PLoS ONE: antitumorale Effekt af Protease Inhibitor gabexate mesilat i tyktarmscancerceller Harbouring KRAS, BRAF og PIK3CA Mutations

Abstrakt

ansættelse af anti-epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) antistoffer repræsenterer en rygrad terapeutiske muligheder for behandling af metastatisk kolorektal cancer (mCRC). Men denne terapi er dårligt effektive eller ineffektive i uselekterede patienter. Mutationer i KRAS, BRAF og PIK3CA generne har for nylig vist sig som de bedste prædiktive faktorer for lav /fraværende respons på EGFR-målrettet terapi. På grund af behovet for effektive behandlingsmuligheder for FRK patienter bærer disse mutationer, i denne korte rapport undersøgte vi antitumoraktivitet af proteaseinhibitoren gabexate mesilat, alene og i kombination med anti-EGFR monoklonalt antistof cetuximab, i et panel af humant CRC cellelinier indeholdende et andet udtryk mønster af vildtype /muterede KRAS, BRAF og PIK3CA gener. De opnåede resultater viste, at gabexate mesilat væsentligt hæmmede væksten, invasive potentiale og tumor-induceret angiogenese i alle CRC celler anvendes i denne undersøgelse (herunder dem, huser dobbelt KRAS /PIK3CA eller BRAF /PIK3CA mutation), mens cetuximab påvirkede disse parametre kun i CRC celler med KRAS, BRAF og PIK3CA vildtype. Især blev antitumormakrofagaktivatoren effekt af gabexate mesilat og cetuximab i kombination viser sig at være ikke bedre end den observeret med gabexate mesilat som enkeltstof. Samlet set har disse foreløbige resultater tyder på, at gabexate mesilat kunne repræsentere en lovende behandlingsmulighed for FRK patienter, især for de huser KRAS, BRAF og PIK3CA mutationer, enten som monoterapi eller i tillæg til standard kemoterapi. Yderligere undersøgelser for bedre at belyse gabexate mesilat virkningsmekanisme i CRC celler derfor berettiget

Henvisning:. Brandi G, Tavolari S, De Rosa F, Di Girolamo S, Agostini V, Barbera MA, et al. (2012) antitumorale Effekt af Protease Inhibitor gabexate mesilat i tyktarmscancerceller Harbouring KRAS, BRAF og PIK3CA mutationer. PLoS ONE 7 (7): e41347. doi: 10,1371 /journal.pone.0041347

Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ‘, Italien

Modtaget: Februar 17, 2012; Accepteret: 20 juni 2012; Udgivet: 24 juli 2012

Copyright: © 2012 Brandi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de sidste femten år, indførelse af på mindst seks vigtige lægemidler (oxaliplatin, irinotecan, capecitabin, bevacizumab, cetuximab og panitumumab), efter “æra” af 5-fluorouracil som enkeltstof, har forbedret overlevelse af metastatisk kolorektal cancer (mCRC) patienter op til 24 måneder [ ,,,0],1], [2]. Beskæftigelsen af ​​anti-epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) antistoffer panitumumab og cetuximab, enten som monoterapi eller i tillæg til standard kemoterapi, udgør en rygrad af de terapeutiske muligheder for behandling af mCRC. Imidlertid har lodtrækningsforsøg forudsat overbevisende dokumentation for, at EGFR-målrettet terapi er dårligt effektiv eller ineffektiv i umarkerede FRK patienter. I de seneste år, aktiverende mutationer ved codon 12 og 13 i KRAS onkogen (KRAS

G12V og KRAS

G13D) er dukket op som de bedste prædiktive faktorer for lav /fraværende respons på anti-EGFR-behandling hos disse patienter, enten i første linje eller efterfølgende linjer af behandling [3] – [5]. Af denne grund, er FRK patienter nu profileret for KRAS mutation og ansættelse af cetuximab og panitumumab øjeblikket begrænset kun til dem, dem der bærer KRAS vildtype, som anbefalet af European Medical Agency og American Society of Clinical Oncology [6] . Selv om tilstedeværelsen af ​​vildtype-KRAS synes at være en betingelse for respons på EGFR-målrettet terapi, op til 50-65% af FRK patienter undlader at drage fordel af denne behandling, på grund af yderligere iboende resistensmekanismer [7]. I denne forbindelse inddragelse af BRAF

V600E og PIK3CA

H1074R ved exon 20 mutationer i svigt i en sådan terapi har for nylig vist [7] – [11]. På grund af manglen på en effektiv målrettet terapi, opdagelsen af ​​nye terapeutiske muligheder for FRK patienter med muterede KRAS, BRAF og PIK3CA generne repræsenterer derfor en intens område undersøgelse.

proteasehæmmer gabexate mesilat har vist sig at udøve en betydelig antitumoraktivitet i CRC-celler, både in vitro og in vivo [12]. Men virkningen af ​​dette stof, alene eller i kombination med cetuximab, i humane CRC-celler, der huser et andet udtryk mønster af vildtype /muteret KRAS, BRAF og PIK3CA stadig uløst. Nærværende undersøgelse har til formål at undersøge denne hypotese.

