13] . Vi har således foretaget en histologisk analyse af de vigtigste “mitokondrier-forme” protein niveauer på flere histologiske menneskelige skjoldbruskkirtlen tumor prøver. Figur 1 viser repræsentative Immunofarvning mikrografier af de “mitokondrier-forme” proteiner observeret i forskellige histologiske typer af skjoldbruskkirtlen tumorer, herunder en oncocytic follikulært skjoldbruskkirtlen karcinom (FTC), 6 ikke-oncocytic FTC, 8 oncocytic follikulært variant af papillær skjoldbruskkirtlen karcinom (FVPTC) , 22 ikke-oncocytic FVPTC, 9 oncocytic konventionelle papillær skjoldbruskkirtlen karcinom (CPTC), 23 ikke-oncocytic CPTC, 12 oncocytic follikulært skjoldbruskkirtlen adenom (FA) og 7 ikke-oncocytic FA. IHC mikrografer repræsentant for en godartet oncocytic læsion (OFA), en ondartet oncocytic læsion (oPTC) og en ikke oncocytic læsion (den noFVPTC), de histotypes af hovedinteresse i dette arbejde, er vist i figur 1A, 1B og 1C. Eftersom ekspressionen af ​​”mitochondrier-forme” proteiner i den normale tilstødende parenkym var nul, eller kun påviselig under stillingen 2, vi udeladt i histogrammerne ekspressionsniveauerne for sådanne proteiner i normalt væv. Med undtagelse af Mfn1, identificerede vi en stigning i ekspressionsniveauerne af de andre proteiner undersøgt, i oncocytic celletumorer

vs

. ikke-oncocytic dem og i alle fire histo-typer analyserede (FVPTC, FTC, CPTC og FA) (figur 1 og 2A).

Repræsentative mikrografer viser immunfarvning af Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1 og Fis1 antistoffer i normal thyroid væv (NT) og tumorale væv af en oncocytic follikulær adenom-OFA) (a), en oncocytic papillær thyreoideakarcinom-oPTC (B) og en ikke-oncocytic follikulært variant af papillær thyreoideakarcinom-noFVPTV (C) ved en total forstørrelse af 300x. Illustrative sorte pilespidser betegner farvede målt tumorale områder med en øget graduering fra noFVPTV, til OFA og endelig OFTC. “# Mfn1-Mitofusin 1, Mfn2-Mitofusin 2, Opa1-Optic atrofi 1, Drp1-dynamin relateret protein 1, Fis1-Mitokondriel fission 1 protein.

immunfarvning af Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1 og Fis1 blev evalueret, under hensyntagen til alle skjoldbruskkirtlen tumorer (A og B), de oncocytic skjoldbruskkirtlen tumorer alene (C) eller ikke -oncocytic skjoldbruskkirteltumorer alene (D). Den gennemsnitlige antigenekspression blev beregnet som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Resultaterne er vist som middelværdi ± SEM score. * P 0,05 (uparret t-test). # Mfn1-Mitofusin 1, Mfn2-Mitofusin 2, Opa1-Optic atrofi 1, Drp1-dynamin relateret protein 1, Fis1-Mitokondrisk fission 1 protein.

Mfn2 og pro-fission Drp1 betydeligt overudtrykt i maligne oncocytomas

i en dybere analyse af de histologiske prøver fra humane skjoldbruskkirtlen tumorer, Mfn1 var den eneste mitokondrier udformningen protein for at vise nogen signifikant forskel i ekspressionsniveauerne, uafhængigt af fænotype eller tumorale typer sammenlignet (fig 2A-2D). En samlet stigning af indholdet af de andre proteiner analyserede, uafhængigt af deres pro-fusion eller pro-fission rolle, var alle signifikant højere i de oncocytic tumorer i forhold til i de ikke-oncocytic dem (4,2 ± 0,2

vs

2,9 ± 0,2, s 0,0001 for Mfn2 3.3 ± 0,3

vs

2,3 ± 0,2, p = 0,01 for Opa1;. 4.7 ± 0.2

vs

3,0 ± 0,2, s 0,0001 til Drp1; 4,9 ± 0,1

vs

3,5 ± 0,2, p. 0,0001 for Fis1), som angivet i IHC kvantificering af fig 2A (fig 2A). I modsætning hertil var der ingen mærkbar forskel for nogen af ​​disse proteiner, når vi sammenlignet ondartet

vs

. godartede tumorer, uden at skelne og gruppering prøverne i oncocytic eller ikke-oncocytic (3,5 ± 0,2

vs

3,0 ± 0,3, p = 0,31 for Mfn2;.. 2,8 ± 0,2

vs

2,3 ± 0,4, p = 0,28 for Opa1, 3,8 ± 0,2

vs

3,5 ± 0,4, p = 0,48 for Drp1;.. 4.1 ± 0.1

vs

3,9 ± 0,34, p = 0,71 for Fis1) (fig 2B). Det synes derfor, at ændringen af ​​maskinerne er ansvarlig for mitokondrie morfologi er strengt relateret til oncocytic fænotype, i stedet for til den samlede tumor aggressivitet. Desuden inden for de ikke-oncocytic tumorer fandtes ingen forskel i ekspressionsniveauerne af mitokondrielle dynamik proteiner mellem godartede og ondartede tumorer (Fig 2D). Men hvis vi ser på sværhedsgraden af ​​tumoren, kun inden for oncocytic fænotype, interessant vi konstatere, at Mfn2 og Drp1 er betydeligt mere rigelige i carcinomer i forhold til de godartede modparter ‘adenomer (4,5 ± 0,2

vs

. 3.4 ± 0,4, p = 0,012 for Mfn2 og 5,1 ± 0,2

vs

. 4,0 ± 0,5, p = 0,038 for Drp1 (fig 2C). Notatet disse forskelle er ikke relateret til forskelle i mitokondrie nummer ( S1 fig). Dette antyder, at inden oncocytic celletumorer, de mitokondrielle dynamik påtage sig en rolle i fastlæggelsen af ​​tumor malignitet og aggressivitet.

Drp1 akkumuleres aktivt i mitokondrierne og ubalance mitokondrie netværk mod fission

for at tydeliggøre og undersøge i dybden rolle mitokondrie dynamik ændring på oncocytic celletumorer, vi skiftede til

in vitro

eksperimenter på to skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer: XTC.UC1, som er den eneste oncocytic cellelinje til rådighed, med carcinom afledning, og TPC1, en ikke-oncocytic skjoldbruskkirtlen cellelinie, anvendes til sammenligning. Først, vi evalueret i de to cellelinjer ekspressionsniveauet af de samme fusion /fission proteiner undersøgt i de humane tumorprøver.

Ved western blot analyse, vi har registreret, i oncocytic cellelinje, den samme tendens Fejl- søjler repræsenterer SEM. * P