PLoS ONE: Udarbejdelse af nanobubbles Regnskabsmæssig Androgen receptor siRNA og deres inhibitoriske Virkninger på androgen-uafhængige prostatakræft når Kombineret med Ultrasonic Irradiation

Abstrakt

Målsætning

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge nanobubbles transporterer androgen receptor (AR) siRNA og deres

in vitro

in vivo

antitumorvirkninger, når de kombineres med ultrasonisk bestråling, på androgen-uafhængig prostatacancer (AIPC).

Materialer og metoder

nanobubbles bærer AR siRNA blev fremstillet ved anvendelse af poly-L-lysin og elektrostatiske adsorptionsmetoder. Brug af c4-2 celle aktivitet som en test indeks blev de optimale bestråling parametre (herunder nanobubble nummer /celleantal ratio, mekanisk indeks [MI], og bestråling tid) bestemmes og anvendes til transfektion af tre humane prostatacancer-cellelinier (C4 -2, LNCaP, og PC-3 celler). De AR ekspressionsniveauer blev undersøgt med RT-PCR og Western blot-analyse. Derudover blev virkningerne af nanobubbles og kontrol mikrobobler navngivne SonoVue vurderet via billedbehandling i en c4-2 xenograft model. Endelig blev vækst og AR udtryk for syv grupper af tumorvæv vurderet ved hjælp af c4-2 xenograft musemodel.

Resultater

nanobubbles havde en gennemsnitlig diameter på 609,5 ± 15,6 nm og kunne effektivt binde sig til AR siRNA. Under de optimerede betingelser for en nanobubble nummer /celleantal forhold på 100:1, en MI på 1,2, og en bestrålingstid på 2 min, den højeste transfektions- satser i c4-2, LNCaP, PC-3-celler var 67,4%, 74,0%, og 63,96%, henholdsvis. I c4-2 og LNCaP-celler, behandling med disse bindende nanobubbles plus ultralydsbestråling inhiberede signifikant cellevækst og resulterede i, at AR mRNA og proteinekspression. Derudover viste kontrast-forstærket ultralyd, at de nanobubbles opnået stærkere signaler end SonoVue kontrol i det centrale hypovaskulære areal af tumorer. Endelig er den anti-tumor effekt af disse nanobubbles plus ultralyd bestråling var mest markant i xenograft tumor model sammenlignet med de andre grupper.

Konklusion

nanobubbles bærer AR siRNA kan potentielt anvendes som gen vektorer i kombination med ultrasonisk bestråling til behandling af AIPC

Henvisning:. Wang L, Zhang M, Tan K, Guo Y, Tong H, Fan X, et al. (2014) Udarbejdelse af nanobubbles Regnskabsmæssig Androgen receptor siRNA og deres inhiberende effekter på androgen-uafhængige prostatakræft når Kombineret med Ultrasonic bestråling. PLoS ONE 9 (5): e96586. doi: 10,1371 /journal.pone.0096586

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: Februar 23, 2014 Accepteret: April 9, 2014; Udgivet: 5 maj 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.970.830) og Key Project af Natural Science Foundation of Chongqing City (cstc2012jjB0072). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det er velkendt, at prostatakræft er afhængig af androgener [1]. Derfor har androgen deprivation været den vigtigste behandling af fremskreden prostatacancer. Med denne terapi imidlertid sygdommen progredierer hurtigt til androgen-uafhængig prostatacancer (AIPC) hos de fleste patienter [2], [3]. I øjeblikket er der ingen effektive langsigtede behandlinger for AIPC. Udvikling af nye behandlingsstrategier for AIPC forbliver attraktive, men er en udfordrende problem i klinisk onkologi. Tidligere undersøgelser har vist, at væksten af ​​AIPC afhænger af androgen receptor (AR). Blokering AR udtryk har stort potentiale til behandling af AIPC [4].