Resultater

Vi foreløbigt valgt et panel af humane CRC celler huser et andet udtryk mønster af vildtype /muteret KRAS, BRAF og PIK3CA gener. Til dette formål, er baseret på Katalog over somatiske mutationer i Cancer (COSMIC) database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/) og på studiet af Jhawer et al. [13], Caco-2, blev SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 CRC-celler valgt (se tabel 1 for deres tilsvarende KRAS, BRAF og PIK3CA status). Især blev der ikke CRC cellelinje med co-forekommende KRAS og BRAF-mutationer fundet og inkluderet i den foreliggende undersøgelse, ifølge tidligere rapporter, der viser et mønster af gensidig eksklusivitet for KRAS og BRAF mutation i menneskets CRC [14]. Virkningen af ​​gabexate mesilat, alene og i kombination med cetuximab, blev derefter undersøgt på Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 cellevækst, invasive potentiale og tumor-induceret angiogenese , da de repræsenterer tre grundlæggende processer i kræft indtræden og progression.

som vist i figur 1, 24 og 48 timers behandling med cetuximab (100 ug /ml) viste sig at påvirke cellernes levedygtighed kun i CRC celler indeholdende vildtype-KRAS, BRAF og PIK3CA gener (Caco-2 og SW48), som forventet. Omvendt gabexate mesilat (0,1-1 mM) inducerede en betydelig mængde tid og dosis-afhængigt fald af denne parameter i alle CRC-cellelinier inkluderet i undersøgelsen (Caco-2: IC

50 48 hrs = 0,31 ± 0,01; SW48 : IC

50 48 timer = 0,33 ± 0,01; HT-29: IC

50 48 timer = 0,55 ± 0,03 mM, Colo205: IC

50 48 timer = 0,46 ± 0,02; SW480: IC

50 48 timer = 0,45 ± 0,02 mm SW620: IC

50 48 timer = 0,39 ± 0,02; RKO: IC

50 48 timer = 0,49 ± 0,01 mm LS174T: IC

50 48 timer = 0,59 ± 0,03; HCT-116: IC

50 48 timer = 0,56 ± 0,0 3 mm). Vi observerede, at virkningen fremkaldt på cellelevedygtighed ved gabexate mesilat alene svarede til det observeret, når dette lægemiddel blev administreret i kombination med cetuximab 100 ug /ml (figur 1).

Evaluering ved MTT-assay af Caco-2 , SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 cellelevedygtighed efter 24 og 48 timers behandling med cetuximab 100 ug /ml og gabexate mesilat 0,1-1 mM, alene og i kombination. Der blev udført tre uafhængige forsøg. For hver cellelinje, blev middelværdien af ​​ubehandlede prøver antaget som 100% og middelværdier af behandlede celler blev afbildet som procentdele med hensyn til deres matchede kontroller. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilat. * P 0,05; ** P 0,001; *** P:. Ikke signifikant

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​disse to lægemidler på Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT- 116 invasiv. Behandling i 6 timer med gabexate mesilat 1 mM faldt betydeligt den invasive potentiale i alle CRC celle testet (CACO-02:53% linjer, SW48:42%, HT-29:45% Colo205:43%; SW480:55% ; SW620:69%; RKO: 63%; LS174T: 54%; HCT-116:52%) (figur 2). Især et sådant fald ikke skyldtes en cytotoksisk virkning af dette stof, som bekræftet ved et parallelt eksperiment, hvor der blev observeret nogen signifikant ændring af cellelevedygtighed mellem kontrol og behandlede celler på denne tid af behandling (data ikke vist). Omvendt 6 timers behandling med cetuximab 100 pg /ml inducerede ikke væsentlige ændringer på CRC celle invasive potentiale, undtagen på Caco-2 og SW48-celler, hvor der blev observeret en 25% og 22% af hæmning hhv. Igen, når dette stof blev ansat i kombination med gabexate mesilat, effekten fremkaldte svarede til observeret med gabexate mesilat som enkeltstof (figur 2).

