PLoS ONE: Transskription Faktorer OVOL1 og OVOL2 Fremkald den Mesenchymale til Epithelial Transition i Human Cancer

Abstrakt

Cell plasticitet reguleret af balancen mellem mesenkymale at epitel overgang (MET) og den modsatte program, EMT, er kritisk i metastatiske kaskade. Adskillige transkriptionsfaktorer (TFS) er kendt for at regulere EMT, selvom mekanismerne i MET fortsat uklare. Vi demonstrerer en ny funktion af to TF’er, OVOL1 og OVOL2, som kritiske induktorer af MET i humane kræftformer. Vores resultater viser, at OVOL-TF’er kontrol MET gennem en regulerende feedback-sløjfe med EMT-inducerende TF ZEB1, og reguleringen af ​​mRNA splejsning ved at inducere Epithelial Splejsning Regulatory Protein 1 (ESRP1). Brug musen prostata tumormodeller viser vi, at ekspressionen af ​​OVOL-TF’er i mesenkymale prostatacancerceller dæmper deres metastatiske potentiale. Rolle OVOL-TF’er som induktorer af MET er yderligere understøttet af udtryk analyser i 917 cancer cellelinjer, hvilket tyder på deres rolle som afgørende regulatorer af epitel-mesenchymal celle plasticitet i kræft

Henvisning:. Roca H, Hernandez J , Weidner S, McEachin RC, Fuller D, Sud S, et al. (2013) transkriptionsfaktorer OVOL1 og OVOL2 Fremkald den Mesenchymale til Epithelial Transition i Human Cancer. PLoS ONE 8 (10): e76773. doi: 10,1371 /journal.pone.0076773

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: April 12, 2013; Accepteret: August 28, 2013; Udgivet: 4 okt 2013

Copyright: © 2013 Roca et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af U54-CA163124, U01-CA143055, P50-CA69568 og PA1-CA093900 fra National Institutes of Health. KJP understøttes som en American Cancer Society Clinical Research Professor og som en Taubman Research Scholar fra University of Michigan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mere end 90% af kræft dødsfald skyldes metastaser [1]. Derfor skal vi fremme vores forståelse af de mekanismer, der driver kræft progression og metastase. Epiteliale til mesenkymale overgang (EMT), og den omvendte proces af markedsøkonomisk behandling, er afgørende programmer involveret i sårheling og udvikling tidlig orgel [2]. EMT og MET kan også spille kritiske roller i både udviklingen af ​​kræft og etablering af metastatiske kolonier [3]. Når kræftceller undergår EMT, de erhverver evnen til at tage afstand fra den primære tumor og komme i omløb. Disse cirkulerende celler er derefter i stand til at formidle og undergår behandling, hvilket resulterer i metastatiske tumorer. Forståelse dette fænotypisk plasticitet er en nøgle til at hindre udviklingen af ​​kræft [4].

EMT er knyttet til ændringer i genekspression og morfologi og er forbundet med nedregulering af celleadhæsions proteiner, såsom E-cadherin (E-cad ). Denne proces giver cancerceller til at dissociere fra deres naboer og samtidig øge deres motilitet [5]. Det er blevet foreslået, at EMT er reguleret af gensidig feedback-loops mellem ZEB1 /ZEB2 TF’er og medlemmer af MicroRNA miR-200 familie [6,7]. Specifikt kan ZEB1 inducere EMT ved at undertrykke epiteliale proteiner og ved at nedregulere sin egen MIR-200 repressorer. Samtidig, MIR-200S undertrykke ZEB1 samt stamceller faktorer og epigenetiske regulatorer involveret i EMT. Det menes, at disse gensidige feedback-loops er ansvarlige, dels for den fænotypiske plasticitet udstillet i kræft og metastaser [4].

Andre proteiner kan tjene som regulatorer /induktorer af EMT eller potentielle biomarkører for mesenkymale celler. Induktion af EMT er blevet forbundet med TGFp-ekspression [8]. Delvist dette sker via opregulering af ZEB1 /2, som på sin side inhiberer epitel splejsning regulatoriske proteiner (EPSF) [9]. Nedregulering af EPSF, og den resulterende undertrykkelse af alternativ splejsning, er blevet vist at være afgørende i EMT. For eksempel i brystcancer, undertrykkelse af EPSF resulterer i et skifte i CD44 isoform udtryk, der er kritisk i induktionen af ​​EMT og cancer progression [10].