Undersøgelser har vist, at undertrykke AR udtryk med RNA-interferens (RNAi) teknologi er en effektiv måde at hæmme væksten af ​​prostatacancerceller, hvilket indikerer, at denne metode kan have potentiale til at overvinde forhindringer forbundet med AIPC behandling [5]. I vores tidligere undersøgelser blev AR dobbeltstrenget RNA (dsRNA) med en høj specificitet for AR gener designet til at blokere ekspressionen af ​​AR i AIPC celler og at inhibere cellevækst [6]. Men denne type genterapi tilgang er vanskelig at anvende i et klinisk miljø på grund af lav gen transfektionseffektivitet. En af de vigtigste årsager til lav transfektionseffektivitet er manglen på en effektiv, ikke-invasiv

in vivo

målrettet genlevering system. I de senere år er ultralyd-forgængelige mikrobobler vist sig at være en lovende metode til genterapi. Faktisk kan ultralyd-medieret mikroboble destruktion ikke blot forbedre gen transfektionseffektivitet men kan også anvendes til den vævsspecifikke afgivelse af terapeutiske midler [7], [8].

Med udviklingen af ​​ultralyd molekylær billeddannelse og nanoteknologi, størrelsen af ​​mikrobobler fortsætter med at falde, og mikro- til nano-skala størrelser er nu opnåelige. Nanobubbles tilbyder flere fordele i målgenet transfektion [9]. For eksempel er nanobubbles kendetegnet ved stærk gennemtrængende magt og stabil ydelse, som tillader dem at komme ind tumorvæv via tumorvaskulaturen [10]. Derfor i denne undersøgelse, vi kombineret RNAi teknologi med nanoteknologi ved forbereder nanobubbles transporterer AR lille interfererende RNA (siRNA). De fysiske egenskaber af disse bobler blev derefter analyseret. Desuden blev de forberedte nanobubbles anvendes til siRNA transfektion af AIPC celler sammen med ultralyd strålebehandling at inducere frigivelse af siRNA udskrifter.

in vitro

transfektionseffektiviteten blev systematisk undersøgt. Endvidere blev antitumoreffektiviteten af ​​nanobubbles evalueret under anvendelse billeddannende undersøgelser og en tumorvækstinhibering assay i en mus xenotransplantat prostatakræft model. Resultaterne præsenteret her giver eksperimentel støtte til brug af nanobubbles transporterer AR siRNA i kombination med ultralyd bestråling som en potentiel effektiv terapi for AIPC.

Materialer og metoder

Syntese af AR siRNA

Baseret på den tidligere bestemte 19-bp target sekvens af AR cDNA blev AR siRNA syntetiseret med Silencer siRNA Construction Kit (Ambion, Austen City, USA) [6]. Cy3-mærket AR siRNA blev derefter syntetiseret ved hjælp af Silencer siRNA Cy3 Mærkning Kit (Ambion) for fluorescens sporing studier. Koncentrationen af ​​det syntetiserede siRNA blev bestemt under anvendelse af et spektrofotometer, og de siRNA’er blev fortyndet til 50 pM til anvendelse i denne undersøgelse.

Fremstilling af nanobubbles transporterer AR siRNA og karakterisering af deres fysiske egenskaber

en suspension af lipid excipienser, herunder dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), dipalmitoylphosphatidsyre (DPPA), og dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG) (i et molforhold på 90:2:5:3), blev fremstillet i polyethylenglycol (i et molforhold på 94:6). Suspensionen blev opdelt i alikvoter i 1 ml hætteglas og lyofiliseres. De frysetørrede suspensioner blev rehydreret med 1 ml hydratiseringsopløsningen med 50% glucose, propylenglycol og glycerin i volumen i 08:01:01. Perfluorpropan (C

3F

8) blev derefter tilsat til hætteglassene til at erstatte luften, og en ST-B-serien amalgamator (AT M Biomaterials Co Ltd, Beijing, Kina) blev anvendt til fremstilling af emnet nanobubbles med en driftsfrekvens større end 4.500 rpm og en oscillation på 90 s [11].

