PLoS ONE: intratumoral Meget forskellige MicroRNA Expression i Rektal kræft

Abstrakt

Introduktion

Et stigende antal undersøgelser har undersøgt microRNA (miRNA) som potentielle markører for diagnose, behandling og prognose. Hidtil har aftale mellem undersøgelser været minimal, hvilket kan delvist forklares ved intratumoral heterogenitet af miRNA udtryk. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere heterogenitet et panel af udvalgte miRNA i endetarmskræft, ved hjælp af to forskellige tekniske tilgange.

Materialer og metoder

Udtrykket af de undersøgte miRNA blev analyseret af real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) og

in situ

hybridisering (ISH) i tumor prøver fra 27 patienter med T3-4 endetarmskræft. Fra hver tumor blev væv fra tre forskellige luminale lokalisationer undersøgt. Inter- og intra-patient variabilitet blev vurderet ved at beregne intraclass korrelationskoefficienter (ICCS). Korrelationer mellem RT-qPCR og ISH blev evalueret ved hjælp af Spearmans korrelation.

Resultater

ICC

enkelt (én prøve fra hver patient) var højere end 50% for miRNA-21 og miRNA- 31. For miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630, ICC

single var lavere end 50%. ICC

betyder (gennemsnit af tre prøver fra hver patient) var højere end 50% for miRNA-21 (RT-qPCR og ISH), miRNA-125b (RT-qPCR og ISH), miRNA-145 (ISH), miRNA-630 (RT-qPCR), og miRNA-31 (RT-qPCR). For miRNA-145 (RT-qPCR) og miRNA-630 (ISH), ICC

middelværdi var lavere end 50%. Spearman korrelationskoefficienter, sammenligning af resultater opnået ved RT-qPCR og ISH henholdsvis varierede fra 0,084 til 0,325 for middelværdien fra hver patient, og fra -0,085 til 0,515 i sektion inklusive den dybeste del af tumoren.

Konklusion

intratumoral heterogenitet kan påvirke målingen af ​​miRNA udtryk og dermed antallet af prøver, der er nødvendige for repræsentative estimater. Vores resultater med to forskellige metoder tyder på, at en prøve er tilstrækkelig til en passende vurdering af miRNA-21 og miRNA-31, mens flere prøver vil forbedre vurderingen af ​​miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630. Interessant, fandt vi en dårlig korrelation mellem udtrykket skøn opnået ved RT-qPCR og ISH henholdsvis

Henvisning:. Eriksen AHM, Andersen RF, Nielsen BS, Sørensen FB, Appelt AL, Jakobsen A, et al. (2016) intratumoral Uensartede regler om MicroRNA Expression i endetarmskræft. PLoS ONE 11 (6): e0156919. doi: 10,1371 /journal.pone.0156919

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: 29, 2016 Accepteret: 20 maj 2016; Udgivet: 3 juni 2016

Copyright: © 2016 Eriksen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. udgifter projektet vedrørende forskning materialer var omfattet af Vejle Sygehus Forskningsråd. Den bidragyder ikke yde støtte i form af løn til forfattere. Agenturet for forskning og innovation ydet støtte til BSN (Bioneer A /S). De organisationer, der finansierer ikke spillede en rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. BSN er ansat af Bioneer A /S, Danmark, en ikke -profit selskab ejet af tekniske Universitet Danmark. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er korte ikke-kodende RNA-molekyler, der virker som negative gen regulatorer på post-transkriptionel niveau. Det er velkendt, at den samme miRNA kan påvirke adskillige gener, men også, at det samme gen kan nedreguleres af forskellige miRNA. Således miRNA udgør et komplekst reguleringssystem af central biologisk betydning. Systemet er dysreguleret under malign transformation, og det er generelt forventes, at ændringen af ​​miRNA aktivitet spiller en central rolle i carcinogenese [1-4]. Derfor har en betydelig og stigende antal undersøgelser undersøgt miRNA som potentielle markører for diagnose, behandling og prognose. De kliniske implikationer har imidlertid hidtil været minimal [5]. En årsag kan være forskellige metodiske tilgange, der vanskeliggør sammenligning af undersøgelser. Et andet spørgsmål er den anden sammensætning og kvalitet af patientdata materialer undersøgt. Desuden er den litteratur, domineret af mange små studier uden efterfølgende validering af relevante resultater [5-10].