Evaluering af Boyden kammer invasion assay af Caco-2, SW48 , HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 invasive potentiale efter 6 timers behandling med cetuximab 100 ug /ml og gabexate mesilat 1 mM, alene og i kombination. For hver cellelinje, blev middelværdien af ​​ubehandlede prøver antaget som 100% og middelværdier af behandlede celler blev afbildet som procentdele med hensyn til deres matchede kontroller. Fotografier af invaderende celler er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilat. Scale bar: 50 pm. * P 0,05; *** P:. Ikke signifikant

Endelig vurderede vi effekten af ​​cetuximab og gabexate mesilat på tumor-induceret angiogenese. Der blev observeret en meget stærk hæmmende effekt på denne parameter, når vi undersøgte virkningen af ​​gabexate mesilat alene. Faktisk 24 timer inkubation af EA.hy926-celler med det konditionerede medium af Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 celler, tidligere behandlet i 6 timer med dette stof ved dosis på 1 mM, næsten fuldstændig hæmmet endotelcelle differentiering i kapillære-lignende strukturer, som indikeret ved tilstedeværelsen af ​​et sammenhængende netværk af anastomosering celler i kontrolprøver og af kugleformede celler, isoleret eller aggregerede i små klumper, i behandlede dem (figur 3 ). Også på denne parameter, cetuximab alene (100 mg /ml) viste sig at være moderat effektive kun i CRC cellelinier med vildtype-KRAS, BRAF og PIK3CA gener (hæmning af dannelse rør indeks, 22% og 20% ​​på Caco-2 og SW48-celler, henholdsvis). På grund af den stærke hæmning af tumor-induceret angiogenese ved gabexate mesilat alene ved en dosis 1 mM, blev virkningen af ​​alene og i kombination med cetuximab dette stof også vurderet ved en dosis på 0,1 og 0,5 mM. Men også ved disse doser, den antiangiogene effekt vises ved gabexate mesilat plus cetuximab ikke var bedre end den observeret med gabexate mesilat ansat som enkeltstof (data ikke vist).

Evaluering ved in vitro Matrigel angiogenese assay af EA.hy926 endotelcelle differentiering i kapillære-lignende strukturer efter 24 timers inkubation med det konditionerede medium af Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116-celler, der tidligere behandlet for 6 timer med cetuximab 100 ug /ml og gabexate mesilat 1 mM, alene og i kombination. Tube formation indeks blev vurderet som beskrevet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. For hver cellelinje, blev middelværdien af ​​ubehandlede prøver antaget som 100% og middelværdier af behandlede celler blev afbildet som procentdele med hensyn til deres matchede kontroller. Fotografier er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilat. Scale bar: 50 pm. * P 0,05; ** P 0,001; *** P:. Ikke signifikant

Samlet disse resultater, foruden bekræfter den manglende reaktion på cetuximab i CRC celler med KRAS, BRAF og PIK3CA mutationer, indikerer, at gabexate mesilat er i stand til at udøve en betydelig antitumoraktivitet i CRC-celler, der huser enten vildtype eller muteret KRAS, BRAF og PIK3CA gener, med en effektivitet sammenlignelig med den observeret, når det anvendes i kombination med anti-EGFR-antistoffer.

diskussion

Personlig terapi repræsenterer et attraktivt mål i onkologi. Til dato har kræft genomsekvensering blevet et stærkt værktøj til at identificere kræftrelaterede mutationer og til at vælge patienter, der kunne drage fordel af en bestemt terapeutisk regime. I den forbindelse har en analyse af KRAS mutation hurtigt øget det terapeutiske indeks af EGFR-målrettet terapi mCRC patienter, der begrænser denne behandling kun dem, dem huser KRAS wild-type. Selvom yderligere validering er påkrævet, før en eventuel anvendelse i klinisk praksis, er det blevet klart, at BRAF og PIK3CA yderligere genotypning i væsentlig grad kan forbedre den objektive responsrate hos disse patienter. Faktisk aktiverende KRAS, BRAF og PIK3CA mutationer er i stand til at omgå EGFR farmakologisk inhibering, hvilket resulterer i en konstitutiv aktivering af mitogen-aktiveret protein kinase og AKT pathways, der vides at spille en central rolle i cancer indtræden og progression [15]. I form af terapeutiske implikationer, dette tyder på, at også FRK patienter med muterede BRAF og PIK3CA gener bør vinde lidt eller ingen gavn af EGFR-målrettet terapi. Især er KRAS, BRAF og PIK3CA mutationer almindeligt aktiveret (op til 50-60% som helhed) i CRC patienter [14]. Derfor opdagelsen af ​​nye behandlingsmuligheder effektiv i FRK patienter med sådanne mutationer i øjeblikket udgør en intensiv område af undersøgelse [11], [16] – [18].