Trods vores voksende viden om EMT, mekanismerne mediering MET er langt mindre forstået. Brug to modeller af prostata og brystkræft mesenkymale celler, opdagede vi, at TF’er OVOL1 (OVO-like 1, Entrez Gene ID 5017) og OVOL2 (Gene ID 58.495) er forbundet med MET i vores modeller, såvel som i andre kræftformer. OVOLs er zink-finger TF’er, der fungerer som regulatorer af embryogenese [11-13]. Vi analyserede først hvordan OVOLs styrer ekspressionen af ​​EMT-inducerende TF’er og ESRPs. Vi derefter undersøgt, hvordan MET, fremkaldt af OVOL-TFS korrelerer med nøglefaktorer for epitelcelle udvikling i 917 cancer cellelinjer, der i overensstemmelse med den menneskelige Cancer Cell Encyclopedia [14], og undersøgt konsekvenserne af MET i reguleringen af ​​kræftcellen invasion og metastase.

Resultater

stabile mesenkymale celler isoleret fra stabile epitelial prostatacancerceller co-dyrket med makrofager

for at studere mekanismerne i EMT i prostatakræft metastaser vi først genereret en epitelcelle model cellelinie afledt fra luciferase positive prostatacancer epitelial PC3-celler. Vi isolerede en subpopulation af celler, der udtrykker luciferase, der viste en stabil epitelial fænotype i kultur og betegnet dem PC3-Epi. Disse celler blev udvalgt på basis af to kriterier: bioluminescerende intensitet og epitelcelle morfologi. I overensstemmelse med den epitheliale tilstand, PC3-epi-celler opretholdt høj E-cad, lav vimentin, og upåviselig ekspression af EMT-aktivator ZEB1 (figur 1A og 1B)

(A) Bright-fase mikroskopi:. Morfologi ændringer i mesenkymceller PC3-EMT1, PC3-EMT12 og PC3-EMT14 sammenlignet med de epiteliale PC3-epi prostatacancerceller. Scale barer er 200 um

(B) Immunoblot:.. Angivelse af EMT markører i mesenkymale kræft cellelinjer PC3-EMT1, -EMT2, -EMT12, -EMT14 og -EMT17 sammenlignet med epitelial PC3-Epi

(C) Microarray: Genekspression analyser sammenligner mesenkymale at epitel kræft cellelinjer. Venn-diagram-I (VD-I) viser en fælles EMT-associeret signatur udtrykt i de mesenchymale cancer linjer PC3-EMT1, -EMT12 og -EMT14 sammenlignet med epitelial PC3-Epi. VD-II -. Gene signatur fra VD-I gennemskåret med underskrivelsen af ​​ZEB1 tavshed celler PC3-EMT1 og -EMT14 hjælp af shRNA-sh4, i forhold til scramble (Scr) kontrol shRNA

(D) Brightness fase mikroskopi: PC3-EMT14 celler transficeret med ZEB1-shRNAs: SH2, sh4 eller Scr. Scale barer er 100 um

(E) Immunoblot:.. Angivelse af EMT markører i PC3-EMT1 og -EMT14 transficeret med ZEB1-shRNAs forhold til Scr eller ikke-transficerede kontroller

(F ) Heat map: 50 gener signatur identificeret i VD-II (felt C). Opreguleret gener er i rød, nedreguleret i blåt. Fold ændringer i mesenkymale cancerceller er i forhold til epitel PC3-Epi, og i SH4-transficerede celler er i forhold til Scr kontrol.

De viste immunoblots er repræsentative for to uafhængige forsøg med lignende resultater. Se også figur S1 og tabel S1.

Vi næste udviklet en mesenkymale model fra PC3-Epi celler, gennem interaktion med makrofager. Vi antager, at dette ville være muligt, fordi makrofager repræsenterer en af ​​de største inflammatoriske cellelokaliteter infiltrater i tumormikromiljøet og de har været impliceret i metastase [15,16]. Co-kultur af IL4-behandlede CD14 + monocytter (M2-makrofager) med PC3-Epi i fire dage induceret stærke morfologiske ændringer i overensstemmelse med EMT med ledsagende fald i ekspressionen af ​​E-cad og forøgelse af vimentin (Fig S1A og S1B). Fra disse celler vi isoleret mesenkymale delpopulationer udpeget som PC3-EMT1, PC3-EMT2, PC3-EMT12, PC3-EMT14 og PC3-EMT17. Disse mesenkymale celler demonstrerede en slående fænotypisk ændring og ekspression af ZEB1, som stabilt blev holdt i kultur (figur 1A og 1B). Sammenlignet med de parentale epitel PC3-epi de mesenkymale celler udtrykte lavere niveauer af epitel celleadhæsionsmolekyle EpCAM; dog stadig omkring 45% af cellerne udtrykte EpCAM i celleoverfladen som påvist ved flowcytometri (fig S1c).