en poly-L-lysin (PLL) opløsning (1 mg /ml) blev fremstillet med sterilt dobbeltdestilleret vand . PLL opløsning blev derefter blandet med de datoer nanobubbles på en 01:01 (v /v) forhold og inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter. Blandingen blev derefter vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) for at fjerne eventuelt ubundet PLL. Cy3-mærket AR siRNA blev tilsat til denne nanobubble opløsning ved en 01:01 (v /v) forhold, og blandingen blev inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter. Derefter blev 200 pi PBS tilsat til nanobubble blandingen, og suspensionen blev vasket ved centrifugering to gange ved 600 rpm i 3 min for at fjerne eventuelt ubundet AR siRNA, hvorefter nanobubbles mærket med blev opnået både AR siRNA og PLL. Den nanobubble opløsning og den vandige opløsning indeholdende de ubundne siRNA blev derefter kogt i 5 minutter, hvorefter den optiske densitet blev målt ved 260 nm med et spektrofotometer. Antallet af nanobubbles blev målt ved anvendelse af et hæmocytometer [10]. Følgende formel blev brugt til at beregne siRNA belastningsevne:

størrelse, distribution og zeta potentiale både tomme og forberedte nanobubbles med AR siRNA blev målt med en Zetasizer Nano ZS90 partikelstørrelsen analysator (Malvern Instruments Ltd , Worcestershire, UK). Formen og spredning af disse nanobubbles blev også undersøgt ved hjælp af fluorescens mikroskopi (OLYMPUS LX71, Olympus, Tokyo, Japan).

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Tre humane prostatakræft-cellelinier blev brugt i transfektionsundersøgelser: LNCaP (androgenafhængige celler med AR-ekspression, ATCC, Manassas, VA, USA), c4-2 (AIPC celler med AR-ekspression, ViroMed Laboratories Inc., Minnetonka, MN, USA), og PC-3 (uden AR-ekspression, ATCC, Manassas, VA, USA). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI-1640-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum i en CO 5%

2 inkubator ved 37 ° C. Rutinemæssige passager blev udført med trypsin fordøjelse. En dag før behandling med ultralyd bestråling blev alle cellerne podet i dyrkningsplader ved en konfluens på 50%.

Optimering af bestråling betingelser for transfektion af nanobubbles bærer AR siRNA

For at undgå uspecifik negativ virkninger på celle aktivitet, blev den passende koncentrationsinterval for tomme nanobubbles og destruktive bestrålingsforhold fastlægges inden den

in vitro

celle eksperimenter.

Ultrasonic bestråling blev udført med PHILIPS iU22 ultralyd-system ( Royal Dutch Philips Electronics Ltd, Holland). Ultralydsonden blev fikseret med en konsol; den udstrålende overflade står lodret opad og blev dækket jævnt med ultralyd gel; en 24-brønds plade med 1,5 × 10

5 c4-2 celler dyrket i hver brønd blev placeret vandret på den udstrålende overflade af sonden for at sikre, at hver brønd blev helt åbent udstrålende kilde; den nanobubble suspension blev tilsat til hver brønd og tilstrækkeligt blandet; og ultrasonisk bestråling blev udført med variationer i flere parametre, herunder koncentrationen af ​​datoer nanobubbles (vurderet som nanobubble nummer /celleantal forhold), den mekaniske indeks (MI, en afspejling af ultralydsenergi beregnes ved at dividere den maksimale negative akustiske tryk ved kvadratroden af ​​frekvensen), og bestrålingstiden. I detaljer, for at vurdere virkningen af ​​den tomme nanobubble koncentrationen blev seks grupper etableret på grundlag af deres nanobubble nummer /celle nummer ratio, som var 0, 45:1, 90:1, 135:1, 180:1 eller kontrol gruppe (normale celler uden behandling som kontrol); transduceren frekvens var 1,0-5,0 MHz, varigheden var 30 s, og MI var 1,0. Yderligere fem grupper blev etableret med varierende myokardieinfarkter, nemlig 0,1, 0,6, 1, 1,4, eller kontrolgruppen (normale celler uden behandling som kontrol); transduceren frekvens var 1,0-5,0 MHz, varigheden var 30 s, og det nanobubble nummer /celle nummer forholdet var 100:1. Fem grupper blev etableret for at evaluere virkningen af ​​den varighed, som var 10 s, 30 s, 1 min, 2 min, eller kontrolgruppen (normale celler uden nogen behandling som kontrol); transduceren frekvens var 1,0-5,0 MHz, MI var 1,0, og det nanobubble nummer /celle nummer forholdet var 100:1. Efter ultrasonisk bestråling blev cellerne dyrket i 24 timer, og deres cellevækst blev assayet ved anvendelse af en blod optælling instrument; de celletal blev brugt som en test-indeks til at vurdere virkningerne af disse parametre på celle aktivitet. Alle assays blev gentaget mindst tre gange, og en række ikke-destruktive betingelser for

in vitro

ultrasonisk bestråling blev bestemt.