proteaseinhibitoren gabexate mesilat er et stof rutinemæssigt anvendt i klinisk praksis i Italien, Japan og Korea til behandling af akut pancreatitis og dissemineret intravaskulær koagulation, sammen med forebyggelse af post-endoskopisk retrograd cholangiopancreatography pancreatitis [19], [20]. Især har gabexate mesilat toksikologisk profil blevet testet på mennesker og alvorlige bivirkninger er sjældent blevet beskrevet. Interessant, i tidligere prækliniske studier, dette stof viste en potent antitumoraktivitet, herunder hæmning af CRC primær tumorvækst og levermetastaser i nøgne mus [12].

Denne præklinisk undersøgelse havde til formål at undersøge den formodede antitumor effekt af gabexate mesilat, alene og i kombination med anti-EGFR monoklonalt antistof cetuximab, i et panel af humane CRC cellelinier indeholdende et andet udtryk mønster af vildtype /muterede KRAS, BRAF og PIK3CA gener. Resultater opnået (udover bekræfter den manglende reaktion på cetuximab i CRC celler, der bærer sådanne mutationer) viste, at gabexate mesilat var i stand til at udøve en bred antitumoral effekt i sådanne celler, er i stand til i betydelig grad påvirker cellernes levedygtighed, invasive potentiale og tumor-induceret angiogenese i alle de testede i denne undersøgelse cellelinjer, herunder dem dem huser dobbelt KRAS /PIK3CA eller BRAF /PIK3CA mutation. Effektiviteten af ​​gabexate mesilat som enkeltstof fandtes at være sammenlignelig med den observeret, når dette stof blev anvendt i kombination med cetuximab, hvilket viser, at antitumor virkning af disse lægemidler i kombination ikke var overlegne end gabexate mesilat anvendes som enkeltstof.

Især cellevækst, en høj invasive potentiale og tumor-induceret angiogenese er tre pivotale processer for udviklingen af ​​kræft og metastatisation dermed repræsenterer et attraktivt mål for kræftbehandling. Som en kendsgerning, mange terapeutiske strategier baseret på integration af selektive inhibitorer af disse veje bliver nu meget undersøgt i prækliniske og kliniske undersøgelser. I denne sammenhæng, også under hensyntagen til den gode toksikologiske profil, viste de foreløbige resultater i denne korte rapport tyder på, at gabexate mesilat kunne repræsentere en lovende behandlingsmulighed for FRK patienter, især for dem, dem bærende muterede KRAS, BRAF og PIK3CA gener, enten som mono-terapi eller i tillæg til standard kemoterapi. Yderligere undersøgelser for bedre at belyse gabexate mesilat virkningsmekanisme i CRC celler derfor berettiget.

Materialer og metoder

Celler og Cell Culture

Den humane CRC cellelinjer HT-29 , LS174T og HCT-116, samt den humane immortaliserede endotel-lignende EA.hy926 cellelinie blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). RKO, Caco-2, SW480 og SW48, SW620 og Colo205 humane CRC cellelinjer var en generøs gave af Dr. Luigi Ricciardiello (Institut for Klinisk Medicin, Sant’Orsola-Malpighi Hospital, University of Bologna, Bologna, Italien) og Prof. Massimo Derenzini (Klinisk Institut for Strålebeskyttelse og Histopatologiske Sciences, Sant’Orsola-Malpighi Hospital, University of Bologna, Bologna, Italien), hhv. Alle cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium med 4,5 g /l glucose (Euroclone, Milano, Italien) suppleret med 10% (vol /vol) varmeinaktiveret FBS (Euroclone), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 og rutinemæssigt passeret under anvendelse af trypsin-EDTA 0,025% (Sigma-Aldrich). For hver cellelinje anvendt i denne undersøgelse, en cellelinje autentificering test ved at evaluere DNA kort tandem repeat (STR) profil blev udført, for at udelukke en forurening eller fejlagtig identifikation med andre cellelinjer.