For at vurdere genekspression ændringer i forbindelse med EMT udførte vi tre microarray analyser, sammenligning PC3-EMT1, PC3-EMT12 og PC3-EMT14 til PC3-Epi. Vi identificerede en signatur af 867 gener, der viser ændringer i udtrykket (ved 2 gange eller mere) i alle tre sammenligninger, (VD-I, figur 1C). Vi brugte Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) at fastslå de mest markant beriget molekylære funktioner i forbindelse med denne signatur: ‘cellulære bevægelse’, ‘cellulær vækst og proliferation “,” celle-til-celle signalering og interaktion’ og ‘celle død er alle i overensstemmelse med EMT (tabel S1). ZEB1, som blev opreguleret i alle tre sammenligninger, har været meget impliceret i EMT og vedligeholdelse af mesenkymale tilstand [2.7]. Andre EMT-fremkaldende transkriptionsfaktorer som Snail, Slug eller Twist1, ofte impliceret i tumorgenese og metastase [2], blev ikke identificeret blandt de fælles EMT underskrift af 867 gener er beskrevet ovenfor. Derfor at forstå den rolle ZEB1 i EMT celle program, transficerede vi to mesenchymal linjer (PC3-EMT1 og PC3-EMT14) med en af ​​to lentivirale ZEB1-shRNAs vektorer: SH2 og SH4, plus den krypterede kontrol (SCR). I overensstemmelse med ZEB1 rolle i EMT og vedligeholdelse af mesenkymale tilstand, lyddæmpning af ZEB1 induceret MET i PC3-EMT1 og PC3-EMT14, med tilsvarende ændringer i cellemorfologi (Figur 1D). Endvidere SH2 og SH4 inducerede en slående fald i ZEB1, svarende til opregulering af E-cad (figur 1E). Disse forsøg antyder kraftigt en vigtig rolle ZEB1 i EMT tilstand af disse celler. Når sættet af differentielt udtrykte gener i SH4-transficerede celler blev tilpasset til EMT signatur (VD-I), fandt vi ekspressionsvektorer ændringer i 50 gener, der korrelerer med MET transformation (VD-II, fig 1C). Denne signatur viste modsat regulering, når cellerne blev transficeret med ZEB1-shRNA sh4, i forhold til den scrambled kontrol (figur 1F). Denne fremgangsmåde identificerede også et sæt af 4 TF’er betydeligt nedreguleret i mesenkymale celler og opreguleres af ZEB1-shRNA:. IRF6, ANKRD22, EHF og OVOL2

OVOL1 og OVOL2 regulere MET i prostatakræft model

i betragtning af de observerede ændringer i ekspressionen af ​​IRF6, ANKRD22, EHF og OVOL2 i EMT, samt den observerede feedback mellem ZEB1 og disse TFS vi spekuleret på, at de stabile EMT egenskaber opretholdes under opformering af PC3-EMT1 og PC3-EMT14 celler er et resultat af en regulerende feedback-sløjfe. Ligeledes da disse gener blev nedreguleret i EMT, overekspression dem kan fremkalde markedsøkonomisk behandling. Vi vurderede rolle af hver af de 4 opregulerede TF’er individuelt ved at transducere PC3-EMT14 celler med lentiviral overudtrykker konstruktioner. Udtrykket af disse 4 TF’er i EMT celler viste, at OVOL2 syntes at regulere MET, som observeret af en ændring i cellemorfologi. I betragtning af de stærke paralleller mellem OVOL2 og OVOL1 samt OVOL2 tilsyneladende rolle i behandling, vi yderligere overvejet, om OVOL1 kan have en rolle i behandling. Selvom OVOL1 ikke opfyldte 2-fold grænse, der skal indgå i microarray gen underskrift ZEB1 knockdown-celler, viste qPCR-analyse, at det er stærkt opreguleret i de epitel PC3-Epi-celler og efter ZEB1 lyddæmpning i forhold til mesenkymale PC3- EMT14 (figur 2A og figur S2A). Derfor undersøgte vi også udtryk for OVOL1 i mesenkymale PC3-EMT14 celler. Overekspression af både OVOL1 og OVOL2 inducerede en markant transformation af cellemorfologi og en parallel stigning i E-cad-ekspression (figur 2B og 2C). Endvidere begge OVOLs forøget ekspression af ESRP1 (figur 2C, venstre panel) [17]. Ved qPCR analyserede vi derefter ændringerne i ekspressionen af ​​flere EMT-inducerende transkriptionsfaktorer: ZEB1, ZEB2, snegle, Slug og Twist1 (figur 2C, højre panel). Blandt disse faktorer ZEB1, ZEB2 og Slug afslørede et signifikant fald i udtryk, som korrelerer med markedsøkonomisk behandling. Vi bekræftede, at udtrykket ændringer, der ses i OVOL1 og OVOL2 svarer til ændringer i proteinniveauer ved Western blot (figur 2D). Vi derefter sammenlignet cellelysater fra OVOL1 og OVOL2-overekspression celler til PC3-Epi, PC3-EMT14-EV, og celler, der overudtrykker TFS IRF6 og ANKRD22, også reguleret af ZEB1 (figur 1F). Redning af E-cad og tab af vimentin blev induceret i både OVOL-overekspression celler, mens ikke blev observeret nogen signifikant ændring i de celler, der udtrykker andre TF’er (IRF6 og ANKRD22) (Figur 2E). Selvom qPCR afspejlede en betydelig ændring i Slug ekspression, havde den vestlige ikke viser en ændring på proteinniveauet i OVOL overudtrykker celler, hvilket antyder, at translationel regulering kan spille en rolle i Slug niveauer. Af de fem testede TF’er indikerer disse resultater, at OVOL1 og OVOL2 er centrale induktorer af MET i disse celler