En anden vigtig hindring er normalisering af real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) data, når man måler miRNA ekspression, alt efter omstændighederne normalisering er vigtigt at sikre pålidelige og reproducerbare resultater. Trods et stigende antal miRNA udtryk undersøgelser, litteraturen er sparsom, når det kommer til pålidelige normaliser kandidater [11-14].

intratumoral heterogenitet er en generel karakteristik af maligne tumorer [15-17] og udgør en væsentlig hindring i studiet af tumorbiologi, miRNA er ingen undtagelse. Til dato har spørgsmålet været næsten overset på trods af sin åbenlyse betydning; aktiviteter miRNA vil sandsynligvis variere i forskellige dele af tumoren med potentiel stor indflydelse på den kliniske anvendelse. Kun få publikationer har behandlet problemet med intratumoral heterogenitet berører målingen af ​​miRNA udtryk. En undersøgelse beskæftiger sig med spørgsmålet i brystkræft [18], en anden i hepatocellulært carcinom [19].

Disse udfordringer er særligt relevant for patienter med lokalt fremskreden endetarmskræft, hvor behandling beslutninger er ofte baseret på single biopsier og senere fortolkning af tumoren påvirkes af præoperative strålebehandling [20, 21].

Formålet med den foreliggende undersøgelse var at analysere ekspressionen heterogenitet af et panel af udvalgte miRNA i rektale cancer prøver af to forskellige tekniske metoder, og at belyse deres indbyrdes konkordans. RT-qPCR blev valgt, da det er almindeligt accepteret som den gyldne standard for miRNA udtryk analyser.

In situ

hybridisering (ISH) blev valgt på grund af dens evne til at visualisere den cellulære lokalisering af de undersøgte miRNA foruden ekspressionsniveauet. Salg

Materialer og Metoder Salg

Patienter og vævsprøver

Tyve-syv patienter blev tilfældigt udvalgt fra en kohorte af 239 patienter, som havde gennemgået resektion for endetarmskræft på Vejle Sygehus, Danmark fra 1999 til 2008. Inklusion blev gjort, hvis den histopatologiske diagnose var rektal adenocarcinom pT3 eller pT4, hvis der ikke præoperativ kemo-strålebehandling blev givet, og hvis formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) endetarmskræft væv var tilgængelig fra tre forskellige lokalisationer af tumoren, herunder den luminale aspekt.

Ifølge de regionale Videnskabsetiske komitéer for Southern Danmark, etik godkendelse og skriftligt informeret samtykke blev ikke påkrævet, da formålet med undersøgelsen var at udvikle nye metoder og ingen kliniske data blev yderligere analyseret (lov om Forskning etik anmeldelse Sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter, jf § 14, § 1). Prøverne blev indsamlet under standard rektal resektion, og projektet blev gennemført uden kendskab til de kliniske data. Undersøgelsen blev registreret med Dansk Datatilsynet, og Det Danske Registry for Human Tissue Udnyttelse er blevet hørt inden eventuelle vævsprøver blev brugt

Fås histologiske snit farvet med hæmatoxylin og eosin (H miRNA-31 er baseret på den positive sammenhæng mellem udtryk niveau og fase af CRC [4, 23]; miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630 baseret på deres foreslået opregulering i endetarmskræft væv efter neo-adjuverende kemo-strålebehandling [6-8].

Adressering spørgsmålet om normalisering vi for nylig udført en undersøgelse af miRNA udtryk profilering at identificere og validere referencepunkter gener for relativ kvantificering af miRNA. MicroRNA-193a-5p, miRNA-27a, og lad-7g blev identificeret som den mest stabilt udtrykte miRNA i vores kohorte af endetarmskræft og blev derfor brugt som normalisers i denne undersøgelse [24].

Expression analyse ved RT-qPCR

RNA-ekstraktion.

RNA blev isoleret fra de mikro dissekeret FFPE væv ved hjælp af miRNeasy FFPE Kit (Qiagen, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Første trin blev tilsætning af en lyseringsbuffer indeholdende proteinase K efterfulgt af en kort inkubation ved 70 ° C. Dette blev efterfulgt af DNase-behandling og RBC buffer behandling. Ethanol blev tilsat, og prøven blev påført en RNeasy MinElute spinkolonne hvor det totale RNA, herunder miRNA, blev bundet til membranen. Endelig blev total RNA elueres i 14 pi RNase-frit vand.