Drug Behandlinger

gabexate mesilat (Foy, Sanofi Aventis, Milano, Italien) og cetuximab (Erbitux, (Merck, Darmstadt, Tyskland) blev fortyndet i mediet for at opnå den nødvendige endelige koncentration før hvert forsøg. for begge lægemidler, doserne ansat (100 ug /ml for cetuximab og 0,1-1 mM for gabexate mesilat) der blev ved tidligere in vitro undersøgelser [12], [13], [21], [22]. Som gabexate mesilat er blevet rapporteret at være delvist nedbrudt ved serumalbumin [23], blev udført alle forsøg i serum-frit medium. i eksperimenter udført med det konditionerede medium af CRC-cellelinier, blev celler behandlet med lægemidler, alene og i kombination, i 6 timer og derefter konditioneret medium blev høstet, centrifugeret ved 500 x g i 5 minutter ved 4 ° C for at fjerne celler og debris, og nedfrosset ved -80 ° C indtil anvendelse.

cellelevedygtighed Assay Salg

Cell levedygtighed blev udført ved 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. Kort fortalt, Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116-celler (1 x 10

4 celler /brønd) blev udpladet i en plade med 96 brønde i fire eksemplarer og tilladt til at klæbe i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med cetuximab og stigende koncentrationer af gabexate mesilat i 24 og 48 timer. Ved slutningen af ​​inkubationen blev MTT tilsat til hver brønd og celler inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Formazankrystaller blev derefter opløst ved DMSO tilsætning. Absorbans blev derefter målt ved 570 nm i en 96-brønds spektrofotometrisk mikroplader læser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). For hver cellelinie, IC

50 værdi blev beregnet ved ikke-lineær regressionsanalyse ved anvendelse PRISM 5,01 softwareversion (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Chemoinvasion Assay

invasiv potentiale Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116-celler blev vurderet ved chemoinvasion assay [24]. Kort fortalt blev polyvinylpyrrolidon-fri polycarbonatfiltre (Millipore, Co. Cork, Irland) med 12 um porer belagt med Matrigel (Sigma-Aldrich). Frisk DMEM suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS blev anbragt i det nedre kammer som kemoattraktant og 1 x 10

5-celler blev derefter udsået i det øvre kammer og inkuberet i 6 timer med gabexate mesilat og cetuximab, alene og i kombination, ved 37 ° C i befugtet 5% CO

2. Ved slutningen af ​​inkubationen blev ikke-invaderende celler fjernet fra den øvre overflade af filtrene. Invaderende celler i den nedre overflade blev derefter fikseret i 1 min i ethanol 95% og farvet i 10 minutter med 0,5% vægt /volumen toluidinblåt. I migration assay blev den samme fremgangsmåde som i invasion assay, bortset fra at filtre blev coatet med gelatine (Sigma-Aldrich). Fotografier blev taget med et Olympus CKX41 omvendt mikroskop (Olympus Italia, Milano, Italien), der er udstyret med et Olympus C5060-ADU kamera (Olympus Italia). For hver prøve blev fire tilfældige optiske felter ved × 200 af total forstørrelse analyseret og det gennemsnitlige antal invaderende celler blev beregnet som følger:. Betyde antal invaderende celler /gennemsnitligt antal tilsvarende migrerende celler

In vitro Angiogenese assay

In vitro angiogenese blev vurderet ved endotelcelle differentiering i kapillære-lignende strukturer i Matrigel. Kort fortalt, vækst-faktor-beriget Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) blev anbragt i en plade iskold 24 brønde og efterladt til at polymerisere i 1 time ved 37 ° C. EA.hy926 endotelceller (1,2 x 10

5 /brønd) blev derefter udpladet og inkuberet i 24 timer med en lige mængde Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT -116 konditioneret medium, opnået som beskrevet ovenfor i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. Cancercelle konditionerede medium således i vid udstrækning i in vitro angiogenese assays for at efterligne, hvad der sker under in vivo tumor angiogenese [25]. Ved slutningen af ​​inkubationen blev en tredimensionel organisation observeret gennem en omvendt fase-kontrast lysmikroskop. Fotografier af fire felter repræsentant for hver prøve blev opnået ved × 200 total forstørrelse med et Olympus CKX41 omvendt mikroskop (Olympus Italia), der er udstyret med et Olympus C5060-ADU kamera (Olympus Italia). En semi-kvantitativ måling af kapillære-lignende strukturer (kanaldannelse indeks) blev udført som tidligere beskrevet [26].

Statistical Analysis

Resultater udtrykkes som procent middelværdi ± standardafvigelse. Data blev analyseret ved ANOVA efterfulgt af Bonferroni post hoc test under anvendelse PRISM 5,01 softwareversion (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Tak

Forfatterne takker Center for Anvendt Biomedical Research (CRBA, Sant’Orsola-Malpighi Hospital, University of Bologna, Bologna, Italien. ) for at levere faciliteter nærværende undersøgelse og Dr. Carla Bini (Institut for Medicin og Folkesundhed, University of Bologna, Bologna, Italien) for cellelinje godkendelse.