Transfektionseffektivitet assay i prostatacancerceller

LNCaP blev c4-2 og PC-3-celler podet i 24-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

4 celler per brønd og dyrket natten over. Nanobubbles transporterer Cy3-mærket AR siRNA blev derefter tilsat til brøndene i hver celle kultur plade og transficeret ind i disse tre cellelinier under det forudbestemte område af ikke-destruktive betingelser. Transfektionseffektiviteten blev derefter vurderet under anvendelse af fluorescensmikroskopi. Procentdelen af ​​fluorescerende celler (transfektion rate) blev bestemt ved flowcytometri. Kort fortalt blev cellerne resuspenderet efter trypsinfordøjelse at frembringe en enkelt-cellesuspension. Flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, NJ, USA) blev anvendt til at måle fluorescensintensiteten af ​​10.000 celler, og resultaterne blev analyseret ved anvendelse FlowJo 7.65 software. Celler blev gated at beregne procentdelen af ​​transficerede celler inden for den samlede cellepopulation, hvilket muliggør bestemmelse af de optimerede parametre for at opnå den højeste transfektionseffektivitet. Alle analyser blev gentaget mindst tre gange.

cellevækstinhiberingen assay

Hver af de tre prostatacancercellelinjer blev delt i seks celle behandlingsgrupper ifølge de reagenser og betingelser, der anvendes (tabel 1). Alle grupper blev transficeret under anvendelse af førnævnte ultralydsbestråling metode under de relevante parametre: frekvens på 1,0-5,0 MHz, mekanisk indeks (MI) på 1,2, og varigheden af ​​udsættelse for B-mode ultralyd af 2 min. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) blev anvendt dagligt fra den første til den sjette dag efter transfektion for at vurdere cellevækst. Hver gruppe havde 10 tilsvarende brønde test og 2 negative kontrolbrønde. Absorbansværdierne ved 450 nm [D (450 nm)] blev analyseret med en mikropladelæser (model 550, Bio-Rad, USA). En kurve cellevækst blev opnået ved grafer tid (X-akse) versus den respektive absorbansværdi (Y-aksen), og cellevækstinhiberingen rate (IR) blev beregnet ud fra følgende formel:

Desuden blev cellemorfologien 48 timer efter transfektion observeret under anvendelse af fluorescensmikroskopi.

Påvisning af AR mRNA-ekspression niveau ved RT-PCR

LNCaP og c4-2-celler blev transficeret under anvendelse af førnævnte ultralyd bestråling fremgangsmåde med de ovennævnte parametre. Totalt RNA blev ekstraheret fra alle grupperne 48 timer efter ultrasonisk bestråling. En RT-PCR-analyse blev udført under anvendelse af en RNA-PCR-kittet (AMV Ver. 3.0, Kyoto, Japan), og glyceraldehyd phosphat dehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som kontrol. Primersekvenserne (5 ‘→ 3’) for AR var AAG CCA TTG AGC CAG GTG TAG TG (opstrøms) og AAC CAG ATG AGG GGC GAA GTA GA (nedstrøms), og primersekvenserne for GAPDH var ACC CAT CAC CAT CTT CCA GGA G (opstrøms) og GAA GGG GCG GAG ATG ATG AC (nedstrøms). Disse primere amplificerede et 275 bp AR fragment og et 159 bp GAPDH-fragment, hhv. Revers transkription-betingelserne var 50 ° C i 30 minutter, 99 ° C i 5 minutter, og 5 ° C i 5 minutter. PCR-betingelserne var 94 ° C i 2 min; 32 cykler ved 94 ° C i 30 s, 57 ° C i 30 s og 72 ° C i 1 min; og 72 ° C i 10 min. RT-PCR-produkter blev fyldt på en 2% agarosegel. Efter elektroforese blev båndene visualiseret under anvendelse af et Bio-Rad GelDoc 2000 gel imaging system (Bio-Rad, CA, USA) og blev densitometrisk analyseret under anvendelse ImageJ software (NIH, https://rsb.info.nih.gov/ij/). Alle analyser blev gentaget fem gange.