RT-qPCR.

Brugerdefinerede TaqMan® miRNA Single Analyser (Life Technologies, CA, USA) for HSA-bogstav 7g 002.282, HSA-mIR-193a-5p 002.281, HSA-mIR-27a 000.408, HSA-mIR-21 000.397, HSA-mIR-31 002.279, HSA-mIR-125b 000.449, HSA-mIR-145 002.278, og hsa- miR-630 001563 blev anvendt i overensstemmelse med producentens standardvejledning i lav prøve input (LSI).

Brugerdefineret MicroRNA RT Primer Pool og Custom MicroRNA preamp Primer Pool til analyse af ovennævnte miRNA blev skabt i henhold til protokol for at skabe Tilpasset RT og Forforstærkning Pools bruger TaqMan® MicroRNA Analyser (publikation varenummer 4.465.407, Life Technologies).

RNA blev omvendt transskriberet ved hjælp custom MicroRNA RT Primer Pool. Hver RT-reaktionen indeholdt 3 pi total RNA og 12 pi RT reaktion mix fra TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit.

Preamplification (12 cykler) blev udført med Custom MicroRNA PREAMP Primer Pool, hver reaktion indeholdt 2,5 pi RT Produkt , TaqMan® pREAMP Master Mix (2X) og preamp Primer Pool i et totalt reaktionsvolumen på 25 pi. Forforstærker Produkt blev fortyndet 1:40 i TE-buffer.

blev udført på Applied Biosystems 7900 HT Real-Time System ved hjælp 1 pi fortyndet preamp produkt, TaqMan® miRNA tests og TaqMan® Universal RT-qPCR analyser Master Mix II NoAmpErase® UNG i et totalt reaktionsvolumen på 20 pi. Alle reaktioner blev udført tre gange. Dataanalyse blev udført under anvendelse af SDS software ver. 2.2.2 (Life Technologies).

Vand blev anvendt som negativ kontrol. Den ingen skabelon kontrol indgik i hele processen (RT, forforstærkning og qPCR) og analyseret sammen med prøver.

Relativ kvantificering.

Gennemsnitlige værdier af tredobbelte CQ værdier blev anvendt til yderligere analyse. Cq er defineret som PCR-cyklus telefonnummer, hvor fluorescensen opfylder tærsklen i amplifikationsplot. Gennemsnittet af CQ-værdier for miRNA-193a-5p, miRNA-27a, og lad-7 g blev brugt til normalisering som nævnt ovenfor.

ΔCq værdier blev konverteret til lineære værdier for statistiske analyser af ligningen lineær værdi (ΔCq) =

2

-ΔCq

antage, at forstærkningen effektiviteten af ​​analyserne var tæt på 100%.

Expression analyse ved in situ hybridisering

Før analyse blev assay optimering udført for at bestemme den optimale probekoncentrationer og hybridiseringstemperaturer. MicroRNA-31 blev ikke påvist i 10 prøver analyseret under assay optimering og blev derfor ikke yderligere. ISH for miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630 blev udført som tidligere beskrevet [25] under anvendelse af de følgende koncentrationer: 20 nM (miRNA-21 og miRNA-145), 30 nM (miRNA-630), 50 nM (miRNA-125b). ISH-analyse blev udført ved anvendelse af et Tecan Freedom EVO automatiseret hybridisering instrument (Tecan, Schweiz), hvor der blev udført følgende trin: pre-fordøjelse med proteinase-K (15 ug /ml) ved 37 ° C i 8 minutter, præ- hybridisering ved 57 ° C i 15 minutter, hybridisering med dobbelt-carboxyfluorescein (FAM) mærket Locked Nucleic Acid (LNA) prober (Exiqon A /S, Danmark) i 1 time. Den miRNA-125b blev behandlet ved 56 ° C. Efter stringente vaske med saltopløsning-natrium-citrat puffer blev påvist proberne med alkalisk phosphatase-konjugeret fåre-anti-FAM Fab-fragmenter, efterfulgt af inkubation i 4-nitroblue tetrazolium og 5-brom-4-chlor-3′-indolylphosphat (Roche, Danmark) i 60 minutter (90 minutter for miRNA-125b) resulterer i en mørk blå farvning, og endelig modfarvning med nukleare hurtig rød (Vector Laboratories, CA, USA).