(A) qPCR:.. MRNA-ekspression i PC3-EMT14-sh4 forhold til PC3-EMT14-Scr

(B) Lys-fase mikroskopi: PC3-EMT14 celler, der udtrykker OVOL1 og OVOL2 udviser en epitelial fænotype sammenlignet med forældrenes PC3-EMT14. Scale barer er 100 um

(C) qPCR:. Ekspression af epitelial cellemarkører E-cad og ESRP1, og EMT-fremkaldende TF’er ZEB1, ZEB2, Slug, sneglen, og Twist1 i PC3-EMT14 celler udtrykker OVOL1 og OVOL2 forhold til den tomme vektor (EV) kontrol

(D) Immunoblot:.. OVOL1 og OVOL2 proteinekspression i transfekterede celler blev bekræftet ved hjælp OVOL1 eller V5-specifikke antistoffer, henholdsvis

(E) Immunoblot: Angivelse af epitelial markør E-cad og mesenchymale markører ZEB1 og vimentin. Ændringer i Slug udtryk var minimal og korrelerede ikke med markedsøkonomisk behandling. PC3-EMT14 celler, der udtrykker IRF6 eller ANKRD22, EV og epitelial PC3-Epi er kontroller

(F) Invasion /migration assay:. Repræsentative billeder og grafer af kræft celle invasion ved hjælp af en Boyden kammer assay. Bar grafer af OVOL1 og OVOL2 udtrykker PC3-EMT14 celler relativ EV. Procent invasion repræsenterer forholdet invaderende /migrerende celler. Grafen repræsenterer en ud af tre uafhængige forsøg

(G) qPCR:. Ekspression af PC3-epi-celler transficeret med OVOL1-shRNAs (a, b, c) eller OVOL2-shRNAs (d, e, f) i forhold til den ikke-silencing kontrol PC3-Epi-NS (repræsenteret ved den stiplede linie)

(H) Immunoblot:. PC3-epi-celler transficeret med både OVOL1 og OVOL2 shRNAs (sh-OVOL1 /2) demonstrere et fald i E-cad og stigning i vimentin, hvilket tyder på en delvis EMT transformation

(i) Skematisk:. det ZEB1 promotor med potentielle OVOL2 bindingssteder (orange trekanter) i henhold til den generelle konsensus: 5′-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A). Designet TaqMan primerpar er vist som sorte pile. Nummerering er i forhold til det transkriptionelle startsted (+1). Sekvensen af ​​en formodet OVOL2 bindingssted, der svarer til chip DNA i OVOL2 udtrykkende celler er på 320

(J) chip qPCR:. (Venstre) viser input kromatin af PC3-EMT14-OVOL2 forhold til EV, og viser, at lignende mængder DNA blev anvendt (højre). afbilder chippen DNA under anvendelse OVOL2 antistof. Primere er opkaldt efter deres fremadrettede primer (se panel I). Resultaterne blev normaliseret til input kontrol. Grafen viser en repræsentativt forsøg ud af tre med lignende resultater. Salg

qPCR resultater blev normaliseret for p-actin. Grafer viser middelværdi +/- SEM; p-værdier er repræsenteret som * p 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001. De qPCRs og immunblots er repræsentative for to uafhængige forsøg med lignende resultater. Se også Figur S2.

For at forstå konsekvenserne af OVOL-medieret MET i den invasive potentiale mesenkymale PC3-EMT14 celler, vi brugte Boyden kammer assay på celler, der overudtrykker OVOL1 /2. Begge OVOLs væsentligt påvirket invasionen kapacitet PC3-EMT14. I tilfælde af OVOL1 observerede vi reduceret cellemigration, hvilket påvirkede forholdet invasion vs. migration (invasion index) (figur 2F). OVOL2 overekspression celler viste et markant fald i både invasion og migration, med en meget reduceret invasion indeks. Disse resultater understøtter rolle OVOL1 og OVOL2 i aftagende migration og invasion, som forventet for markedsøkonomisk omprogrammeret celler.