Påvisning af AR-proteinekspression niveau ved Western blot-analyse

LNCaP og c4-2-celler blev transficeret under anvendelse af førnævnte ultralydsbestråling metode med de optimerede parametre. Totalt cellulært protein blev ekstraheret fra alle grupperne under anvendelse af en celle lysis buffer 48 timer efter den ultrasoniske bestråling. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af Bradford-assayet. En 50-ug portion af hver celle lysat blev separeret på en 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i 4 timer ved stuetemperatur og inkuberet med et primært antistof (muse monoklonalt antistof mod humant Ar; Santa Cruz Biotechnology, Californien, USA) ved en 1:400 fortynding ved 37 ° C i 4 h. Membranerne blev derefter vasket med Tris-bufret saltvand /Tween (TBST) buffer og inkuberet med et sekundært antistof (gede-anti-muse-IgG; Zsjqbio, Beijing, Kina) (1:1200 fortynding) ved 37 ° C i 2 timer. En forøget kemiluminescens (ECL) reagens blev derefter anvendt til at detektere proteinbåndene ved at udsætte blots autoradiografisk film. En kvantitativ billedanalyse blev udført under anvendelse Mængde One 4,52 software (Bio-Rad). GAPDH blev anvendt til at normalisere prøverne. Alle analyser blev gentaget fem gange.

Imaging af nanobubbles bærer AR siRNA i en mus xenotransplantationsmodel

Dette dyr undersøgelse blev godkendt af Laboratory Animal Welfare og etiske komité i den tredje Military Medical University , Kina. Fem mandlige SCID mus, der vejede 22-25 g (5-7 uger gamle) var xenotransplanteret med 3 × 10

6 c4-2 prostatacancerceller i 100 pi Matrigel (BD Biosciences, Basel, Schweiz). Tumorer fik lov til at blive etableret og vokse til en diameter på 10-15 mm. Dyrene blev derefter bedøvet med en intraperitoneal injektion af 100 pi 1% pentobarbital natrium-opløsning og derefter fastgjort i bugleje. To-dimensionelle ultralyd billeder af xenotransplanterede tumorer blev erhvervet ved hjælp af en PHILIPS iU22 ultralydssystemet. Nanobubbles transporterer AR siRNA blev derefter administreret til musene via haleveneinjektion i en dosis på 5 ml /kg legemsvægt. De parametre, der anvendes til at opnå ultralydsbilleder var som følger: sonde frekvens = 5-12 MHz; MI = 0,4; og gevinst = 70%. Sonden blev fastsat, og kontrast-forstærket dynamiske billeder blev taget til fange ved hjælp af ultralyd arbejdsstation software. Mikron størrelse mircrobubbles opkaldt SonoVue kontrastmiddel (Bracco, Milano, Italien) blev anvendt som en kontrol under de samme betingelser. En kvantitativ analyse blev udført ved hjælp af Philips QLAB 8.1 software (Royal Dutch Philips Electronics Ltd, Holland).

In vivo

tumorvækst inhiberingsassay

Dette dyr undersøgelse blev godkendt af Laboratory Animal Welfare og etiske komité i den tredje Military Medical University, Kina. Fifty-seks mandlige SCID-mus, der vejer 22-25 g (5-7 uger gamle) var xenotransplanteret med 3 × 10

6 c4-2 celler i 100 pi Matrigel. Dyret Undersøgelsen blev godkendt af Animal Ethics Committee of China Farmaceutiske Universitet. Tumorer fik lov til at blive etableret og til at vokse til en diameter på 7-10 mm. De dyr, der bærer tumorxenografter blev derefter tilfældigt opdelt i syv grupper (otte dyr per gruppe). De behandlinger, der anvendes til grupper 1-6 er anført i tabel 1. Gruppe 7 blev administreret nanobubbles transporterer nonsens siRNA + ultrasonisk bestråling. I detaljer, doserne af nanobubbles bærer AR siRNA (ca. 1,6 × 10