Billedanalyse og kvantificering

Digitale hele lysbilederne blev opnået med et x20 objektiv under anvendelse af et Axio Scan Z1 lyse felt scanner (Carl Zeiss, Tyskland). Billedanalyse af de digitale objektglas blev udført under anvendelse VisiomorphDP software (Visiopharm, Danmark)

De områder af ROI omkranset på H for miRNA-125b og miRNA-630 blev ekskluderet tre patienter; og for miRNA-145 fire patienter blev ekskluderet.

En pixel klassifikatør blev uddannet til at skelne den blå ISH signal fra den røde kontrastfarve, den ufarvede og svagt farvede væv, og væv-frie områder. Følgende parametre blev opnået under billedbehandling fra hvert ROI: areal af intens blå (ISH signal), område svag blå (betragtes baggrund ISH signal), område af lilla blå (blå placeret over nukleare rød), og det samlede areal af den enkelte ROIs. Det relative areal fraktioner (områder med blå farve af interesse divideret med det samlede investeringsafkast areal) blev anset for repræsentative for den relative ekspression af miRNA af interesse.

Dataanalyse

Alle data blev opsummeret ved hjælp standard deskriptiv statistik. Inter- og intra-patient variabilitet blev vurderet ved beregning af intraclass korrelationskoefficienter (ICC), ved hjælp af en en-vejs tilfældige effekter model. Specifikt kan ICC i denne indstilling betragtes som den procentdel af den samlede varians i prøverne udgøres af forskelle mellem de undersøgte patienter. Hvis størstedelen af ​​variationen i prøven målinger er fra variation mellem patient, ICC er høj (ICC → 1). Hvis flertallet af variation er fra intra-patient variationer, ICC er lav (ICC → 0). Vi overvejede ICC både for enkelte prøver (ICC

single) og for gennemsnittet af prøver inden for patienterne (ICC

middelværdi). ICC

single giver et skøn over pålideligheden af ​​en given prøve at gøre oplysninger om den specifikke patient (i forhold til alle andre patienter). Tilsvarende ICC

gennemsnitlige estimater pålideligheden af ​​de oplysninger gengives ved at tage gennemsnittet af tre prøver fra en patient.

Sammenhængen mellem RT-qPCR og ISH-fraktioner for hver miRNA blev estimeret for individuelle prøver og for middelværdier for de enkelte patienter ved hjælp af Spearman korrelationskoefficienten.

for at illustrere den inter- og intra-patient variation samt sammenhængen mellem RT-qPCR og ISH-værdier blev alle data normaliseret til at tillade for at planlægge på en fælles skala. For hver miRNA, blev middelværdien og standardafvigelsen for alle RT-qPCR målinger af hver patient beregnet, og en individuel prøve måling blev normaliseret til en standard skala ved at udtrække middelværdien og dividere det med standardafvigelsen. Dette blev også gjort for alle ISH målinger for hver miRNA. De resulterende værdier for både RT-qPCR og ISH blev plottet separat for hver miRNA.

Resultater

RT-qPCR

Udtrykket mønster af target miRNA (miRNA-21 , miRNA-31, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630) blev analyseret i tre forskellige prøver fra hver tumor prøvemateriale ved RT-qPCR. MicroRNA-21, miRNA-31, miRNA-125b, og miRNA-145 udviste forskellige og målbare ekspressionsniveauer, og alle de miRNA blev udtrykt i alle tre prøver fra hver tumor. MicroRNA-630 blev opdaget i to prøver fra to forskellige patienter. Rækken af ​​rå CQ-niveauer var 17,4-21,6 for miRNA-21, fra 20,9 til 28,7 for miRNA-31, fra 20,4 til 26,3 for miRNA-125b, 15,9-24,4 for miRNA-145, og 28,5-36,7 for miRNA-630. Et par outliers i de tredobbelte RT-qPCR målinger blev fjernet fra datasættet før yderligere analyser. Efter normalisering blev ΔCq værdier konverteres til lineære værdier til yderligere analyse.