Vi brugte næste shRNAs for OVOL1 (shOVOL1-a, -b, -c) og OVOL2 (shOVOL2- d, -e, -f), for at reducere deres ekspression i epiteliale PC3-epi-celler (Figur 2G). Ingen af ​​shRNAs påvirket E-cad-ekspression. Men i celler med nedsat OVOL2 ekspression, observerede vi en signifikant opregulering (op til 3 gange) af ZEB1 mRNA. Disse resultater antyder, at en 3-gange ændring i ZEB1 ekspression ikke er tilstrækkelig til at inducere EMT i PC3-epi-celler. Desuden er fastslået ved qPCR, ekspressionen af ​​ZEB1 er over 20 gange højere i PC3-EMT14 sammenlignet med PC3-epi-celler (Figur S2a). Desuden gives den lignende funktion OVOL1 og OVOL2 i induktion af MET det er fristende at spekulere, at de kunne erstatte hinanden. Dette kan forklare, hvorfor en knockdown af kun én af de OVOL ikke er tilstrækkelig til at fremkalde en væsentlig ændring i E-cad. For at teste denne mulighed, vi udførte en dobbelt knockdown med shRNAs for hver af de OVOL-TF’er. Selv om ingen selektion af transficerede celler var muligt (begge shRNA konstruktioner udtrykt GFP), en total population af celler transficeret med shOVOL1-a og shOVOL2-d (shOVOL1 /2-a /d) viste en signifikant opregulering af vimentin og en delvis reduktion i E-cad sammenlignet med kontrol PC3-Epi-NS-celler (Figur 2H). Samlet tyder disse resultater en kritisk rolle af både OVOLs i at opretholde epithelial tilstand af disse celler, og derfor ville en dobbelt knockdown være forpligtet til at inducere og vedligeholde mesenchymale tilstand. Derfor ville en større knockdown af OVOL1 og OVOL2 fremkalde en mere komplet EMT transformation i kræftceller.

Andre eksperimenter i prostatacancerceller induceret til at undergå EMT førte til lignende konklusioner vedrørende regulering af OVOL og ZEB1 TF’er. For eksempel blev det transmembrane protein Tetraspanin-8 (TSPAN8) identificeret i signaturen vist i figur 1F som et gen opreguleret i EMT-celler og nedreguleres af ZEB1-shRNA. Overekspression af TSPAN8 i de epiteliale PC3-epi og DU145 celler førte til transformation delvis EMT kendetegnet ved opregulering af ZEB1 og nedreguleringen af ​​OVOL TF’er i begge cellelinier (figur S2B-E).

A transskriptionsrepressor funktion af OVOL2 er tidligere vist i keratinocytter, hvor OVOL2 undertrykt c-myc og Notch1 [18]. Da ZEB1 udtryk steget markant i celler med nedsat OVOL2 (figur 2G), vi har testet, hvis OVOL2 direkte interagerer med ZEB1 promotor. Vi udførte kromatin immunofældning (chip) målrette ZEB1 promotor i PC3-EMT14-OVOL2 og kontrol celler med to antistoffer, anti-OVOL2 og anti-V5-tag. Vi designede 7 TaqMan-primere og prober spænder promotoren fra -4848 til +530 bp (figur 2I) og fundet adskillige potentielle OVOL2 bindingssteder: 5′-A (A /T) (A /T) (C /A) (T /C) GTTA (T /A) [18]. Med begge antistoffer, vi observeret over 50 gange berigelse for den samme primer /probe-stillingen (+ 382 /+ 530) ved sammenligning OVOL2-udtrykkende celler og kontrolceller (Figur 2J og Figur S2B). I modsætning hertil input chromatin af begge celletyper udviste tilsvarende amplifikation med alle primerpar. Disse resultater indikerer specifik binding af OVOL2 til ZEB1 promotoren på 325 region, hvor man OVOL2 konsensus site blev identificeret (figur 2I). Eftersom ingen specifik kromatin fragment blev amplificeret med -115 /+ 29-primere, er det usandsynligt, at OVOL2 binder til +115 stedet, et andet potentielt sted i det proximale område (fig 2I). Fragment +123 – (- 115) = 238 bp er betydeligt mindre end 530 – (115) = 415 bp; men omtrent samme størrelse som + 530 – (325) = + 205 bp. Derfor ville en binding til +115 stedet indebære en specifik pull-down af en chromatin fragment, der skal påvises med de -115 /+ 29-primere. Sammen med de data shRNA og udtryk, disse resultater tyder på, at OVOL2 fungerer som en direkte transskriptionsrepressor af ZEB1.