6 /ul), tomme nanobubbles, og saltvandsopløsning var 5 ml /kg legemsvægt. Den nøgne AR siRNA dosis var 100 ug pr mus. Alle nanobubbles, nøgne AR siRNA og saltvandsopløsning blev indgivet som en intravenøs bolus via en halevene. Musene i gruppe 3-7 blev derefter bedøvet med isofluran og fastgjort i bugleje. Umiddelbart efter injektion blev tumorxenotransplantater behandlet ved en Philips iU22 ultralydssystemet. Perfusionen af ​​nanobubbles i tumoren blev visualiseret i realtid ved hjælp af ultralyd (5-12 MHz) ved lav akustisk effekt (MI 0,4) for at minimere nanobubble ødelæggelse. Ved visualisering af nanobubbles inden for en tumor, blev nanobubbles burst ved at øge MI til 1,2 med en frekvens på 1-5 MHz. En varighed ultralyd eksponering på 30 min blev anvendt til at sikre, at alle nanobubbles blev ødelagt. Under behandlingen blev transduceren påføres i en cirkulær bevægelse for at sikre, at hele tumor xenograft modtaget ultralyd eksponering. For alle de dyr, blev behandlingen udført tre gange, en gang hver 3 d (på dag 0, dag 3 og dag 6). Den maksimale diameter (a, mm) og den korteste diameter (b, mm) af hver tumor blev målt hver 3 d begyndende på den første behandlingsdag (dag 0) og slutter 21 dage efter den første behandling (dag 21). Tumoren volumen (TV) blev beregnet efter følgende formel: TV = 1/2 × a × b

2. Den relative tumor volumen (RTV) blev derefter beregnet ud fra følgende formel: RTV = TV

n /TV

0 × 100%, hvor TV

n er tumor volumen målt på dag n og TV

0 er tumorvolumen på dag 0. kurve tumorvækst blev plottet baseret på RTV. På dag 21 blev alle dyrene aflivet, og tumorerne blev udnyttet og vejet. Tumoren væksthæmning sats (TGIR) blev beregnet ved hjælp af følgende formel:. TGIR = (1-TWT /TWC) × 100%, hvor TWT og TWC er middelværdi tumor vægt i de behandlede og kontrolgrupperne de hhv

Påvisning af AR mRNA-ekspression i prostata tumorer ved QRT-PCR

Total RNA blev isoleret fra tumorvæv efter de anvisninger, der følger med SuperScript Vilo RT-PCR Synthesis Kit (Invitrogen). Koncentrationen og integritet af RNA blev bestemt ved spektrofotometrisk analyse ved A260 og A280. Ca. 500 ng af total RNA blev revers-transkriberet med Superscript III (Invitrogen) under anvendelse af N6 vilkårlige primere. Ca. 2 pi cDNA blev amplificeret ved anvendelse af ettrins realtids-PCR på en Applied Biosystems 7500 FAST maskine med standardprogrammet. De relative ekspressionsniveauer af AR mRNA blev beregnet under anvendelse af formlen, hvor.

Påvisning af AR-protein ekspressionsniveau i prostatatumorer ved Western blot-analyse

xenograft tumorvæv blev homogeniseret med 1 ml radioimmunudfældning assay (RIPA) buffer indeholdende protease inhibitor og centrifugeret ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten blev opbevaret ved -80 ° C. Totalt protein blev separeret på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til en PVDF-membran ved 100 V i 50 minutter. De Western blot trin var de samme som dem, der er beskrevet for den

in vitro

eksperiment.

Statistisk analyse

blev udført Den statistiske analyse med SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitative data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (± SD). En envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at sammenligne midlerne til multiple grupper (n 2). Independent-prøver t-tests anvendtes til sammenligning midlerne til hver behandlingsgruppe og dens relative kontrolgruppe. En P-værdi (P) 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Fysiske egenskaber af nanobubbles bærer AR siRNA