In situ hybridisering

Relative udtryk estimater for målet miRNA (miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630) blev opnået ved billedanalyse af ISH-farvede objektglas (tabel 1) .Den miRNA-21 ISH resulterede i et stærkt signal i det stromale væv, der omgiver epiteliale tumorceller som også tidligere [25, 26] beskrevne. Et stærkt signal i enteriske neuroner i det stromale væv og en svagere signal i andre stromale celler blev påvist for miRNA-125b. ISH for miRNA-145 resulterede i en stærk og en svag signal hovedsagelig i de glatte muskelceller og myofibroblastisk celler, der omgiver tumorcellerne [26, 27]. MiRNA-630 ISH viste farvning af tumorceller og en undergruppe af de hosliggende stromaceller. Både stærke og svage ISH signaler blev behandlet i billedanalyse. Eksempler på ISH signaler til miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630 med de tilsvarende klassificerede billeder er vist i fig 1.

ISH signal svarende til den blå farve i venstre række. St: stroma; Ca: epiteliale tumorceller. (A) Ekspression af miRNA-21 hovedsageligt til stede i stroma støder op til de epiteliale tumorceller. (B) Pixel klassificeringen svarer til billedet A. (C) Ekspression af miRNA-125b med stærke ISH-signal til stede i en enterisk neuron (pile) og svagere ISH signal repræsenterer forskellige stromale celler. (D) Pixel klassifikator svarende til billedet C. (E) Ekspression af miRNA-145 hovedsageligt til stede i glatte muskelceller (SMC) og myofibroblastisk celler. (F) Pixel klassifikator svarende til billedet E. (G) Ekspression af miRNA-630 spredt i epiteliale tumorceller og tilstødende stromaceller (pilene angiver eksempler på ISH-positive celler i stroma). (H) Pixel klassificeringen svarende til billedet G.

Intraclass korrelationskoefficient (ICC)

ICC af hver miRNA blev beregnet for både RT-qPCR og ISH som vist i tabel 2. for miRNA-21, miRNA-145, og miRNA-630, blev TBP-fraktion (dvs. alle blå farver), der anvendes, men for miRNA-125b vi ikke omfatte områder med intens blå farvning repræsenterer de enteriske neuroner .

Sammenhæng mellem qPCR og ISH

Spearman Korrelationskoefficient blev beregnet til at sammenligne de opnåede resultater ved RT-qPCR og ISH henholdsvis (tabel 3). For ISH, når man sammenligner med RT-qPCR, blev TBP-fraktion (alle blå farver), der anvendes for alle fire miRNA, da RT-qPCR måler den samlede udtryk for miRNA af interesse, uanset lokalisering. Generelt var der en dårlig korrelation mellem de overslag opnået ved de to teknikker med korrelationskoefficienter i området fra 0,084 til 0,325 for middelværdien for hver patient, og i området fra -0,085 til 0,515 i sektion inklusive den dybeste del af hver tumor.

intra- og inter-patient variation og sammenhængen mellem RT-qPCR og ISH for miRNA-21, miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630 er illustreret i fig 2. for miRNA-31 (RT-qPCR, kun) ser S3 fig

Alle data blev normaliseret der skal plottes på en fælles skala:. se hovedteksten for detaljer. Hver lodret linje repræsenterer området for de tre foranstaltninger opnået i den enkelte patient med forskellige farver til at repræsentere RT-qPCR og ISH målinger hhv. For hver miRNA, blev patienterne sorteres efter deres gennemsnit RT-qPCR måling for plotning.

Diskussion

Et stigende antal undersøgelser fokuserer på miRNA som potentielle biomarkører i kræft diagnose og behandling , men de divergerende og modstridende resultater i litteraturen er en væsentlig hindring for klinisk anvendelse [5, 21]. Situationen kræver en kritisk tilgang til metodologiske aspekter blandt hvilke heterogenitet rangerer højt.

Tissue heterogenitet er en generel karakteristik af maligne tumorer. Det er velkendt, at mikro-miljø varierer i hele tumoren med virkning på vækst, proliferation og metastatisk potentiale. Opførslen af ​​tumor mutationer er inkonsekvent, også [16, 17]. Derfor er spørgsmålet besidder afgørende betydning i biomarkør forskning med perspektiver klinisk anvendelse. Dette gælder også for miRNA. Den foreliggende undersøgelse rettet heterogenitet problem sammenligning af to forskellige metoder til miRNA ekspressionsanalyse.