Mesenkymale celler danner mesenkymale tumorer in vivo

For at bestemme tumorigent potentiale af PC3-EMT12 og PC3-EMT14, vi subkutant podet immunsvækkede NSG mus. Begge mesenkymale cancer cellelinjer dannet overvejende mesenchymale-type tumorer kendetegnet ved lav E-cad og høj ZEB1, mens PC3-Epi tumorer viste høj E-cad og lav ZEB1 udtryk (figur S3A). Vi så ingen signifikante forskelle i tumor vækst mellem grupperne (figur S3B). For at vurdere metastatiske potentiale af de mesenkymale celler anvendte vi intrakardial injektion (ICI) musemodel for cancer metastase [19]. Vi observerede flere mus med metastaser i flere steder i grupperne injiceret med PC3-EMT12 eller PC3-EMT14 celler (figur 3A). De viste også en højere samlet tumorbyrde (ca. en størrelsesorden) og nedsat mus overlevelse i sammenligning med mus injiceret med parentale PC3-epi-celler (figur 3B og figur S3C). Samtidig farvning med E-cad og ZEB1 antistoffer viste, at metastatiske PC3-EMT12 og PC3-EMT14 tumorer viste typiske mesenkymale egenskaber (lav E-cad og høj ZEB1), mens metastatiske tumorer fra PC3-Epi celler vises overvejende epitel egenskaber (høj E- CAD og lav ZEB1) (figur 3C og fig S3D-E). Vores resultater tyder på, at mesenkymale celler (PC3-EMT12 og PC3-EMT14) danner metastaser, der opretholder mesenkymale fænotype. Især nogle metastatiske tumorer fra PC3-epi-celler udviste både mesenchymale og epiteliale kendetegn, at et flertal af de PC3-epi tumorer demonstrerede epitel fænotype (figur 3C). Figur 3C viser en mus injiceret med PC3-epi-celler, hvor en tumor i den venstre femur var overvejende mesenchymal type, mens tumor i højre viste en yderst epitel fænotype. Vigtigere, fandt vi lignende mesenchymale-epitelcelle plasticitet i en metastatisk tumor isoleret fra lårbenet fra en patient med fremskreden prostatacancer. IHC farvning af tumor sektioner med E-cad og ZEB1 antistoffer viste regioner med både meget epitelial (høj E-cad, lav ZEB1) og med mesenkymale egenskaber (lav E-cad og høj ZEB1) (figur 3D).

(A) Metastasis:. procentdelen af ​​ICI-podede mus med flere luciferase signaler ved 21 og 35 dage

(B) Tumor byrde: mus fik ICI og blev afbildet ugentligt i 35 dage. Luciferaseekspression er repræsenteret som regioner af interesse (ROI-fotoner /s)

(C) IHC:. Samtidig ZEB1 og E-cad farvning af metastaser påvist i lårbenet og lever af PC3-Epi eller PC3-EMT14 injicerede mus. Bemærk mesenkymale (ZEB1

høj /E-cad

Lav) (sorte pile) og epitel (ZEB1

lav /E-cad

høj) (grønne pile) kræftceller, der forestiller EMT /MET plasticitet i subpopulationer af PC3-Epi og PC3-EMT14. Scale søjler er 100 um (sort) og 20 um (rød)

(D) IHC:. ZEB1 eller E-cad-farvning af metastase fra lårbenet fra en patient med fremskreden prostatacancer. Bemærk mesenchymale-lignende (ZEB1

høj (sorte pile) /E-cad

lav (gule pile)) og epitelial (ZEB1

lav /E-cad

høj (grønne pile)) kræft celler. Scale barer vist repræsenterer 100 um (sort bjælke) og 50 um (rød bjælke)

(E) Metastasis:.. Procentdelen af ​​ICI-podede mus med flere luciferase signaler ved 21 og 35 dage

(F) Tumorbelastning: Mus modtog ICI og blev afbildet ugentligt i 35 dage. Luciferaseekspression er afbildet som regioner af interesse (ROI-fotoner /s)

(G) IHC:. ZEB1 eller E-cad farvning af metastaser i ICI-mus. Bemærk den højere E-cad og lavere ZEB1 udtryk i metastatiske celler, der udtrykker OVOL1 eller ZEB1-shRNA (sh4). Scale søjle repræsenterer 100 um

Grafer viser middelværdi +/- sem.; p-værdier blev beregnet og repræsenteret * p 0,05; ** P 0,01. Alle IHC billeder er repræsentant for en ud af tre sektioner, der viser lignende resultater. Se også fig S3.