Billeder opnået under lyse-field mikroskopi viste, at. de nanobubbles var homogen i størrelse og fordeles jævnt med ingen signifikant aggregering (fig. 1A). De regelmæssige nanobubbles blev observeret under et optisk mikroskop (1000 x) (fig. 1C). Fluorescensmikroskopi bekræftede, at vores siRNA mærkning fremgangsmåde var effektive; kun nanobubbles konjugeret med Cy3-mærket AR siRNA udviste rød fluorescens (fig. 1B), og ingen fluorescens blev observeret med de regelmæssige nanobubbles (fig. 1d). De med en partikelstørrelse analysator resultater viste, at de nanobubbles havde en gennemsnitlig diameter på 609,5 ± 15,6 nm (interval 269 til 1030 nm), og deres zetapotentialet var -29,9 ± 6,6 mV. De blanke nanobubbles havde en gennemsnitlig diameter på 509,3 ± 45,19 nm (range, 324 til 930 nanometer), og zetapotentialet af disse bobler var -27,3 ± 6,4 mV. Som vist i fig. 2, indlæses mængden af ​​siRNA steg på en dosisafhængig måde. Den gennemsnitlige AR siRNA lastning evne af nanobubbles var (18,94 ± 0,35) × 10

-9 nmol /nanobubble.

(A) PLL nanobubbles under lyse-field mikroskopi. (B) Indlysende fluorescens blev observeret i PLL nanobubbles. (C) Blanke nanobubbles under lyse-field mikroskopi. (D) nr fluorescens blev observeret i de tomme nanobubbles. De røde pile i billederne, angiver nanobubbles (1000 ×).

Optimale bestråling betingelser for transfektion

Fig. 3 viser virkningerne af forskellige parametre i ultralyd bestråling på c4-2 cellevækst. Et volumen på nanobubbles større end 6 pi (den nanobubble nummer /celleantal forholdet var 135:1) resulterede i et signifikant fald i cellevækst (P 0,05 sammenlignet med kontrollen) (fig 3A.). En MI større end 1,4 forårsagede også en signifikant inhibering af cellevækst (P 0,05 sammenlignet med kontrollen) (Fig 3B.). Ikke desto mindre blev virkningen af ​​bestråling tid på cellevækst sig at være temmelig lav; var der næsten ingen signifikante forskelle i cellevækst mellem grupperne behandlet med forskellige bestrålingstider (fig. 3C). Således blev destruktive bestrålingsforhold sidste ende bestemt til at være en nanobubble nummer /celleantal forholdet 135:1 ( 6 pi nanobubbles), en MI. 1.4, og en bestrålingstiden ≤2 min

(A) virkningen af ​​nanobubble fusion (med en MI på 1,0 og en bestrålingstid på 30 s), U: udsat for ultralyd; (B) indvirkningen af ​​MI, med en nanobubble nummer /celle nummer forholdet 100:1 og en bestråling på 30 s; og (C) indvirkningen af ​​bestråling tid, med en nanobubble nummer /celle nummer forholdet 100:1 og en MI på 1,0. Celler blev talt 24 timer efter ultrasonisk bestråling. Alle assays blev gentaget tre gange. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 3). Stjerner (*) repræsenterer signifikansniveau sammenlignet med kontrolgruppen (P 0,05)

Transfektionseffektivitet assay i prostata kræftceller

Red fluorescens (vejledende af Cy3-mærket AR. siRNA) blev observeret i de fleste dele af cytoplasmaet i alle tre prostatacancercellelinjer, men det ikke blev påvist i kernen (fig. 4). Disse resultater indikerer, at Cy3-mærket AR siRNA blev transficeret med succes. Procentdelene af transficerede celler i disse cellelinjer under forskellige ultralydsbestråling betingelser er vist i tabel 2.

Red fluorescens i cytoplasmaet indikerer, at Cy3-mærket AR siRNA held blev transficeret (400 ganges forstørrelse).

Som vist i tabel 2, når nanobubbles transporterer AR siRNA blev administreret i en nanobubble nummer /celleantal forhold på 100:1 (5 pi nanobubbles), procentdelen af ​​transficerede celler øges sammen med stigninger i MI og bestrålingstid. Den højeste transfektionseffektivitet blev opnået med en MI på 1,2 og en bestrålingstid på 2 min. Derfor er de optimerede parametre for at opnå den højeste transfektionseffektivitet var som følger: 5 pi nanobubbles, en MI på 1,2, og en bestrålingstid på 2 minutter; følgende

in vitro

analyser udførtes ved hjælp af disse parametre.