Litteraturen beskæftiger sig med miRNA og intratumoral heterogenitet er sparsom. Raychaudhuri

et al

. (2012) undersøgte intratumoral heterogenitet et panel af miRNA i brystcancer [18] ved RT-qPCR. De fandt en variationskoefficient (CV) på 40% inden for primær tumor prøver og konkluderer, at, kan intratumoral heterogenitet føre til betydelig prøvetagning bias og, vurdering af miRNA-profiler kan kræve prøvetagning på flere forskellige tumor steder. Peveling-Oberhag

et al

. (2014) [19] foretaget en miRNA profilering i hepatocellulært carcinom at sammenligne forskellige rum i levertumorer og fandt, at miRNA dysregulering varierer inden tumor rum. De to undersøgelser kan ikke uden forbehold sammenlignes med vores resultater, som ingen af ​​dem rapporterer ICC. På den anden side, de begge rapporterer betydelig intratumoral heterogenitet i overensstemmelse med den foreliggende undersøgelse.

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at vurdere intratumoral heterogenitet miRNA i endetarmskræft. Desuden er vi ikke bekendt med andre undersøgelser, der anvender de to teknikker til RT-qPCR og ISH på tilstødende sektioner af væv til at belyse deres gensidige konkordans. RT-qPCR blev valgt, da det er almindeligt accepteret som den gyldne standard for miRNA udtryk analyser. ISH blev valgt på grund af dens evne til at visualisere den cellulære lokalisering af den undersøgte miRNA foruden ekspressionsniveauet. Vi anvendte tumorprøver fra patienter med rektal cancer at analysere intratumoral heterogenitet et panel af miRNA med potentielle kliniske relevans [4, 6-9, 22, 23].

Vi fandt det samlede omfang af heterogenitet, som udtrykt ved ICC, at være forskellig for de fem miRNA. CV er ikke så nyttig en parameter i denne indstilling, da den ikke giver et direkte mål for den relative til den samlede variation i målingerne intra-patient variation. ICC, dog giver mulighed for sammenligning af intra- og inter-patient variation i datasæt fra de to forskellige metoder, hvilket giver et skøn over præcisionen af ​​de enkelte målinger, der henviser til en bestemt patient.

variation inter-patient var højere end den interne variation med hensyn til miRNA-21 og miRNA-31. Dette er en indikation af, at de to miRNA har potentiale som biomarkører, ved analyse én prøve (fx en diagnostisk biopsi). Her fandt vi, at betyde ICC-værdier for RT-qPCR og ISH var næsten identiske for miRNA-21, 0,848 og 0,838 henholdsvis. Disse værdier er i god overensstemmelse med Nielsen

et al

. (2011), som rapporterede en ICC værdi for miRNA-21 ISH på 84% i CRC væv [25].

På den anden side, for miRNA-125b, miRNA-145, og miRNA-630, den ICC

single var under 50%, der kræver mere forsigtighed ved fortolkning af resultater fra en enkelt prøve. For miRNA-125b og miRNA-630 viste ISH analyse lavere ICC-værdier (single og betyde) end RT-qPCR-analyse, hvilket indikerer en højere intra-patient variation for ISH analyse. For miRNA-145 var det en modsat scenarie med ISH analyse, der viser højere ICC-værdier (single og betyde) end RT-qPCR-analyse, hvilket indikerer en højere intra-patient variation for RT-qPCR-analyse. Derfor kun at basere sig på ICC’er, ingen af ​​de to teknikker er overlegen i forhold til den anden

Interessant vi fandt en dårlig korrelation mellem resultaterne fra RT-qPCR og ISH for alle miRNA.; så selvom ICC (single og betyde) er ens for RT-PCR og ISH for miRNA-21, er resultaterne ikke sammenlignelige. Den vigtigste forklaring er sandsynligvis være iboende forskelle i metodologi RT-qPCR og ISH. F.eks. forskellig fra RT-qPCR teknik, ISH teknik detekterer både precursor og modne miRNA. Det kan dog ikke udelukkes, at en del af en forklaring på den ringe korrelation kunne være små forskydninger af ROI ved kopiering det fra den primære plotning til ISH digitale hele slide image og til dias for RT-qPCR. Dette ville betyde en forskel i den analyserede område, især i stroma, hvor alle miRNA er repræsenteret.