Ifølge resultaterne vist i figur 2B-E, virkningen af ​​OVOL1 overekspression ligner OVOL2. De har begge fremkalde MET og ZEB1 nedregulering. Derudover inducerer ZEB1-shRNA ekspressionen af ​​både OVOL1 og OVOL2 og MET i mesenkymale PC3-EMT14 celler (figur 2A). For at belyse den rolle OVOL TF’er i metastatiske potentiale af cellerne, vi podet mus via ICI med epitelceller overekspression OVOL1 (PC3-EMT14-OVOL1), ZEB1-shRNA (PC3-EMT14-sh4) eller scrambled kontrol (PC3- EMT14-Scr). Vi vurderede tumorprogression ved bioluminescens og bemærkede, at inducerede MET i PC3-EMT14 celler markant reduceret metastatisk potentiale. Både ZEB1-shRNA og OVOL1 udtryk reduceret antallet af mus med tumor metastase i flere steder (Figur 3E). Desuden den samlede tumorbyrde faldet betydeligt i sammenligning med mus injiceret med PC3-EMT14-Scr kontrolceller (Figur 3F). IHC-farvning af metastatiske tumorer med E-cad og ZEB1 afslørede, at MET havde fundet sted i tumorceller, som udtrykker OVOL1 eller ZEB1-shRNA, som indikeret ved positiv E-cad og sænkes ZEB1 ekspression i modsætning til de mesenchymale kontrolceller (figur 3G).

OVOL-induceret MET reducerer metastatiske potentiale mesenkymale kræftceller

for yderligere at undersøge den metastatiske potentiale OVOL-udtrykkende celler, vi brugte en ortotopisk musemodel af prostatakræft [20]. I bioluminescens analyse, så vi en lignende total tumorbyrde (ROI’er) i alle grupper (figur 4A). Otteogtyve dage efter inokulering, antallet af mus med metastaser var signifikant lavere i gruppen injiceret med OVOL-udtrykkende celler (figur 4B og 4C). Vi resektion primære tumorer 42 dage efter podning, indspillet deres vægt, og analyseret tumor sektioner ved IHC. Ortotopisk prostata tumorvægte var signifikant højere i mus inokuleret med PC3-EMT14-OVOL2, mens mus injiceret med kontrol PC3-EMT14 celler viste de laveste vægte (figur 4D). Det observerede fald i metastatisk potentiale for OVOL-udtrykkende celler i vores model korrelerer med en tidligere rapport, der viser, at mus med større ortotopisk prostata tumorer havde en reduceret metastatisk byrde [20]

(A) Tumor byrde:. Luciferaseekspression er afbildet som regioner af interesse (ROI-fotoner /s) i mus med ortotopisk injektioner

(B) Metastasis:. (Venstre) procentdelen af ​​orthotopisk podede mus med flere luciferase signaler ved 21 og 28 dage (Højre ). afbilder det samlede antal af metastaser per gruppe divideret med antallet af mus (n) per gruppe på 28 dage

(C) Imaging:. Repræsentative billeder af luciferase ekspression i mus 28 dage efter modtagelse af ortotopisk injektioner. . Metastaser for hver gruppe er rød cirkel i enten de ventrale eller dorsale billeder og bortset fra dem, der mistænkes for at svare til den samme tumor

(D) Tumor Vægt: De gennemsnitlige vægt af ortotopisk (prostata) tumorer resektion på 42 dage (n = 4)

(E) IHC:. E-cad og ZEB1 farvning af metastatiske tumorer i mus, der modtog ortotopisk injektioner fra hver gruppe inokuleret med OVOL udtrykkende celler eller kontrol PC3-EMT14. Bemærk den højere E-cad og lavere ZEB1 ekspression i OVOL-udtrykkende cancerceller. Scale bar repræsenterer 100 um. Den IHC viser et repræsentativt farvning af en ud af tre sektioner med lignende resultater

Grafer viser middelværdi +/- sem.; p-værdier blev beregnet og repræsenteret ** p 0,01. Se også figur S4.

IHC farvning af tumorer afslørede, at PC3-EMT14 tumorer (ortotopisk og metastaser) er overvejende mesenkymale og er for det meste negative for E-cad-ekspression og positiv for ZEB1 (figur 4E og Figur S4A). Disse mesenkymale celler kan proliferere og danne metastaser. Dette blev yderligere demonstreret ved Ki67 positiv farvning af E-cad negative celler i metastatiske tumor sektioner af PC3-EMT14 mus (Figur s4b). Selvom vi ikke kan udelukke muligheden for forbigående MET efterfulgt af EMT, disse resultater tyder på, at mesenkymale celler ikke behøver at gennemgå behandling for at kolonisere tumoren. I modsætning hertil OVOL-udtrykkende celler dannede ortotopisk tumorer og metastaser med stærk epitelial fænotype, kendetegnet ved høj ekspression af E-cad og sænkes ZEB1; som kraftigt antyder, at OVOL-TF’er inducere og stabilisere MET i disse celler (Figur 4E og Figur S4A).