Cell væksthæmning

CCK-8 analyse fra den første til den sjette dag efter transfektion viste, at cellevækst blev inhiberet i gruppe 3, 5 og 6 i c4-2 og LNCaP-celler (fig. 5A og 5B). På den sjette dag efter transfektion, de c4-2 celler i gruppe 6 vises den højeste væksthæmning hastighed 64,7%. Der blev imidlertid ingen signifikant cellevækstinhiberingen observeret i PC-3-celler, og vækstinhibering sats i gruppe 6 var kun 0,9% (tabel 3).

observeredes signifikant inhibering af cellevækst i gruppe 3, 5 og 6 for begge cellelinier. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (n = 10). Grupper 1-6 repræsenterer nøgne AR siRNA + tomme nanobubbles, nanobubbles bærer AR siRNA, nøgne AR siRNA + ultralyd bestråling, tomme nanobubbles + ultralyd bestråling, nøgne AR siRNA + blank nanobubbles + ultralyd bestråling, og nanobubbles bærer AR siRNA + ultralyd bestråling, henholdsvis .

AR mRNA ekspressionsniveauer analyseret ved RT-PCR

agarosegelelektroforese resultater efter RT-PCR er vist i fig. 6A. Bands af 275 bp (AR) og 159 bp (GAPDH) blev observeret i alle grupper af både c4-2 og LNCaP celler. AR bånd blev ikke observeret i nogen af ​​de PC-3 grupper, fordi PC-3 celler ikke udtrykker AR. Resultaterne af den kvantitative analyse (fig. 6B) viste, at i begge cellelinier blev AR mRNA-ekspression undertrykte signifikant i gruppe 3, 5, og 6 sammenlignet med kontrolgruppen (gruppe 1). Den højeste undertrykkelse blev opnået i gruppe 6.

Lanes 1-6 repræsenterer grupper 1-6, henholdsvis (koncernen1: siRNA + NB, Group2: siRNA-NB, Group3: siRNA + USA, Group4: NB + US , gruppe 5: siRNA + NB + USA, GRUPPE6: siRNA-NB + US). Størrelserne af markørerne (M Lane, fra bund til top) er 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, og 450 bp. GAPDH tjente som en intern reference. Den højeste suppression af AR mRNA-ekspression blev observeret i Gruppe 6. (A) og (B): Bands of RT-PCR-produkter og resultaterne af billedet kvantificering; dataene i histogrammerne repræsenterer middelværdier ± SD af fem uafhængige forsøg. (* P 0,05 og ** P 0,01 vs. Gruppe 1 c4-2 celler; # P 0,05 og ## P 0,01 vs. Gruppe 1 LNCaP celler).

Post-transfektion AR proteinekspressionsniveauer analyseret ved Western blot-analyse

Western blot resultaterne er vist i fig. 7. AR-proteinekspression blev undertrykt i gruppe 3, 5 og 6 i c4-2 og LNCaP-celler. Den højeste undertrykkelse blev observeret i gruppe 6, som var i overensstemmelse med de RT-PCR-resultater

Lanes 1-6 repræsenterer grupper 1-6, henholdsvis (koncernen1:. SiRNA + NB, Group2: siRNA-NB, Group3 : siRNA + USA, Group4: NB + USA, gruppe 5: siRNA + NB + USA, GRUPPE6: siRNA-NB + US). GAPDH protein tjente som en intern reference. Den højeste suppression blev observeret i gruppe 6. (A) og (B): Immuno-bånd og resultaterne af billedet kvantificering; dataene i histogrammerne repræsenterer middelværdier ± SD af fem uafhængige forsøg. (* P 0,05 og ** P 0,01 vs. Gruppe 1 c4-2 celler; # P 0,05 og ## P 0,01 vs. Gruppe 1 LNCaP celler).

Imaging af nanobubbles transporterer AR siRNA i c4-2 prostatakræft xenograftmodel

Kontrast-forstærket dynamiske billeder af nanobubbles bærer AR siRNA er vist i fig. 8. Resultaterne viste, at nanobubbles opnås stærkere signaler end SonoVue i den centrale hypovaskulære område af tumorerne. De billeddata analyse (tabel 4) viste, at disse nanobubbles havde signifikante stigninger i peak intensitet og billedbehandling varighed i forhold til SonoVue kontrol (P 0,05). I det omkringliggende tumor område, de nanobubbles vises også signifikant længere billeddannelse varigheder end SonoVue (P 0,05).

(A) A xenograft tumor eksemplar;