Generelt RT-qPCR har en høj reproducerbarhed og er en relativt billig metode anvendelig i de fleste laboratorier. FFPE væv er velegnet til miRNA ekspression analyse udført på en lille mængde væv med kun de modne miRNA blive opdaget. Men RT-qPCR omfatter flere forberedende trin (RNA-ekstraktion, revers transkription, Forforstærkning), hvori teknisk variation kan indføres, og derudover ordentlig normalisering er vigtigt at sikre reproducerbare resultater.

ISH teknik giver flere fordele , herunder evnen til at visualisere den cellulære lokalisering af de undersøgte miRNA foruden ekspressionsniveauet. Den kvantitative ISH metode kræver afsnit tykkelse standardiseret, fordi de kvantitative skøn ikke normaliseres mod en referencestandard. Andre forberedende skridt, der kan introducere nogle tekniske variation omfatter proteolytisk forbehandling samt væv folder og løsrivelse. Desuden ISH er en mere arbejdskrævende metode ikke egnet til alle laboratorier, og data fortolkning kræver specialiseret personale

I den foreliggende undersøgelse var det muligt at visualisere den cellulære lokalisering af de undersøgte miRNA, og det tilsvarende ISH signal tilladt til fokus på de relevante celler i analyse ISH data. For miRNA-125b kunne vi udelader det stærke ISH signal danne enteriske neuroner ved beregning af ICC. For RT-qPCR, den samme indstilling er ikke tilgængelig, og miRNA-125b fra enteriske neuroner er en del af den målte udtryk niveau. Da de enteriske neuroner er til stede uanset cancer, der forlader dem ud af analysen ville være det mest præcise ting at gøre. I så fald, RT-qPCR herunder miRNA-125b fra enteriske neuroner ville give en forudindtaget skøn, og ISH vil sandsynligvis give et mere korrekt resultat. Dette skal afvejes med tabet af sager på ISH analyser skyldes foldet eller tabt væv. Således blev flere tilfælde faktisk tabt for alle de analyserede miRNA, sandsynligvis på grund af fejlagtige fiksering af tumorerne.

For alle miRNA ICC

middelværdi var højere end ICC

single. En lav ICC værdi kunne forklares som en høj måling støj, mens en høj ICC værdi angiver mindre måling støj. Det faktum, at ICC

middelværdi blev højere end ICC

single tyder på, at samle alle tre prøver reducerer støjmåling, men kun én tilgængelig biopsi er ofte det scenario i klinisk praksis.

Under henvisning til ICCS beregnet her, var det ikke muligt at konkludere, hvilken af ​​de to teknikker, RT-qPCR eller ISH, giver de mest repræsentative udtryk skøn og dermed omfatter tumor heterogenitet. Men for klinisk anvendelse af en metode, praktiske faktorer som antallet af biopsier nødvendige for at behandle, tilgængelighed og omkostninger af metoden, og fortolkning af resultaterne er faktisk vigtige faktorer

Afslutningsvis bør overvejes intratumoral heterogenitet i analysen af ​​miRNA som biomarkører, og miRNA analyse bør derfor udføres på alle tilgængelige prøver. En prøve kan i nogle indstillinger være tilstrækkeligt som angivet for miRNA-21 og miRNA-31 i den aktuelle undersøgelse. Den ringe korrelation mellem RT-qPCR og ISH tyder på, at resultater opnået ved de to teknikker bør sammenlignes med forsigtighed. I en klinisk indstilling, synes RT-qPCR foretrække som en nem metode til at få reproducerbare resultater, men det kan ikke udelukkes, at ISH metoden kan give mere klinisk relevant udtryk skøn.

Støtte Information

S1 Fig . Endetarmskræft eksemplar til miRNA udtryk analyser.

(A) fra den overfladiske /luminale del af tumoren, blev tre forskellige steder (røde pile) valgt til undersøgelse. (B) Sektionerne for RT-qPCR og ISH blev skåret på samme tid som tilstødende sektioner. Regionen Interest (ROI) blev omringet på en udskrift af det digitale hele slide billede af HE-sektionen. ROI blev overført til de digitale hele lysbilleder af ISH-billeder og til de afsnit skåret for RT-qPCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0156919.s001

(TIF)

S2 Fig. Region of Interest (ROI) Hotel (A) På en udskrift af H . E farvede sektion, ROI var præget af patologen.