OVOL TF’er iscenesætte en transkriptionel og splejsning-regulerende program, der inducerer MET i humane cancerceller

Vi næste kiggede for ensartede resultater ved hjælp af væv-cDNA arrays fra sektioner af humane prostata cancer tumorer (n = 40), ved at evaluere ekspressionen af ​​E-cad, OVOL1, og OVOL2. For at demonstrere sammenhængen mellem E-cad og OVOL-udtryk vi normaliseret hver prøve værdi til den gennemsnitlige værdi for alle tumorprøver. Vi observerede en stærk korrelation mellem E-cad og OVOL1 (r = 0,66) og OVOL2 (r = 0,7) i alle testede prostata tumorvæv (figur 5A)

(A) qPCR:. CDNA fra human primær prostatacancer væv (n = 40; Origene) blev analyseret for ekspressionen af ​​E-cad, OVOL1 og OVOL2. Resultaterne blev normaliseret til p-actin og vist i forhold til gennemsnittet af alle kræft prøver til hvert gen som:.

log ((Værdi af Gene (X) for en prøve) /(Værdi af Gene (X ) for Average Cancer)). De eksempler værdier er vist i dot plots og korrelationen af ​​OVOL1 eller OVOL2 udtryk med E-cad blev beregnet (r). Grafen viser et repræsentativt eksperiment ud af to med lignende resultater

(B) Venn-diagram:. Viser RNA-seq resultater af differentielt udtrykte gener fælles i OVOL udtrykkende celler og PC3-Epi, i forhold til PC3- EMT14. Skæringspunktet mellem A og B repræsenterer en fælles epitelial transkriptionel underskrift af 277 gener. RNA-seq data blev analyseret fra mindst to biologiske replikater for hver cellelinje

(C) Dot plot:. Expression korrelation analyser af de 277 gener identificeret i epitel signatur fra panelet (B). Korrelation er afbildet mellem PC3-Epi, PC3-EMT14-OVOL1 eller PC3-EMT14-OVOL2

(D) Venn-diagram:. Sammenligner resultaterne fra panelet (B) med de gener, der korrelerer med ekspressionen af OVOLs i 917 menneskelige kræftceller. Fra de 129 gener, der korrelerede (r 0,5) med OVOLs udtryk i 917 cancer cellelinjer, er 67 gener fremkaldt af ekspression af både OVOL1 og OVOL2 i PC3-EMT14 (C krydset D)

(E) Heat map: ConceptGen analyse af 67 gen-signatur fra panelet (D) viste en liste over 18 kommenterede gener med funktioner i forbindelse med epitelial tilstand af cellerne

(F) tabel:. 45 gener negativt korreleret med OVOL2 udtryk (r -0,5) på tværs 917 cancer cellelinjer. Blandt disse 45 gener, er de 10 vist også nedreguleret af OVOL2 udtryk i PC3-EMT14. §§2.086.13/4.812.91/2.31+NM_016351ADAM221.000.400.4+NM_014324AMACR5.292.350.45+NR_036556ANKRD540.9900+NM_001010986ATP11C4.321.500.35+NM_174957ATP2A30.2600+NR_024597C11orf7300.46INF+NM_001001389CD440.395.1313.20+NM_001185177CES300.31INF+NM_203356CTAGE50.550.130.24+NM_001085460CTNND112.895.420.42+NM_133375DIS3L1.5000+NM_004432ELAVL21.450.370.26+NM_001135023ELMOD3*0.352.497.06+NM_001135022ELMOD3*3.761.850.49+NM_203343EPB4100.97INF+NM_001184939EPB41L5*1.493.662.47+NM_020909EPB41L5*1.740.620.36+NM_017848FAM120C1.860.920.5+NM_001015045FAM13A3.331.560.47+NM_001134456FAM55C5.552.650.48+NM_000802FOLR10.060.325.44+NM_001018100GCOM11.144.523.96+NM_001193322IKBKE0.9000+NM_016291IP6K26.1000+NM_177535_1MAGED4B9.113.070.34+NM_145687MAP4K422.7410.810.48+NM_001042453MST400.31INF+NM_022764MTHFSD1.670.750.45+NM_203318MYO18A2.385.782.43+NM_001098623OBSCN0.220.673+NM_001128629PAK63.016.252.07+NM_001166109PALLD1.846.803.69+NM_001146105PARP95.5311.412.06+NM_001184917PCYT21.103.142.85+NM_153321PMP2213.015.040.39+NM_182948PRKACB3.740.900.24+NM_001164758PRKAR1B*1.404.293.06+NM_001164759PRKAR1B*5.132.190.42+NM_002840PTPRF1.696.523.85+NM_144489RGS35.161.430.28+NM_138484SGOL100.41INF+NM_001135054SIGIRR15.506.130.4+NM_020428SLC44A2*5.8922.833.88+NM_001145056SLC44A2*28.715.320.19+NM_001104590SLFN111.800.600.33+NM_001184749SLITRK40.280.090.32+NM_001128210SPRED24.300.370.09+NM_001198531TCF7L22.050.740.36+NM_001167912VEPH14.4100+NM_014667VGLL42.556.172.41+NM_139119YY1AP12.084.912.36+NM_001145448ZNF2000.500.150.3+Table 0,001.